氯化锂诱变蛹虫草菌株液体发酵富集微量元素锌

王 陶,储渊明,陈宏伟,李 文*,高明侠,董玉玮,李同祥,张传丽

(徐州工程学院 江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室,江苏 徐州 221111)

摘 要:为更好地开发蛹虫草资源,以蛹虫草为富锌载体,进行发酵富锌培养条件优化,选择最佳质量分数的LiCl诱变蛹虫草,通过火焰原子吸收法检测诱变前后菌丝体中锌元素的含量。结果表明:蛹虫草富锌的最优碳源为蔗糖,质量分数为3%,最优氮源为蛋白胨,质量分数为3%,最佳培养时间为6 d,最佳接种量为5%,最佳装液量为100 mL/250 mL,培养基中添加的最佳ZnSO 4质量浓度为100 µg/mL,此时,富锌率为18.54%。LiCl的最佳诱变条件为:LiCl质量分数0.15%。选育出富锌较高菌株5株,最高富锌率达24.68%,比出发菌株提高了近42%,具有广阔的应用前景。

关键词:蛹虫草;微量元素;锌;富集;LiCl诱变

蛹虫草(C ordyc eps militaris)又称北冬虫夏草、北虫草,属真菌门、子囊菌亚门、核菌纲、麦角菌目、麦角菌科、虫草属,是昆虫的蛹感染虫草菌后形成的虫与真菌的复合体,由子座与菌核两部分组成 [1-5]。蛹虫草含有虫草素、腺苷、多糖、虫草酸、超氧化物歧化酶以及矿物质元素等多种生理活性物质 [6-9],含有谷氨酸、天冬氨酸等18 种氨基酸,还有麦角甾醇、麦角甾醇过氧化物、β-谷甾醇、胆固醇、菜油甾醇、胡萝卜苷、二氢菜籽甾醇和黄豆醇等9 种甾醇及其衍生物 [10-12],药用与营养成分的含量与冬虫夏草一样甚至更高,而药效、药理与野生虫草菌种相似。蛹虫草具有预防治疗脑血栓、脑溢血、肾功能衰竭;抗病毒、抗菌、明显抑制肿瘤生长、干扰人体RNA及DNA的合成的作用 [1 3-14];提高免疫力,延缓衰老;抗癌、减毒等功效,是冬虫夏草的理想代用品 [15-17]。因此,高效培养优质蛹虫草及提高其所含的活性成分具有重要的经济价值,已经成为研究的热点。

微量元素锌是一种生命元素,参与多种酶的合成与激活,与人体内80多种酶的代谢过程有关。由于锌参与生物体很多种酶和功能蛋白的组成,并且同许多基础性生理活动密切相关,是许多如金属硫蛋白、核蛋白、受体等功能蛋白的组成成分,可直接参与合成核酸及蛋白质,对细胞的分裂生长作用重大。锌的缺失会影响人体的各系统,所以锌被人们誉为“生命之花” [18-19]。利用真菌较强的富集功能,将无机锌与蛋白、糖等物质结合成有机锌蛋白和锌多糖等大分子活性物质,有利于有机锌的免疫功能和食药用菌的抗病功能的发挥,灵芝、香菇、金针菇等具有较强的富锌能力 [20-23],蛹虫草对微量元素具有明显的富集作用 [24-25],若能加强其富集微量元素锌的能力,则可以更好地开发虫草资源,使其发挥蛹虫草和微量元素的双重功能。

本实验拟对蛹虫草菌株微量元素锌的富集条件进行优化,采用LiCl诱变蛹虫草,从中筛选富锌含量较高的虫草菌株,为蛹虫草资源进一步开发利用提供一定参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蛹虫草(C ordyceps m ilitaris)13号菌株为徐州工程学院食品工程学院实验室保存。

ZnSO 4(分析纯) 国药集团化学试剂有限公司;其他试剂均为分析纯。

1.2 培养基

斜面培养基为萨氏培养基(Sabouraud dextrose agar with yeast extract,SDAY):葡萄糖4%(质量分数,下同)、蛋白胨1%、酵母浸膏1%、琼脂2%。

种子培养基为萨氏液体培养基(Sabouraud dextrose with yeast extract,SDY):去掉琼脂的SDAY培养基。

发酵培养基:蛋白胨3%、酵母浸膏3%、蔗糖3%、磷酸二氢钾0.1%、无水氯化钙0.01%、七水硫酸镁0.05%、ZnSO 4100 µg/mL。

诱变培养基:去皮马铃薯15%、葡萄糖2%、蛋白胨0.5%、磷酸氢二钾0.1%、硫酸镁0.1%、Zn SO 40.1%、琼脂3%,LiCl质量分数分别为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%。

1.3 仪器与设备

XT-99 00智能微波消解仪 上海新拓微波溶样测试技术有限公司;LGJ-18A型冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂有限公司;TAS-99 0原子吸收分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司;HYG旋式恒温调速摇瓶柜 上海欣蕊自动化设备有限公司;DHG-9140型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司;HH.B11.600-S-Ⅱ型电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂。

1.4 方法

1.4.1 培养方法

斜面培养为将接种后的斜面于2 2 ℃条件下培养7 d;种子培养为22 ℃、120 r/min条件下培养3 d,装液量100 mL/250 mL;发酵培养为接种量5%,22 ℃条件下120 r/min振荡培养5~6 d。

1.4.2 微量元素锌的富集方法

1.4.2.1 单因素试验

富锌发酵基本条件:蔗糖3%(质量分数,下同)、蛋白胨3%、发酵时间7 d、装液量100 mL/250 mL、接种量5%、ZnSO 4质量浓度100 µg/mL。实验过程中运用控制变量法,逐一改变各因素中某一自变量而固定其他参数条件不改变,由此可以更好地观察比较各个单因素对锌富集的影响,单因素的设置如下。

1)碳源种类对蛹虫草富集锌的影响:按富锌发酵基本条件,分别考察3%的葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、糊精、淀粉对蛹虫草富锌的影响。

2)氮源种类对蛹虫草富集锌的影响:按富锌发酵基本条件,分别考察3%的大豆粉、玉米粉、尿素、蛋白胨、硝酸钾、硫酸铵对蛹虫草富锌的影响。

3)发酵时间对蛹虫草富集锌的影响:按富锌发酵基本条件,分别考察发酵时间为5、6、7、8、9、10 d对蛹虫草富锌的影响。

4)装液量对蛹虫草富集锌的影响:按富锌发酵基本条件,分别考察5 0、7 5、1 0 0、1 2 5、1 5 0、175 mL/250 mL装液量对蛹虫草富锌的影响。

5)接种量对蛹虫草富集锌的影响:按富锌发酵基本条件,分别考察3%、4%、5%、6%、7%、8%的接种量对蛹虫草富锌的影响。

6)Zn SO 4质量浓度对蛹虫草富集锌的影响:按富锌发酵基本条件,分别考察50、80、90、100、110、120、200、300 µg/mL的ZnSO 4对蛹虫草富锌的影响。

1.4.2.2 正交试验

在前期单因素试验的基础上,通过L 9(3 4)正交试验考察碳源种类、氮源种类、接种量和ZnSO 4质量浓度对蛹虫草富集微量元素锌的相互影响,并确定蛹虫草菌丝体富集微量元素锌的最佳工艺参数。

1.4.3 诱变方法

1.4.3.1 样品的前期准备

取培养活化好的斜面,用10 mL生理盐水洗脱斜面孢子,充分摇匀制备成菌悬液。

1.4.3.2 LiCl诱变选育

将菌悬液稀释至10 -6、10 -7后用涂布棒将0.1 mL菌悬液均匀涂于直径为90 mm未加入LiCl的诱变培养基平板上,每个梯度做3 个平行。于22 ℃培养箱中培养5~7 d,计数。

配制LiCl质量分数分别为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%的诱变培养基,将菌悬液稀释至10 -6、10 -7后用涂布棒将0.1 mL菌悬液分别均匀涂于直径为90 mm不同LiCl质量分数的诱变培养基平板上,每个梯度做3 个平行。于22 ℃培养箱中培养5~15 d,计数。将生长迅速且最大的单菌落挑到SDAY斜面上培养7 d,种子液中培养5 d,再接种于正交优化后的最佳富锌发酵培养基中培养7 d。测定锌的含量,筛选出富锌率较高的蛹虫草菌株。

1.4.4 分析方法

1.4.4.1 生物量的测定

将发酵液4 000 r/min离心30 min。倒去上清液,纯水洗涤4 次后4 000 r/min离心30 min,将得到的菌丝体放在培养皿中,放在-20 ℃的冰箱里预冷12 h,冷冻24 h后进行冷冻干燥,测菌丝体生物量。

1.4.4.2 无机锌的去除

将透析袋剪成6~8 cm,放入沸水中煮沸5~10 min。用玻璃棒捞出,放入蒸馏水中清洗干净。将称量好的1 g低温干燥至恒质量的样品,加入蒸馏水中,用移液枪移至透析袋内,两头用夹子夹好。将透析袋置于超纯水中透析36 h,每隔12 h换一次水,去除菌丝体表面的无机锌。

1.4.4.3 微波消解

表1 消解条件
Table 1 Microwave digestion conditions

阶段压强/kPa时间/s第1阶段2 60第2阶段5 60第3阶段10 90第4阶段15 120第5阶段20 30

将透析好的菌丝体放在微波消解罐中,移取7 mL浓硝酸滴入其中溶解,放入微波消解仪中消解。消解仪设定的条件如表1所示。消解完后用超纯水将所得的消解液定容至50 mL。

1.4.4.4 锌含量的测定

采用火焰原子吸收法,将定容好的样品吸取10 µL加入石墨炉中,打开原子吸收仪器,按操作步骤调整仪器,灯设定为锌灯,工作参数为:波长213.9 nm、光谱带宽0.4 nm、电流3 mA、乙炔压力0.05 MPa、流量1 800 mL/min。

1.4.4.5 富锌率与生物量的计算

锌标准曲线:用移液管分别移取1 mg/m L锌标液于25 mL的容量瓶中,配制锌质量浓度分别为0、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 µg/mL。然后用超纯水定容至25 mL。用火焰原子吸收法测定各质量浓度的吸光度,以锌质量浓度为横坐标,以吸光度为纵坐标绘制标准曲线(Y=0.213X+0.014,R=0.995 2),在锌标液质量浓度为0~3 µg/mL具有良好的线性关系。

富锌率和生物量分别按公式(1)和(2)计算。

式中:a为富锌菌丝锌含量/(μg/g);a 0为空白菌丝锌含量((90.804±0.139)μg/g);m为富锌菌丝干质量/(g/100 mL);b为培养基的加锌量/(μg/100 mL)。

式中:x 1为不同发酵条件下菌株生物量/(g/100 mL);x 0为初始条件下菌株生物量/(g/100 mL)。

2 结果与分析

2.1 发酵培养条件对蛹虫草富锌能力的影响

2.1.1 碳源对锌富集的影响

表2 碳源种类对菌丝体生物量和富锌率的影响
Table 2 Effect of different carbon sources on biomass and zinc enrichment of C. militaris mycelia

碳源生物量/生物量Zn含量/富锌率/%种类(g/100 mL)变化率/%(µg/g)葡萄糖1.090±0.007-9.77 119.588±0.214 11.96乳糖1.185±0.211-1.90 120.773±0.126 12.08麦芽糖1.213±0.081 0.41 55.186±0.091 5.52蔗糖1.358±0.124 12.42 143.374±0.012 14.94淀粉1.218±0.060 0.83 2.991±0.017 0.30糊精1.095±0.125-9.35 129.186±0.008 12.92

由表2可知,加入碳源为麦芽糖、蔗糖、淀粉时,促进蛹虫草生长,当加入碳源为蔗糖时,蛹虫草菌丝体的生物量最大为1.358 g/100 mL,并且在加入碳源为蔗糖时,富锌率最大为14.94%。说明碳源种类为蔗糖时,蛹虫草生长比较好,蛹虫草富锌能力强,因此蔗糖为最优碳源种类。

2.1.2 氮源对富集锌的影响

表3 氮源种类对蛹虫草生物量和富锌率的影响
Table 3 Effect of different nitrogen sources on biomass and zinc enrichment of C. militaris mycelia

氮源生物量/生物量Zn含量/富锌率/%种类(g/100 mL)变化率/%(µg/g)大豆粉1.311±0.113 8.53 117.153±1.210 11.72玉米粉1.053±0.051-12.83 69.046±0.235 6.91尿素0.746±0.214-38.25 86.871±0.087 8.69蛋白胨1.249±0.203 3.39 152.459±1.034 15.25硝酸钾0.725±0.04-39.98 54.152±0.036 5.42硫酸铵0.761±0.148-37.00 32.994±0.217 3.30

氮源分有机氮源和无机氮源,根据表3的趋势可知蛹虫草对有机氮源的吸收能力更强。同时,有机氮促进蛹虫草菌体生长,有机氮中,大豆粉为氮源时生物量最大,蛋白胨次之,但是蛋白胨的富锌能力大于大豆粉。由表3可知,当加入氮源为蛋白胨时,蛹虫草菌丝体富锌率最大为15.25%。由此说明氮源种类为蛋白胨时,蛹虫草富锌的能力强,因此蛋白胨为最优氮源种类。

2.1.3 发酵培养时间对锌富集的影响

表4 发酵时间对菌丝体生物量和富锌量的影响
Table 4 Effects of different fermentation times on biomass and zinc enriched rate of mycelia

时间/d生物量/生物量Zn含量/富锌率/%(g/100 mL)变化率/%(µg/g)5 1.375±0.032 13.82 137.077±1.035 13.71 6 2.150±0.153 77.98 165.354±0.035 16.54 7 1.733±0.021 43.46 163.712±0.024 16.37 8 2.008±0.045 66.23 162.391±0.159 16.24 9 2.054±0.128 70.03 162.154±0.324 16.22 10 1.054±0.062-12.75 83.114±0.038 8.31

由表4可知,当培养时间6 d时,蛹虫草菌丝体富锌率最大为16.54%,生物量也最大。培养时间越长,由于菌丝体自溶,生物量逐渐变小。由此说明培养时间为6 d时,蛹虫草富锌能力强,选取6 d为最佳培养时间。但培养时间对蛹虫草富锌率总体影响不大,正交设计时不作为影响因素。

2.1.4 接种量对锌富集的影响

表5 接种量对菌丝体生物量和富锌量的影响
Table 5 Effect of different inoculum quantities on biomass and zinc enrichment of C. militaris mycelia

接种量/%生物量/生物量Zn含量/富锌率/%(g/100 mL)变化率/%(µg/g)3 1.055±0.024-12.67 106.738±0.147 10.67 4 1.052±0.108-12.91 132.912±0.258 13.29 5 2.678±0.039 121.69 167.932±0.035 16.79 6 1.411±0.021 16.80 145.038±0.028 14.50 7 1.340±0.065 10.93 99.059±0.097 9.91 8 1.753±0.231 45.12 98.167±0.107 9.82

由表5可知,在接种量为5%时,蛹虫草菌丝体的生物量最大,为2.678 g/100 mL,富锌率为16.79%。可能是当接种量变大时,培养基的营养消耗变大,溶氧能力不足,并且生长空间变小,所以菌丝体的生物量和富锌能力在接种量超过5%后明显下降。由此说明接种量为5%时,蛹虫草富锌能力强,因此5%为最优接种量。

2.1.5 装液量对锌富集的影响

表6 装液量对菌丝体生物量和富锌量的影响
Table 6 Effect of different medium volumes on biomass and zinc enrichment of C. militaris mycelia

装液量/生物量/生物量Zn含量/富锌率/%(mL/250 mL)(g/100 mL)变化率/%(µg/g)50 0.950±0.002-21.36 74.594±0.103 7.46 75 1.584±0.074 31.13 120.180±0.269 12.02 100 2.149±0.064 77.90 127.309±0.101 12.73 125 2.051±0.142 69.78 120.577±0.243 12.06 150 1.590±0.086 31.62 119.913±0.052 11.99 175 1.257±0.030 4.06 118.106±0.114 11.81

由表6可知,在装液量为100 mL/250 mL时,蛹虫草菌丝体的生物量最大为2.149 g/100 mL,富锌率最大为12.73%,因此100 mL为最优装液量。但装液量对富锌率总体影响不大,因此在正交设计时不作为影响因素。

2.1.6 ZnSO 4质量浓度对锌富集的影响

表7 ZnSO 4质量浓度对菌丝体生物量和富锌量的影响
Table 7 Effect of different initial ZnSO 4concentrations on biomass and zinc enrichment of C. militaris mycelia

ZnSO 4质量浓度/生物量/生物量Zn含量/富锌率/%(µg/mL)(g/100 mL)变化率/%(µg/g)0 1.773±0.022 46.77 4.556±0.025 0.46 50 2.701±0.034 123.59 9.081±0.219 0.91 80 2.751±0.102 127.73 9.776±0.033 0.98 90 2.958±0.332 144.87 123.836±0.166 12.38 100 3.260±0.044 169.87 154.854±0.187 15.49 110 3.806±0.115 215.07 162.084±0.263 16.21 120 3.544±0.088 193.38 145.160±0.121 14.52 200 0.857±0.097-29.06 163.631±0.093 13.36 300 2.988±0.109 147.35 116.182±0.236 11.62

由表7可知,在加入的Zn SO 4质量浓度为110 µg/mL时,蛹虫草菌丝体的生物量最大为3.806 g/100 mL,富锌能力较强,富锌率为16.21%。大于110 µg/mL后富锌能力下降。基本培养基中加入ZnSO 4质量浓度过低,蛹虫草菌株富锌还达不到饱和,而加入的ZnSO 4质量浓度过高,则抑制了蛹虫草的生长,富锌能力有所降低。

2.1.7 正交试验结果

结合单因素试验,选择碳源种类、氮源种类、接种量以及ZnSO 4质量浓度4 个对微量元素锌富集影响较大的因素,进行正交试验,因素水平及结果如表8所示。

表8 正交试验结果与分析
Table 8 Orthogonal array design with experiment results of zinc enrichment

试验号A蔗糖质量B蛋白胨C接D ZnSO 4质量富锌率/%分数/%质量分数/%种量/%浓度/(µg/mL)1 1(2)1(2)1(4)1(100)16.17 2 1 2(3)2(5)2(110)17.23 3 1 3(4)3(6)3(120)12.58 4 2(3)1 2 3 16.13 5 2 2 3 1 16.35 6 2 3 1 2 15.57 7 3(4)1 3 2 11.23 8 3 2 1 3 12.36 9 3 3 2 1 13.45 k 115.327 14.510 14.700 15.323 k 216.017 15.313 16.603 14.677 k 312.347 13.867 13.387 13.690 R 3.670 1.446 2.216 1.633因素主次A>C>D>B最优方案A 2C 2D 1B 2

由表8可知,各因素对微量元素锌富集的影响次序为A>C>D>B,即蔗糖质量分数>接种量>ZnSO 4质量浓度>蛋白胨质量分数,其最优方案为A 2C 2D 1B 2,此时最佳蔗糖质量分数为3%,最佳接种量为5%,最佳Zn SO 4质量浓度浓度为100 µg/mL,最佳蛋白胨质量分数为3%。

按照正交试验优选组合A 2C 2D 1B 2和试验设计中的最优组合A 1C 2D 2B 2,平行3 次,进行验证,A 2C 2D 1B 2和A 1C 2D 2B 2的富锌率均值分别为18.54%、17.12%,有显著性差异(P<0.05),因此,最优提取工艺为A 2C 2D 1B 2。在最优富锌培养条件下,促进蛹虫草菌丝体的生长同时,提高了菌丝体中锌的含量。

2.2 富锌蛹虫草菌株LiCl诱变选育

2.2.1 LiCl对蛹虫草菌丝体生长周期的影响

将制得的菌悬液稀释涂布于未加LiCl的空白培养基平板上及LiCl质量分数分别为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%的诱变培养基平板上,22 ℃条件下培养观察15 d。菌株生长快慢情况见表9。

表9 不同LiCl质量分数对菌体生长周期的影响
Table 9 Effect of different LiCl concentrations on the growth cycle of C. militaris mycelia

周期LiCl质量分数/% 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35出现单菌落/d 3 3 4 4 4 5 5无出现孢子/d 7 8 9 9 9 10 11无完全成熟/d 8 10 11 11 11 13 14无

由表9可以看出,未经诱变处理的蛹虫草菌丝体生长周期约为7 d,经诱变处理的蛹虫草菌丝体总体呈随LiCl质量分数的增大,生长周期变长的趋势。当LiCl质量分数大于0.30%时,筛选平板上几乎没有蛹虫草单菌落出现。可能由于诱变剂LiCl对菌丝体造成了一定的损伤,损伤程度和LiCl的浓度呈正相关,且蛹虫草菌丝体生长过程中LiCl都在发挥诱变作用,因此,诱变剂LiCl质量分数越高,菌丝体的生长速率越慢,剂量过大,导致菌丝体死亡,无法生长。

图1 LiCl质量分数对存活率的影响
Fig. 1 Effect of LiCl concentrations on survival rate of C. militaris

2.2.2 诱变剂量对存活率的影响由图1可知,与原始菌株相比,不同LiCl质量分数诱变下,菌丝体的存活率依次为85.7%、61.9%、28.6%、

14.3 %、9.4%、4.8%。随LiCl质量分数的升高,菌丝体存活率呈减小趋势,当诱变剂LiCl的质量浓度达到0.30%之后,菌体基本不存活。其中LiCl质量分数为0.15%时,存活率为28.6%,依据诱变育种理论 [26-27],此时发生正向突变的概率最高。因此,初步确定LiCl的最佳诱变质量分数为0.15%。

2.2.3 菌落外表形态的差异

图2 菌落外形特征
Fig. 2 Morphological characteristics of colonies

图2 为初始菌株与分别经0.05%和0.10%的LiCl诱变后,培养7 d时单菌落形态。随时间的延长,并不是所有的平板都长单菌落,而且随着LiCl质量分数升高,单菌落的直径变小。

2.2.4 富锌蛹虫草菌株的筛选

通过在0.15% LiCl最佳诱变剂量诱变蛹虫草菌株,从后代中筛选出菌落直径较大菌株近100 个,在正交试验优化后的富锌发酵培养基中培养,测定其锌的富集率。由表10可知,富锌能力较强的菌株有5、7、9、15、25号菌株,这些菌株长势较好,生物量比出发菌株生物量高出近1 倍。7号菌株富锌率最高,达到24.68%,比对照菌株的富锌率提高了近42%。对富锌能力最强的7号菌株进行了遗传稳定性实验,5代后,Zn含量均在240 µg/g左右,富锌率在24%左右,比对照提高了近38%,该菌株的遗传稳定性较好,可以进行下一步研究。

表10 LiCl诱变后菌丝体的生物量、富锌量和富锌率
Table 10 Biomass and zinc enrichment of C. militaris mycelia before and after LiCl mutagenesis

菌株号生物量/生物量Zn含量/富锌率/%(g/100 mL)变化率%(µg/g)对照2.372±0.231 96.36 173.848±0.254 17.38 3 1.612±0.001 33.44 111.315±0.367 11.13 5 3.424±0.027 183.44 194.397±0.088 19.44 7 4.440±0.130 267.55 246.800±0.244 24.68 9 2.989±0.028 147.43 189.971±0.228 19.00 15 2.927±0.009 142.30 183.261±0.069 18.33 20 0.742±0.235-38.58 15.094±0.564 1.51 25 2.718±0.118 125.00 175.061±0.259 17.51

3 结 论

以蛹虫草为材料研究其富锌条件,并采用LiCl诱变,筛选富锌率提高的菌株。进行单因素试验,在培养基中加入不同质量浓度的Zn SO 4、碳源、氮源;改变培养基的装液量、接种量、培养时间,发酵培养蛹虫草菌丝体,测得不同条件下蛹虫草菌株的富锌能力。从而得到最优碳源是蔗糖,最优氮源是蛋白胨,最佳培养时间是6 d,最佳装液量是100 mL/250 mL,最佳接种量是5%,最佳ZnSO 4质量浓度是110 µg/mL,正交试验确定最优方案:蔗糖质量分数3%、接种量浓度5%、ZnSO 4质量浓度100 µg/mL、蛋白胨质量分数3%,此时富锌率可达18.54%。

通过不同诱变剂量对蛹虫草菌株生长周期、存活率及诱变菌株富锌能力的影响研究,可得0.15% LiCl下蛹虫草菌丝体的生长周期约为9 d,其存活率为28.6%,并检测到富锌能力较高的突变株,最高富锌率达24.68%,富锌能力比初始菌株提高42%。陈宏伟等 [28]进行了蛹虫草深层发酵富集微量元素锌的研究,得到了锌转化率最佳条件,有机锌率转化最高为18.4%,王燕等 [29]对羊肚菌菌丝体液体培养富锌条件进行了研究,总富锌率可达23.20%。本研究选育得到高效富锌蛹虫草菌株生长性能较好,富锌能力强,为蛹虫草的综合开发利用提供了一定参考数据。但由于育种方向单一性的特点,决定了本次育种的目标是提高微量元素锌的富集能力,下一步研究可以以此菌株为出发菌株,通过物理、化学等诱变方式进一步提高蛹虫草菌株生物活性成分的含量,同时,微量元素除了锌外,还有硒、锗等,若能把多种微量元素富集于蛹虫草中,发挥蛹虫草和多种微量元素的生理功效,有待进一步研究。

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Zinc Enrichment of Cordyceps militaris Cultured in Liquid Medium: Optimization of Medium Components and Culture Conditions and Strain Improvement by LiCl Mutagenesis

WANG Tao, CHU Yuanming, CHEN Hongwei, LI Wen*, GAO Mingxia, DONG Yuwei, LI Tongxiang, ZHANG Chuanli
(Jiangsu Key Construction Laboratory of Food Resource Development and Quality Safe, Xuzhou University of Technology, Xuzhou 221111, China)

Abstract:In order to make better use of Cordyceps militaris, the optimization of medium components and culture conditions was investigated for improved zinc enrichment of C. militaris in liquid-sate fermentation. Meanwhile, the optimal LiCl concentration was chosen to mutate C. militaris. Finally, zinc concentrations in the mycelia of the parental and mutant strains were determined by graphite furnace atomic absorption spectrometry. Results showed that the optimal culture conditions for C. militaris to enrich zinc were as follows: 3% sucrose as the best carbon source, 3% peptone as the best nitrogen source, fermentation time, 6 d; inoculum size, 5%; medium volume, 100 mL/250 mL; and initial ZnSO 4concentration, 100 µg/mL. Under these conditions, the rate of zinc enrichment was 18.54%. The LiCl concentration of 0.15% was optimal for the mutation of C. militaris. Five strains with higher zinc enrichment ability were obtained, giving the highest rate of zinc enrichment of 24.68%, which was increased by nearly 42% as compared with that of the original strain. Therefore the mutants would have promising applications for industrial production.

Key words:Cordyceps militaris; microelement; zinc; enrichment; LiCl mutagenesis

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201706012

中图分类号:Q939.96;TS05

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)06-0074-07

引文格式:

王陶, 储渊明, 陈宏伟, 等. 氯化锂诱变蛹虫草菌株液体发酵富集微量元素锌[J]. 食品科学, 2017, 38(6): 74-80.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201706012. http://www.spkx.net.cn

WANG Tao, CHU Yuanming, CHEN Hongwei, et al. Zinc enrichment of Cordyceps militaris cultured in liquid medium: optimization of medium components and culture conditions and strain improvement by LiCl mutagenesis[J]. Food Science, 2017, 38(6): 74-80. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201706012. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-06-16

基金项目:国家自然科学基金面上项目(81273004;31270577);江苏省青蓝工程优秀骨干教师培养对象人才项目;

江苏省产学研联合创新基金项目(BY2014031);江苏省高校自然科学研究面上项目(15KJD550002);

江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室开放课题(SPKF201412);

徐州工程学院校级重点培育项目(XKY2015104);徐州工程学院校级培育项目(XKY2014214)

作者简介:王陶(1976—),男,副教授,博士,研究方向为离子束生物工程学和资源微生物学。E-mail:wangtaohf@126.com

*通信作者:李文(1982—),女,讲师,博士,研究方向为食品生物技术。E-mail:wenlisony@126.com