阿魏酸拮抗PM2.5对A549细胞线粒体的损伤作用

劳文艳 1,2，毕婷婷 1，周艳丽 1，陈世杰 1，赵晓红 1,2,⋆，刁屹 1

（1.北京联合大学功能食品科学技术研究院，北京 100191；2. 北京联合大学生物活性物质与功能食品北京市重点实验室，北京 100191）

摘要：研究阿魏酸是否具有拮抗PM2.5致线粒体损伤作用及拮抗机制。实验分为空白对照组、PM2.5（240 μg/mL（损伤组和阿魏酸（80 mmol/L）保护组。通过MitoSOX Red特异性探针和流式细胞仪测定细胞线粒体内活性氧（reactive oxygen species，ROS）的含量；Annexin-V/PI双染色法流式细胞仪检测细胞凋亡率；JC-1染色法流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位的变化；活体细胞线粒体膜通道孔荧光检测试剂盒检测细胞线粒体膜通道孔（mitochondrial permeablity transition pore，mPTP）的开放情况；Western blot法检测caspase-3、caspase-9、含锰金属辅基的超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，MnSOD）和过氧化物酶增殖体激活受体γ共激活因子-1α（subunit of peroxisome proliferators-activated receptor-γ-coactivator-1α，PGC-1α）相关蛋白表达量。结果显示，与空白对照组比较，PM2.5损伤组的细胞ROS含量、caspase-3和caspase-9表达量及细胞凋亡率升高，线粒体膜电位和mPTP活性及PGC-1α、MnSOD的表达量降低；阿魏酸预处理后，显著降低了PM2.5造成的A549细胞ROS的含量、细胞凋亡率及caspase-3和caspase-9表达量的升高，显著升高了PM2.5致A549细胞线粒体的膜电位、mPTP的活性及PGC-1α和MnSOD表达量的降低。阿魏酸对PM2.5致A549细胞线粒体损伤具有明显的保护作用。

关键词：阿魏酸；PM2.5；A549细胞；线粒体；损伤；保护作用

PM2.5引起心血管和呼吸系统疾病与其细胞毒性相关 [1-2]。PM2.5能够引起细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）等自由基大量生成、DNA损伤继而扰乱细胞周期，激活核转录因子-κB （nuclear factor-kappa B，NF-κB）等炎性信号通路引起炎症因子大量生成，最终导致细胞凋亡或者坏死 [3]。已有研究证实，细胞凋亡与线粒体损伤有关 [4]。PM2.5对心脑系统损伤过程中也发现有线粒体异常的现象 [5]。由于线粒体特殊的结构和功能，使其成为外界毒物刺激的敏感靶点。当受到有害物质的刺激后，线粒体结构易发生损伤与功能障碍，进而可能会导致相关疾病的发生 [5-6]，因而成为细胞毒性研究的热点之一。研究发现，人参皂苷Rg1与PM2.5共同作用于脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）48 h，可以拮抗PM2.5诱导的血管内皮细胞活性的下降 [7]。Zhang Zhiguo等 [8]分析了细颗粒物对人支气管上皮细胞（human bronchial epithelial cells，HBEC）的毒性，并对已知的姜黄素在人体内的作用目标蛋白进行分析，建立两个蛋白质-蛋白质相互作用网络，利用IPA（ingenuity pathways analysis）软件进行分析，预测结果显示，姜黄素对细颗粒物引起的健康危害具有潜在的拮抗作用。本实验室前期细胞实验结果显示，PM2.5能够造成中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）细胞、人肺腺癌细胞株A549的氧化损伤、炎性损伤和DNA链断裂 [9-11]，而植物活性物质阿魏酸可通过抗氧化、抗炎、抗DNA损伤作用发挥拮抗PM2.5对CHO细胞的保护作用 [9,12]。但有关对A549细胞线粒体损伤作用的研究还少有报道，因此，本实验将从氧化应激、线粒体内途径凋亡以及线粒体结构和功能影响方面来研究阿魏酸拮抗PM2.5线粒体损伤作用及其机制，为生物活性物质拮抗PM2.5致健康影响的研究提供基础数据。

1 材料与方法

人肺腺癌细胞株A549 北京协和医学院基础学院细胞中心；阿魏酸标准品美国Sigma公司；DMEM/F-12培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）美国GIBCO公司；10×胰蛋白酶（蛋白酶含量为2.5%）、线粒体超氧化物红色荧光探针（MitoSOX red mitochondrial superoxide indicator ，MitoSOX Red）美国Invitrogen公司；辣根过氧化物酶标记二抗北京鼎国昌盛生物研究所；聚氰基丙烯酸正丁酯（butyleyanoacrylate，BCA）蛋白浓度测定试剂盒江苏碧云天生物技术研究所；细胞增殖与活性检测试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）日本DOJINDO公司；细胞凋亡检测试剂盒、JC-1线粒体膜电位检测试剂盒美国Genview公司；活体细胞线粒体膜通道孔荧光检测试剂盒美国Genmed公司；caspase-3及caspase-9多克隆抗体美国CST公司；含锰金属辅基的超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，MnSOD）、过氧化物酶增殖体激活受体γ共激活因子-1α（subunit of peroxisome proliferators- activated receptor-γ-coactivator-1α，PGC-1α）多克隆抗体美国Abcam公司；β-肌动蛋白（β-actin）多克隆抗体美国Santa公司；彩色预染Marker 美国Fermentas公司。

大气流量采样器TH1000C型中国武汉天虹仪表有限公司；瑞典Munktell超纯石英纤维滤膜北京赛福莱博科技有限公司；LYOVAC GT2-3真空冷冻干燥机德国SRK公司；TE2000-M倒置显微镜日本Nikon公司；多功能酶标仪美国Thermo公司；流式细胞仪美国BD公司；微板分光光度计MQX200 美国Bio-Tek公司；聚丙烯酰胺凝胶电泳仪、蛋白电泳转移装置美国Bio-Rad公司；ImageQuant RT ECL凝胶成像系统美国GE Healthcare公司。

采样地点位于北京城区西四环内的交通主干道旁的北京联合大学应用文理学院教学楼6层顶，采用PM2.5大流量采样器连续采样22 h，采样流量为1.05 m 3/min，停机2 h为1 个采样循环。采样后的滤膜称质量后，放入洁净的自封袋中，4 ℃避光保存。

将采样后的滤膜剪成1 cm×1 cm大小，浸泡在去离子水中，用超声振荡器振荡3 次，每次30 min，洗脱颗粒物。洗提液用6层纱布过滤，将滤液真空冷冻干燥使其成为干粉，－20 ℃冰箱中避光保存。使用时紫外照射30 min后，用灭菌的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）配成5 mg/mL的PM2.5悬液，为保证悬液均匀，用前经超声振荡10 min。

实验分为空白对照组、PM2.5损伤组和阿魏酸保护组。用CCK-8法测定细胞增殖实验的结果，选取PM2.5对细胞存活率大于80%的剂量（240 μg/mL）作为损伤剂量、阿魏酸具有促进细胞增殖的80 μmol/L作为拮抗损伤的实验剂量。取生长良好的A549细胞用0.25%的胰蛋白酶消化成均匀的细胞悬液，调整细胞密度至5×10 4个/ mL，接种于6 孔培养板中，1 500 μL/孔，在37 ℃、5% CO 2的培养箱内培养24 h。阿魏酸保护组加入80 μmol/L的阿魏酸预保护6 h，弃上清液，加入240 μg/mL PM2.5继续作用20 h；PM2.5损伤组只加入240 μg/mL；空白对照组只加入等量的PBS。

细胞中加入2.5 μmol/L MitoSOX Red工作液1 mL，37 ℃避光孵育15 min，用37 ℃预热的PBS洗去胞外的荧光探针，经胰蛋白酶消化、PBS清洗、离心，用PBS重悬制成0.5 mL单细胞悬液，用200 目的筛网过滤，转移到流式细胞管内，通过流式细胞仪检测细胞线粒体ROS含量。

用不含乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的0.25%的胰蛋白酶消化细胞，PBS清洗离心后用500 μL的结合缓冲液（binding buffer）重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC混匀后，用200 目滤网过滤，并转移到流式管中，置冰上，然后加入5 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI），混匀。室温避光孵育15 min，通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况。根据流式图计算出凋亡细胞占检测细胞总数的百分率，即为细胞凋亡率。

细胞经胰蛋白酶消化、PBS清洗、离心后，用无血清培养基吹打成均匀的单细胞悬液，每管加入1mL JC-1染色液，轻轻晃动充分混合均匀于细胞培养箱中37 ℃避光孵育20 min。孵育结束后，1 000 r/min离心5 min后弃上清液，用冰冷的1×JC-1染色缓冲液清洗2 遍，加入0.5 mL的PBS，通过流式细胞仪检测各组JC-1的荧光强度。线粒体损伤膜电位下降时，可在流式细胞仪FL-1（绿色）通道检测出绿色荧光；正常健康线粒体的膜电位较高，具有极性，JC-1可被迅速摄入线粒体进入其基质内，形成多聚体，多聚体发射光为红色荧光，可被流式细胞仪的FL-2（红色）通道检测到。数据采用Cell quest TM软件分析，结果以FL2/FL1（红/绿荧光强度）的比值表示。

根据试剂盒说明书加载荧光探针，通过荧光分光光度计（激发波长488 nm，散发波长505 nm）的荧光变化，检测细胞线线粒体膜通道孔（mitochondrial permeablity transition pore，mPTP）开放活性的变化情况。

细胞用裂解液在冰上裂解30 min；刮下底部细胞转移到1.5 mL的离心管中，4 ℃条件下13 000 r/min离心15 min。收集上清液，部分上清液用5×上样缓冲液按体积比4∶1的比例混合均匀，100 ℃煮5 min，置于－80 ℃冰箱内保存。用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定各样品的蛋白质浓度，根据测得的质量浓度计算各样品的上样体积，并做好记录。蛋白转至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，按试剂盒提供的方法进行一抗、二抗孵育。加上显色液，利用Image Quant RTECL凝胶成像系统，获取目标蛋白条带的图像；用Quantity One软件分析得到蛋白条带灰度值进行统计分析。结果计算时，蛋白相对表达量按照目标蛋白条带灰度值与内参蛋白β-肌动蛋白条带灰度值的比值表示。

用SPSS 17.0软件进行描述性统计分析，采用

±s表示实验的结果；采用单因素方差分析中的t检验比较实验处理组与对照组的差别，以及单因素方差分析进行多组均数的比较。

2 结果与分析

表1 阿魏酸对PM2.5引起A549细胞氧化应激的保护作用（n=3）
Table1 Protective effect of FA on PM2.5-induced oxidative stress in A549 cellllss (n=3) %

注：⋆.与空白对照比较差异显著（P＜0.05）；#. 与PM2.5损伤组比较差异显著（P＜0.01）；⋆⋆.与空白对照比较差异极显著（P＜0.01）；##. 与PM2.5损伤组比较差异极显著（P＜0.01）。下同。

组别ROS相对含量PGC-1α相对表达量MnSOD相对表达量空白对照组12.90±0.97100.00100.00 PM2.5损伤组85.75±1.65⋆⋆70.04±3.76⋆71.61±3.41⋆阿魏酸保护组40.11±1.46 ##86.62±4.08 #90.39±1.20 #

由表1可见，PM2.5作用A549细胞后能引起线粒体ROS的含量明显增高，与空白对照组比较具有极显著差异（P＜0.01）；而阿魏酸可明显拮抗PM2.5造成的A549细胞线粒体ROS含量的上升，与PM2.5损伤组比较具有极显著差异（P＜0.01）；与空白对照组相比，PM2.5可显著降低PGC-1α的表达量（P＜0.05），阿魏酸可拮抗PM2.5造成的A549细胞PGC-1α表达量的降低，与PM2.5损伤组比较具有显著差异（P＜0.05）；与空白对照组相比，PM2.5作用可显著降低MnSOD的表达量（P＜0.05），阿魏酸可拮抗PM2.5造成的A549细胞MnSOD表达量的降低，与PM2.5损伤组比较具有统计学差异（P＜0.05）。以上结果说明，阿魏酸可以对PM2.5引起的细胞线粒体氧化损伤具有明显的保护作用，ROS水平的降低与细胞PGC-1α通路活性的降低及线粒体抗氧化蛋白MnSOD表达的增加有关。

表2 阿魏酸拮抗PM2.5引起A549细胞的凋亡（n=3）
Table2 Protective effect of FA on PM2.5-induced apoptosis and related protein expression in A549 cells (n=3)
%

组别细胞凋亡率caspase-3相对表达量caspase-9相对表达量空白对照组5.76±1.24100±0100±0 PM2.5损伤组19.47±0.39**329.63±16.81 **285.76±13.95**阿魏酸保护组13.76±0.32 ##229.10±10.34 ##184.13±6.44 ##

由表2可见，PM2.5处理A549细胞后，细胞凋亡率明显升高，与空白对照组比较具有极显著差异（P＜0.01）；阿魏酸可拮抗PM2.5诱导的A549细胞凋亡，与PM2.5损伤组比较细胞凋亡率降低，具有极显著差异（P＜0.01）；与空白对照组相比，PM2.5处理的A549细胞caspase-3和caspase-9的表达量极显著增加（P＜0.01），而阿魏酸可拮抗PM2.5造成的A549细胞caspase-3和caspase-9的表达量增加，与PM2.5损伤组比较具有极显著的降低作用（P＜0.01）。

以上结果说明，阿魏酸可以抑制PM2.5诱导的A549细胞凋亡率增加，其作用机制与线粒体介导的细胞凋亡途径有关。

表3 阿魏酸对PM2.5引起A549细胞线粒体膜电位和mPTP开放活性改变的保护作用（n==33）
Table3 Protective effect of FA on PM2.5-induced changes in mitochondrial membrane potential and mPTP activity in A549 celllss ((n == 33))

组别mPTP开放活性线粒体膜电位空白对照组1876.67±37.980.58±0.007 PM2.5损伤组1256.70±15.64⋆⋆ 0.32±0.004⋆⋆阿魏酸保护组1424.67±37.83 #0.42±0.006 ##

由表3结果显示，PM2.5处理可明显降低A549细胞线粒体mPTP活性和线粒体膜电位，与空白对照组比较均具有极显著性差异（P＜0.01）；而阿魏酸可拮抗PM2.5造成的mPTP开放活性和由此引起的线粒体膜电位下降，与PM2.5损伤组比较具有显著（P＜0.05）和极显著差异（P＜0.01）。

以上结果说明，阿魏酸可以抑制PM2.5引起的mPTP开放，从而抑制线粒体膜电位下降，具有明显的细胞保护作用。

3 讨论

细胞暴露于PM2.5后，ROS的含量显著增加、丙二醛（methane dicarboxylic aldehyde，MDA）的浓度升高，呈现剂量-效应关系 [13]。PM2.5在刺激ROS、NO含量增加的同时，还抑制机体抗氧化反应体系，抑制细胞内SOD、MnSOD、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）等抗氧化酶的活性，降低细胞清除ROS的能力，从而使细胞处于氧化应激状态 [13-14]。ROS 可激活受体PGC-1α通路，继而诱导MnSOD等线粒体抗氧化蛋白的表达，保护细胞与线粒体免于氧化损伤 [15]。PGC-1α是外界因素对线粒体损伤作用的重要的保护机制，是一个辅助转录因子，控制能量代谢相关基因 [16]。当细胞受到外界因素的刺激，细胞线粒体能量代谢稳态失衡时，激活PGC-1α的表达抵抗外界因素对细胞的损伤，当刺激达到一定程度时就会抑制PGC-1α的表达，对细胞和线粒体造成损伤 [17]。本研究的结果也显示PM2.5处理的A549细胞ROS含量明显增加，进一步抑制了PGC-1α和MnSOD的表达。

研究表明，人类呼吸道上皮细胞暴露于颗粒物后，可以激活一系列磷酸化，诱导白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）等相关炎性因子基因的表达和转录 [18]。炎性因子TNF-α与线粒体膜电位变化有明显的相关性，且可以激活caspase家族，引起细胞凋亡 [19]，本此研究实验结果与此相一致。冯哲伟 [20]研究发现，在细胞凋亡的早期，烹调油烟可诱导线粒体通透性转换，激活caspase-9和caspase-3，最终引起细胞线粒体介导的细胞凋亡。本研究经PM2.5处理的A549细胞中caspase-3和caspase-9的表达量显著升高。

已有研究发现，线粒体外膜上的电位依赖性阴离子通道（potential dependent anion channel，VDAC），在细胞凋亡和细胞死亡过程中扮演重要角色 [21-22]。Ca 2＋通过VDAC表面存在Ca 2＋结合位点调控mPTP的开放 [23]。PM2.5可以升高细胞内Ca 2＋浓度 [24]。线粒体内高水平的Ca 2＋和过度氧化应激是导致mPTP大量开放的主要因素 [25-26]，mPTP开放会导致线粒体膜电位迅速降低，引起钠、钾、钙等离子平衡失调，线粒体肿胀功能紊乱及结构破坏，最终导致细胞死亡 [27-29]。本研究以A549细胞为研究对象，得到了相似结果：经PM2.5处理的细胞，ROS的生成量显著增加，使mPTP开放，导致膜电位下降，最终导致细胞凋亡。

有关植物活性物质拮抗PM2.5的损伤作用的研究报道相对较少。研究发现，VE对由PM2.5引起的大鼠肺组织细胞的氧化性损伤具有一定的拮抗作用，大鼠口服VE后肺泡灌洗液中的氧化性指标乳酸脱氢酶、MDA、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶水平有所下降 [30]。N-乙酰半胱氨酸对PM2.5造成的大鼠肺损伤也具有保护作用，通过抑制由PM2.5激活的NF-κB信号通路，提高了大鼠的抗氧化能力，同时降低了血清和肺组织中炎性因子的表达 [31]。本实验室前期通过对人肺成纤维细胞用单细胞凝胶电泳方法研究发现番茄红素具有很好的拮抗PM2.5 DNA损伤的作用 [32]；通过对CHO细胞凋亡相关通路以及遗传毒性相关通路的研究发现阿魏酸、绿原酸、荭草素具有拮抗PM2.5凋亡和遗传毒性的保护作用，其中以阿魏酸的保护作用最强 [9-10]。

在针对PM2.5对A549细胞的线粒体损伤作用及损伤机理研究的基础上，本实验进一步研究了天然植物活性物质阿魏酸拮抗PM2.5线粒体损伤的保护作用。研究结果表明，阿魏酸能够显著的保护PM2.5引起的细胞增殖毒性作用，保护机制与清除自由基、抗氧化有关 [9]。由本研究结果可以看出80 μmol/L的阿魏酸能有效地拮抗PM2.5对A549细胞的增殖毒性作用，在机制研究中发现，阿魏酸不仅可以减少线粒体内ROS的含量、激活被抑制的PGC-1α通路、促进MnSOD的表达，还能有效地抑制mPTP的开放和线粒体膜电位的下降，以及通过抑制caspase-9介导的线粒体内途径引起的细胞凋亡。

目前对PM2.5的研究多集中于在细胞毒性水平上的研究，而针对早期线粒体毒性的研究及植物活性物质拮抗作用的研究相对较少。本研究证实植物活性单体物质具有较好的拮抗PM2.5线粒体毒性的作用，其保护机理与抗氧化、保护mPTP以及抑制线粒体内途径介导的凋亡相关，而线粒体损伤机制中关于线粒体分裂融合的研究比较少，因此在以后的研究中应该继续在对PM2.5对线粒体分裂融合方面进行深入研究。并且，除了对PM2.5的损伤机理研究外，更应该集中于如何治理PM2.5污染和寻找有效的拮抗物质来预防和保护人类健康等领域。

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Protective Effect of Ferulic Acid on PM2.5-Induced Mitochondrial Damage in A549 Cells

LAO Wenyan 1,2, BI Tingting 1, ZHOU Yanli 1, CHEN Shijie 1, ZHAO Xiaohong 1,2,⋆, DIAO Yi 1
(1. Research Institute for Science and Technology of Functional Foods, Beijing Union University, Beijing 100191, China; 2. Key Laboratory of Bioactive Substances and Functional Foods, Beijing Union University, Beijing 100191, China)

Abstract：In this study, we examined whether ferulic acid (FA) could protect against PM2.5-induced mitochondrial damage in A549 cells and explored the underlying mechanism. The cells were treated with PM2.5 (240 μg/mL) with and without the addition of 80 mmol/L FA. The contents of reactive oxygen species (ROS) were determined by fl ow cytometry using MitoSOX Red specific probe. Apoptosis was detected by flow cytometry with Annexin-V/PI method. Mitochondrial membrane potential was detected by fl ow cytometry with JC-1 staining. The activity of mitochondrial membrane channel pore was tested by mitochondrial permeability transition pore (mPTP) kit. The expression of caspase-3, caspase-9, manganese superoxide dismutase (MnSOD), and peroxisome proliferators-activated receptor-γ-coactivator-1α (FGC-1α) were detected by Western blotting. The results showed that, compared with the blank control group, the level of ROS and the expression of caspase-3 and caspase-9 in mitochondria, as well as the apoptosis rate of A549 cells induced by PM2.5 were increased. The membrane potential and the activity of mPTP in mitochondria of A549 cells induced by PM2.5 were decreased as well as the expression of PGC-1α and MnSOD. The pre-treatment of FA could prevent the increased mitochondrial ROS, apoptosis rate and expression of caspase-3 and caspase-9, and the decreased mitochondrial membrane potential, mPTP activity, and expression of PGC-1α and MnSOD caused by PM2.5. Therefore, FA had a signif i cant protective effect on PM2.5-induced mitochondrial damage in A549 cells.

Key words：ferulic acid; PM2.5; A549 cells; mitochondria; damage; protective effect

基金项目：中国营养学会营养科研基金-帝斯曼专项科研基金项目（2015-030（CNS-DSM））；北京联合大学生物活性物质与功能食品北京市重点实验室开放课题（Zk70201501）

作者简介：劳文艳（1970—），女，高级实验师，硕士，主要从事功能食品研究。E-mail：laowenyan@buu.edu.cn

⋆通信作者：赵晓红（1961—），女，研究员，博士，主要从事环境与食品毒理学研究。E-mail：xiaohong@buu.edu.cn

劳文艳, 毕婷婷, 周艳丽, 等. 阿魏酸拮抗PM2.5对A549细胞线粒体的损伤作用[J]. 食品科学, 2017, 38(3)： 195-200. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201703032. http：//www.spkx.net.cn

LAO Wenyan, BI Tingting, ZHOU Yanli, et al. Protective effect of ferulic acid on PM2.5-induced mitochondrial damage in A549 cells[J]. Food Science, 2017, 38(3)： 195-200. (in Chinese with English abstract)

阿魏酸拮抗PM2.5对A549细胞线粒体的损伤作用

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨 论

3 讨论