大豆蛋白-溶血磷脂O/W型复合乳液的乳化特性

李秋慧,王中江,李佳妮,隋晓楠,齐宝坤,江连洲,李 杨*

(东北农业大学食品学院,黑龙江 哈尔滨 150030)

摘 要:针对大豆溶血磷脂添加量对大豆分离蛋白-溶血磷脂复合乳化体系乳化特性的影响进行探究。对复合乳化体系分别进行了界面蛋白吸附量、界面张力、乳化活性、乳化稳定性、粒径分布、Zeta电位的测定,并采用光学显微镜对乳液中油滴分布及微观结构变化进行观察。结果表明:随着溶血磷脂添加量的增加,乳化特性指标均基本呈现先升高后降低的趋势。其中,当溶血磷脂添加量为10%时,乳液的乳化特性表现最佳,这表明添加适量溶血磷脂会促进其与大豆分离蛋白的相互作用,降低界面张力,在油-水界面上形成较稳定的界面膜,形成稳定的复合乳状液。

关键词:大豆分离蛋白;溶血磷脂;乳化特性

大豆分离蛋白(soybean protein isolate,SPI)因其具有多种功能特性而在食品加工中得以广泛应用,其中较为重要的功能就是乳化特性,食品加工过程中常常通过添加SPI提高产品的乳化稳定性等,然而单一的天然SPI由于其结构的限制以及其易变性等缺点使其不能很好地满足食品工业对乳化剂的多重需求 [1-2]。大豆溶血磷脂(lysophospholipids,LPC)是既具有普通磷脂的双亲两性结构,又由于非极性基团的减少而增强了亲水性能的一种纯天然、高营养乳化剂。因此,LPC除了拥有普通磷脂的优良乳化特性以外,更在一定程度上改善了由于亲水亲油平衡(hydrophile lipophilic balance,HLB)值偏低导致普通磷脂应用范围受限的状况 [3]。国内有研究表明由于磷脂及LPC结构中同时具有亲水基团和亲油基团,可以添加到蛋白当中增强食品的乳化活性及乳化稳定性 [4-7]。同时,国外有研究表明磷脂经磷脂酶A 2酶解后所产生的LPC可以与乳中蛋白通过疏水及静电作用结合,使咖啡乳等乳状液表现出更好的乳化特性,二者形成的复合体系更有利于维持乳液的乳化稳定性,延长货架期 [8-10]。但目前的研究对LPC与蛋白的添加比例及稳定性影响机理尚不明确,且在此问题上的研究仍较少。因此,本研究在前期研究基础上采用磷脂酶A 2自制LPC,再将一定量LPC与SPI共建复合乳化体系,通过对复合体系的界面蛋白含量、界面张力、乳化活性、乳化稳定性、流体动力学半径、Zeta电位等乳化性质进行测定,同时通过光学显微镜对乳状液的微观结构进行观察,解析LPC添加量对SPI乳状液乳化特性的影响机理,为天然复合乳液的工业生产应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脱脂豆粕 哈尔滨高科技股份有限公司;LPC东北农业大学食品学院粮油加工实验室自制;磷脂酶A 2(1 100 U/mL) 丹麦诺维信生物技术有限公司;十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)、Tris-HCl美国Sigma公司;磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、盐酸、氢氧化钠等化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

磁力搅拌器 广州仪科实验仪器有限公司;T18 basic高速乳化均质机 德国IKA公司;TU-1800紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;ZetaPALS-Zeta电位仪 美国布鲁克海文仪器公司;Mastersize 2000激光粒度分析仪 英国马尔文公司;Allegra64R台式高速冷冻离心机 美国贝克曼公司;IX71倒置显微镜 日本奥林巴斯公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI的制备

参考Molina等 [11]的方法并稍加修改,按照质量比1∶10将脱脂豆粕与水混合,加入浓度为2 mol/L NaOH溶液调节pH值至8.0,磁力搅拌1 h后在4 000×g室温条件下离心30 min。去除残渣取上清液,加入1 mol/L的HCl溶液调节pH值至4.5,搅拌1 h后室温条件下静置15 min。在6 000×g、室温条件下离心30 min,取沉淀水洗3 次,最后将沉淀溶于水中加入1 mol/L NaOH溶液调节pH值至7,再次在6 000×g室温条件下离心30 min滤去不溶物,得蛋白质溶液,将蛋白质溶液进行冷冻干燥得SPI粉末,经凯式定氮仪测得蛋白含量为90.08%(氮溶解指数按照6.25计算)。

1.3.2 LPC的制备

参考潘丽等 [12]的方法并稍加修改,准确称取75 mg大豆粉末磷脂于250 mL锥形瓶中,加入75 mL、pH 7.2的Tris-HCl缓冲溶液,然后加入磷脂酶A 2(V(酶)∶V(磷脂)=1∶20),再加入质量分数0.1% CaCl 2溶液,将其密封后置于水浴恒温振荡器中,30 ℃酶解反应8 h,反应完成后,90 ℃条件下灭酶30 min。然后加入冷丙酮,用玻璃棒搅拌脱脂后离心滤去上层清液,如此进行反复脱脂,将样品进行抽真空脱溶,溶液快速挥干即得LPC。

1.3.3 SPI-LPC乳状液的制备

参考李杨等 [5]的方法,精确称取100 mg SPI,分别加入质量分数为0%、5%、10%、15%、20%的LPC样品,溶解于30 mL浓度为0.1 mol/L pH 7.2的磷酸盐缓冲溶液中,在1 000 r/min、室温条件下搅拌溶液1 h。取9 mL搅拌均匀的SPI-LPC复合体系与3 mL葵花籽油混合搅拌,预乳化后倒入25 mL烧杯中,用高速乳化均质机在20 000 r/min条件下乳化1 min,制备乳液及空白对照样品。其中样品分别为 SPI、SPI-5 mg LPC乳液(SPI-5LPC)、SPI-10 mg LPC乳液(SPI-10LPC)、SPI-15 mg LPC乳液(SPI-15LPC)、SPI-20 mg LPC乳液(SPI-20LPC)。

1.3.4 界面蛋白吸附量的测定

参考Palazolo等 [13]的测定方法。乳液在室温条件下10 000×g离心30 min,用注射器将清液取出,测定清液中的蛋白质量浓度。乳液界面蛋白吸附量计算见公式(1):

式中:C initial和C aq分别是蛋白溶液质量浓度和乳液离心后清液中的蛋白质量浓度/(mg/mL);C 0是蛋白溶液经相同条件离心后(10 000×g,30 min)上清液中的蛋白质量浓度/(mg/mL)。每个样品重复3 次测定。

1.3.5 油-水界面张力的测定

油-水界面张力的测定参考Romero等 [14]的方法。精确称取SPI和LPC各90 mg,溶于9 mL的0.1 mol/L磷酸钠缓冲液中,室温条件下搅拌溶液(1 000 r/min,1 h),用注射器将溶液注射到样品管中,在通过细长针头吸取葵花籽油,将油样注入到样品管中,使用TVT1旋转滴界面张力仪测定,测定温度20 ℃。

1.3.6 乳液活性及乳化稳定性的测定

参考Comas等 [15]的方法。将均质的乳状液用0.1%的SDS溶液稀释到确定倍数,在500 nm波长处用紫外分光光度计测定吸光度,计算乳化活性指数(emulsifying activity index,EAI)。静置30 min后测定吸光度,计算乳化稳定性指数(emulsion stability index,ESI)。EAI、ESI计算见公式(2)、(3):

式中:N为稀释倍数(250);C为乳化液形成前蛋白质水溶液中蛋白质质量浓度/(g/mL);Φ为乳化液中油相体积分数;A 0为0 min时的吸光度;A 30为30 min时的吸光度。

1.3.7 流体动力学半径及其分布的测定

参考王金梅等 [16]的测定方法。采用动态光散射技术,利用Mastersize 2000激光粒度分析仪测定新鲜制备的乳状液的流体动力学半径及其分布,测定温度25 ℃。参数设置为:颗粒折射率1.520,颗粒吸收率0.001,分散剂为水,分散剂折射率1.330。实验采用D 4,3,即体积平均直径表征液滴粒度的大小,样品均质后立即测定,每个样品重复3 次。

1.3.8 Zeta电位的测定

参考Crudden [17]的方法,采用Zeta电位分析仪测定,乳液质量浓度为0.1 mg/mL,上样体积1 mL,测定温度25 ℃。重复测量6 次,计算平均值为测定值。

1.3.9 光学显微镜观察

乳液制备后,取一滴新鲜乳液样品放置于显微镜载物台上,用载玻片固定,用100 倍光学显微镜观察,用电荷耦合元件图像传感器获取照片,照片从连接到电脑的数字图像处理软件中获得。

1.4 数据统计分析

每个实验均重复3 次,采用ANOVA进行误差分析,并用Origin 8.5软件统计分析数据并作图。

2 结果与分析

2.1 LPC对界面蛋白吸附量的影响

图1 LPCLPC添加量对界面蛋白吸附量的影响
Fig.1 Effect of lysophospholipid addition on the interfacial adsorption of protein

界面蛋白吸附量表示界面吸附蛋白的覆盖率,它是界面性质的一个重要指标 [18]。有研究表明,LPC乳化活性大小与界面上乳化剂的吸附量有一定关联 [19]。由图1可知,随着LPC添加量的增加,体系中界面蛋白质吸附量呈现先增大后减少的趋势,其中SPI-10LPC体系中界面蛋白吸附量最多。Li Jufang等 [20]在研究大豆蛋白与磷脂相互作用时指出,磷脂与蛋白的相互作用可能是将蛋白结合到磷脂分子形成的胶束或囊泡中去,或者是磷脂中的磷脂酰胆碱形成的片层结构与SPI表面疏水区域结合形成蛋白-磷脂复合物,还有可能是磷脂取代界面上部分蛋白质形成磷脂和蛋白的混合界面层。由此结果结合分析可知,由于大豆蛋白会与LPC发生疏水相互作用,作用力的存在会使大豆蛋白更易吸附在油-水界面上,但由于LPC与大豆蛋白之间具有一定的结合常数,当更多LPC加入,LPC会部分替代界面上大豆蛋白的位置,导致界面蛋白含量的降低。

2.2 LPC对界面张力的影响

图2 LPC对界面张力的影响
Fig.2 Effect of lysophospholipid addition on interfacial tension

水油相间的界面张力通常在30~35 mN/m之间,这种高界面张力导致水油两相不相容使乳状液的稳定性较差,通常通过添加乳化剂来降低界面张力使乳化体系易于自发进行 [21]。界面张力是研究乳状液性质的重要基础数据,本实验采用的旋转液滴法是用于测量两种完全不互溶液体的界面张力随时间的变化,广泛应用于低界面张力的测定。

由图2可知,5 种乳化体系中油-水界面的界面张力在一定时间范围内均有所降低,乳液的界面张力稳定值相差不大,平衡值在3~5 mN/m之间。SPI-10LPC体系在同一时刻界面张力低于SPI-15LPC和SPI-5LPC体系;而SPI-15LPC和SPI-5LPC体系明显低于SPI和SPI-20LPC体系的界面张力。由此可知,LPC的加入可以降低SPI乳状液的界面张力,但加入量过多时反而会使界面张力有所上升。

造成上述结果可能是由于SPI-LPC的交互作用会降低界面的吸附能,吸引更多分子在界面上。在SPI-LPC复合乳化体系中,蛋白质分子比LPC分子优先吸附到界面上,蛋白质和LPC分子先后吸附到界面上,界面张力降低,直到界面张力达到平衡值 [22]。有研究表明蛋白-磷脂复合体系降低界面张力的能力与表面疏水性相关,疏水性的提高会增强界面的活性,进而使乳化剂更易吸附在油-水界面,能更好地降低界面张力 [23]。然而由于LPC较磷脂相比疏水基团减少,过多的LPC会替代界面上的蛋白导致界面吸附能力下降。这可能是造成SPI-15LPC和SPI-20LPC体系界面张力较高的主要原因。

图3 LPC对复合体系乳化活性及乳化稳定性的影响
Fig.3 Effect of lysophospholipid addition on emulsifying activity and emulsion stability

2.3 LPC对复合体系乳化活性及乳化稳定性的影响乳化活性及乳化稳定性是表征乳状液乳化特性及稳定状态的重要指标。乳化体系的乳化活性及乳化稳定性与界面蛋白吸附量和界面张力有关,界面张力越低乳化剂的乳化性能越高 [24]。在本研究中,由图2和图3对比可知界面张力平衡值与乳化活性呈负相关性。随着LPC的量的增加,乳化活性及稳定性指数先上升后下降,该趋势与界面蛋白吸附量的趋势相一致。其中,SPI-10LPC乳化体系具有最好EAI及ESI,分别为37.6 m 2/g和76 min,与SPI乳化体系相比分别提高25.3%和26.6%。其他3 种样品的乳化活性及稳定性较SPI组有所提高,但不如

SPI-10LPC组提高显著。由此可知,LPC添加量的不同对乳状液的乳化特性及乳化稳定性有一定的影响。这是由于LPC疏水基团的减少,亲水性增强,其通过与SPI的相互作用形成SPI-LPC复合体系,构成双亲性结构,使疏水性蛋白区域更好地包裹油滴,亲水性的磷脂头部更好地伸入水相当中,降低水油间的界面张力,使其乳化特性有所提高 [25]。当LPC添加过多时,LPC会替代界面上的部分蛋白,导致体系界面蛋白含量下降,界面张力上升,界面膜无法完全包裹油滴,使得乳状液乳化活性及稳定性反而有所下降 [26]

2.4 LPC对复合体系流体动力学粒径分布的影响

图4 LPC添加量对复合体系流体动力学粒径分布的影响
Fig.4 Effect of lysophospholipid addition on particle size distribution of emulsion systems

图5 LPC对复合体系D 44,,33的影响
Fig.5 Effect of lysophospholipid addition on D 4,3of emulsion systems

流体动力学粒径分布是能更好地评价乳化性的重要指标,本实验中采用动态光散射技术探究不同LPC添加量对SPI-LPC复合乳化体系的液滴分布情况及平均粒径的大小的影响。一般地,乳液中分散越均匀,油滴的体积平均粒径越小,表示乳液的乳化特性越好 [27]。由图4可知,SPI体系大致为单峰分布,出现在60~80 μm处,对于实验中的其他4 种乳液,在LPC添加量分别为5%、10%、15%的乳液样品中粒径分布的峰值较SPI样品均有向较小粒径方向移动的趋势,但当LPC添加量达到20%时,出现了显著的峰形变化,双峰分别出现在10~20 μm和100~150 μm,且峰值与SPI样品相比出现了向较大粒径方向移动现象,即在一定范围内,磷脂质量分数越大,乳液油滴粒径在较小的粒径范围内分布,但质量分数过高会产生不利影响。

相应地,乳液油滴的D 4,3也在一定质量分数下随LPC质量分数的增大呈现先减小后增大的趋势,对于SPI-5LPC、SPI-10LPC和SPI-15LPC乳化体系来说,乳液的体积平均粒径均显著小于未添加磷脂的大豆蛋白乳液,且三者的粒径分布趋势较为相似。这说明,在一定质量分数范围条件下,LPC的加入会与蛋白结合,降低界面张力,最终形成较小的油滴粒径,起到维持乳液稳定的作用 [28]。但对于SPI-20LPC乳化体系来说,20% LPC的加入并没有进一步降低乳液粒径的大小,反而使粒径分布出现不均匀、粒径变大的趋势。这说明,质量分数过高的LPC会黏连或聚集在蛋白质外不能很好地结合,进而使乳液液滴粒径增大,且粒径变大的原因主要是由于大于100 μm的粒子引起的,这也是造成SPI-20LPC乳液稳定性下降的原因。

上述结果证明适量LPC的加入会使蛋白与其较好地结合,使蛋白与LPC间通过相互作用力结合,稳定了水、油界面的平衡,有助于提高蛋白的乳化能力和稳定性 [12]

2.5 LPC对复合体系Zeta电位的影响

有研究表明乳液絮凝主要受界面层上发生的吸引和排斥作用影响,增强液滴间的静电作用可以提高乳液抗絮凝能力,液滴Zeta电位绝对值越大乳液稳定性越好 [13]。一般情况下,蛋白质表面带正电荷的氨基酸多于带负电荷氨基酸,其蛋白质溶液Zeta电位为正值 [29]。本实验采用Zeta电位仪对不同LPC添加量条件下的SPI-LPC复合乳化体系的Zeta电位进行测定,由图6可知,LPC的加入使乳液液滴的Zeta电位值由正电位变为负电位,且随着LPC添加量的增加,电荷量不断增大,之后基本保持不变。说明添加磷脂后能增加乳状液的负Zeta电位,使乳液液滴之间的斥力增大,从而提高乳液的稳定性。LPC能改变乳液的负Zeta电位,可能是由于与大豆蛋白发生疏水相互作用,使蛋白结构改变,更多的带负电荷氨基酸暴露出来,从而引起Zeta电位的改变,使复合乳化体系更多的带负电。而对于SPI-20LPC样品,虽然Zeta电位负电位的绝对值较大,但由于液滴的粒径分布不均且粒径较大,液滴与液滴之间的斥力难以抵抗液滴的重力作用,因此乳液的稳定性下降。

图6 LPC添加量对复合体系Zeta电位的影响
Fig.6 Effect of lysophospholipid addition on zeta potential of emulsion systems

2.6 乳液微观结构

图7 LPC添加量对复合乳液微观结构的影响
Fig.7 Effect of lysophospholipid addition on microstructure of emulsion systems

乳液微观结构的观察是最为直观的表征乳液稳定性的方法。本实验采用倒置光学显微镜对5 种乳液样品进行观察。由图7可知,SPI和SPI-20LPC乳化体系中乳滴分布较为不均,且乳滴大小不均一,有少量乳滴发生轻微聚集现象,这可能与乳液中乳滴较大、促进了絮凝现象的产生有关。而SPI-5LPC、SPI-10LPC以及SPI-15LPC乳液液滴大小较为均一,分布较为一致,乳液乳化稳定性较强,与之前乳化稳定性测定结果相似,但3 种样品间区别并不十分明显。乳滴微观结构的实验结果与粒径分布趋势相一致。

3 结 论

在SPI中加入一定比例的LPC可以改善乳液的乳化活性及乳化稳定性,促使乳液液滴粒径分布更均匀。

在LPC添加量为10%条件下制备的相关乳液具有最多的界面蛋白含量、最低的界面张力以及最高的乳化稳定性。然而,当LPC质量分数增加至20%时,相关乳液的稳定性变差。这是由于界面上蛋白吸附含量减少、相互作用减弱、粒径较大、分布不均造成的。

LPC的复合及添加比例对SPI乳状液会产生一定的影响。适量添加LPC会明显改善SPI乳状液的乳化性质,这将为现今食品工业中蛋白的生产以及乳状液的制备提供参考。

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Emulsifying Properties of Soybean Protein Isolate-Lysophosphatide Oil-in-Water (O/W) Emulsion

LI Qiuhui, WANG Zhongjiang, LI Jiani, SUI Xiaonan, QI Baokun, JIANG Lianzhou, LI Yang*
(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Abstract:The effect of the amount of added lysophospholipids on emulsifying properties of soy protein isolate (SPI)-lysophospholipid emulsion system was explored by determining the interfacial protein adsorption, interfacial tension, emulsifying activity, emulsion stability, particle size distribution, and zeta potential and by observing the microstructure and distribution of emulsion droplets under optical microscopy. The results showed that with increasing addition of lysophospholipids, the emulsifying characteristics were increased at first and then decreased. Among five samples, the emulsion with 10% lysophospholipids added presented the best emulsifying properties, suggesting that the proper addition of lysophospholipids could promote the interaction between soybean protein isolate and lysophospholipids, thereby reducing the interfacial tension, forming a stable interfacial fi lm at the water-oil interface, and fi nally forming a stable emulsion.

Key words:soybean protein isolate; lysophospholipids; emulsifying properties

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201703004

中图分类号:TS214. 2

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2017)03-0020-06

引文格式:

李秋慧, 王中江, 李佳妮, 等. 大豆蛋白-溶血磷脂O/W型复合乳液的乳化特性[J]. 食品科学, 2017, 38(3): 20-25. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201703004. http://www.spkx.net.cn

LI Qiuhui, WANG Zhongjiang, LI Jiani, et al. Emulsifying properties of soybean protein isolate-lysophosphatide oil-inwater (O/W) emulsion[J]. Food Science, 2017, 38(3): 20-25. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201703004. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-03-11

基金项目:“十二五”国家科技支撑计划项目(2014BAD22B00);黑龙江省自然科学基金重点项目(ZD201302);高等学校博士生学科点专项科研基金博导类资助项目(20132325110013);国家自然科学基金面上项目(31571876)

作者简介:李秋慧(1991—),女,硕士研究生,研究方向为粮食、油脂及植物蛋白工程。E-mail:cherish_lqh620@163.com

*通信作者:李杨(1981—),男,副教授,博士,研究方向为粮食、油脂及植物蛋白工程。E-mail:liyanghuangyu@163.com