张琳琳 1，陈 俊 1,2，翁武银 1,2*
（1.集美大学食品与生物工程学院，福建 厦门 361021；2.厦门市海洋功能食品重点实验室，福建 厦门 361021）
摘 要：考察热处理时间对罗非鱼皮酸溶性胶原（acid-soluble collagen，ASC）理化性质和成膜能力的影响。结果发现，热处理时间对胶原的紫外吸收和分子质量分布没有明显影响；随着热处理时间的延长，ASC的比浓黏度发生下降，变性温度和热转变温度分别从32.6 ℃和38.15 ℃下降至27.0 ℃和29.19 ℃。浊度实验结果表明，当ASC在42 ℃条件下热处理超过10 min后，ASC不具备成纤维能力。而且，热变性的胶原还会阻碍天然胶原的纤维形成。另一方面，随着热处理时间的延长，胶原膜的抗拉伸强度从30.81 MPa增加至41.33 MPa，断裂延伸率从8.95%增加至11.59%，透明度值从2.42增加至3.33。根据扫描电子显微镜观察的结果，发现胶原膜的纤维状网络结构随着热处理逐渐转变成类似皱纹的纹理结构。以上研究结果表明，经过热变性后，罗非鱼皮ASC的成纤维能力下降，但成膜能力却出现上升。
关键词：酸溶性胶原；热处理；成纤维能力；成膜能力；罗非鱼皮
胶原具有良好的生物相容性、低免疫原性和成膜性能等优点，近年来被广泛应用于食品工业、生物材料和化妆品行业中 [1-3]。由于疯牛病、口蹄疫、禽流感等不断爆发，以及宗教信仰的原因，利用水生动物组织提取的胶原逐渐受到关注 [4]。
天然的胶原具有独特的三螺旋结构，胶原分子间形成的特殊共价交联对胶原纤维起到稳定作用。当胶原受热变性后，氢键被破坏，三螺旋结构向无规则卷曲转变 [5]。明胶是胶原通过热变性衍生而来的，明胶蛋白也就是变性的胶原，但结构和性能明显不同于天然的胶原。草鱼皮胶原溶液在40 ℃条件下热处理30 min后可以得到完全变性的胶原 [6]，Karayannakidis等 [7]利用40 ℃热水可以从金枪鱼皮中浸提得到明胶。李国英等 [8]比较了胶原与其明胶的性质，结果发现只有胶原在模拟生理条件下通过自组装形成纤维，表明胶原具有很好的成膜能力。有研究报道，罗非鱼皮胶原蛋白膜的抗拉伸强度（tensile strength，TS）和断裂延伸率（elongation at break，EAB）分别为51.24 MPa和36.71% [9]，而利用罗非鱼皮明胶制备的蛋白膜，其TS和EAB却高达67.72 MPa和29.97% [10]，表明明胶的成膜能力有可能高于胶原。然而，由于膜的制备时选用的溶剂不一样，膜的性能缺乏可比性，因此有必要深入考察不同变性程度的鱼皮胶原在同一溶剂体系下的成膜性能。
本研究利用罗非鱼皮提取酸溶性胶原（acid-soluble collagen，ASC），通过考察热变性时间对ASC理化性质的影响，研究变性程度对胶原膜性质的影响，为比较鱼皮胶原与明胶在成膜机制上的差异提供参考。
1.1 材料与试剂
尼罗罗非鱼皮 宁德市夏威食品有限公司；氢氧化钠、无水乙醇、氯化钠（均为分析纯） 西陇化工股份有限公司。
1.2 仪器与设备
TMS-PRO质构仪 美国Food Technology公司；Q2000差示扫描量热仪（differential scanning calorimeter，DSC） 美国TA仪器公司；S-4800扫描电子显微镜日本东京日立制造所；UV-8000A紫外分光光度计 上海元析仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 鱼皮ASC的提取
ASC参照Tang Lanlan等 [9]报道的方法在4 ℃条件下进行提取。冰水漂洗干净的鱼皮用0.1 mol/L NaOH溶液（料液比1∶10，m/V）浸泡36 h、冰水漂洗；用10%（V/V）正丁醇溶液浸泡（料液比1∶10，m/V）24 h、冰水漂洗；利用30 倍原料质量0.5 mol/L的乙酸溶液提取72 h；通过15 000×g离心20 min，在获得的上清液中加入NaCl至终浓度为2.3 mol/L，15 000×g离心20 min，获得的沉淀利用0.5 mol/L乙酸溶解后用0.1 mol/L乙酸透析24 h，最后用蒸馏水透析至中性，所得胶原溶液冷冻干燥后保存在－18 ℃，供以下实验使用。
1.3.2 胶原的热处理
将冻干后的胶原溶于0.5 mol/L的乙酸溶液中，配制成蛋白质量浓度为10 mg/mL的溶液。将得到的胶原溶液分别在42 ℃条件下水浴搅拌0、5、10、20、40、80 min后，迅速用冰水冷却，在4 ℃条件下用透析袋（截留分子质量大于14 ku）经0.1 mol/L 乙酸透析、蒸馏水透析后，通过冷冻干燥获得热处理时间（0、5、10、20、40、80 min）不同的胶原。
1.3.3 紫外吸收光谱
胶原样品利用0.1 mol/L乙酸溶液溶解后，配成蛋白质量浓度为1 mg/mL的胶原溶液，用紫外分光光度计测定样品在波长190～400 nm间的吸收光谱。
1.3.4 SDS-PAGE
胶原样品用含2% SDS、8 mol/L尿素、20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8）的蛋白变性剂溶解，溶解的蛋白根据Laemmli [11]报道的方法进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析。标准蛋白分子质量范围为10～200 kD。
1.3.5 黏度和热变性温度
胶原溶液的黏度参照Tang Lanlan等 [9]报道的方法进行测定。胶原样品利用0.1 mol/L乙酸调制成蛋白质量浓度为1 mg/mL的胶原溶液（c），在10～45 ℃条件下测定胶原溶液从乌氏黏度计中的流出时间（t），同时也在相同条件下测定0.1 mol/L乙酸溶液的流出时间（t 0）。特性黏度η sp和比浓黏度η re分别按公式（1）、（2）进行计算：
胶原的变性温度（T d）是胶原溶液比浓黏度变化一半时所对应的温度。
同时，参照Jia Yuanjun等 [12]报道的方法利用DSC对胶原的热转变温度进行测定。将冻干的胶原样品以1∶40（m/V）的比例溶胀于蒸馏水中，准确称取15 mg左右的溶胀样品利用DSC进行测定。扫描温度范围为0～60 ℃，升温速率为2 ℃/min，用空的铝坩埚作为参照。
1.3.6 浊度实验
胶原溶液的浊度测定参照Li Yupin等 [13]报道的方法并稍作修改。胶原样品利用0.5 mol/L乙酸溶液调制成蛋白质量浓度为1 mg/mL的胶原溶液，在4 ℃条件下用0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液（含0.15 mol/L NaCl，pH 7.4）透析24 h后，利用紫外分光光度计检测胶原溶液在30 ℃条件下313 nm波长处吸光度随时间的变化。按照同样的方法还考察了添加20%变性胶原对胶原溶液浊度的影响。
1.3.7 胶原膜的制备
胶原膜参考唐兰兰等 [14]报道的方法并做适当的修改。取热处理后的胶原溶液制备胶原膜，添加胶原质量20%的甘油混合、脱泡后，在温度（25±1）℃、相对湿度为（50±5）%条件下干燥制备成胶原膜，供以下实验使用。1.3.8 胶原膜性质的测定
1.3.8.1 微观结构分析
膜的微观结构分析根据Tang Lanlan等 [9]报道的方法。将充分脱水的胶原膜固定在样品台上，经表面镀金后采用扫描电子显微镜进行观察。
1.3.8.2 机械性能的测定
胶原膜的机械性能参考翁武银等 [15]报道的方法进行测定。胶原膜用厚度计测定其厚度后，利用TMS-PRO质构仪对膜样品进行拉伸实验。膜的TS和EAB按照以公式（3）、（4）进行计算：
式中：F为膜断裂时承受的最大张力/N；S为膜的横断面积/m 2。
式中：E为膜断裂时被拉伸的长度/mm；L为膜的初始长度/mm，30 mm。
1.3.8.3 颜色和透光率的测定
胶原膜的颜色利用WSC-S测色色差计进行测定。颜色以参数L *（黑-白）、a *（绿-红）、b *（蓝-黄）的值表示。其中标准白板的参数值为：L *=91.86，a *=－0.88，b *=1.42。
胶原膜的透光率和透明度值按照Hoque等 [16]报道的方法利用紫外分光光度计进行测定。将膜样品贴于比色槽外，在200～800 nm波长范围内测定其透光率，以空气作空白对照，每种膜样品做3 个平行。胶原膜的透明度值按公式（5）进行计算：
式中：T 600 nm为膜在600 nm波长处的透光率；L为膜的厚度/mm。透明度值越高，表示胶原膜越不透明。1.4 数据统计与分析
采用SPSS 17.0软件对文中所得数据进行方差分析（ANOVA），显著性检验方法为Duncan多重检验，显著水平为0.05。
2.1 热处理时间对罗非鱼皮ASC紫外吸收光谱的影响
图 1 罗非鱼皮ASC的紫外吸收光谱
Fig. 1 UV spectra of ASC extracted from tilapia skin
图1是罗非鱼皮ASC在波长为200～400 nm的紫外吸收光谱，可知，罗非鱼皮ASC最大吸收峰在225 nm波长处，符合胶原的紫外吸收特征，类似于Zeng Shaokui等 [17]报道的结果。然而，罗非鱼皮ASC在42 ℃条件下热处理5～80 min后，胶原溶液的紫外吸收光谱都没有发生明显的变化（图1）。
2.2 罗非鱼皮ASC的SDS-PAGE分析
图 2 热处理时间对罗非鱼皮ASC蛋白组分的影响
Fig. 2 SDS-PAGE analysis of tilapia skin ASC subjected to thermal treatment for different times
利用SDS-PAGE考察了热处理时间对罗非鱼皮ASC蛋白组分的影响，结果如图2所示。罗非鱼皮ASC主要由α 1、α 2肽链，以及β肽链和γ肽链组成，这与报道的草鱼皮 [18]、狭鳕鱼皮 [19]、鲶鱼皮 [20]等提取的ASC结果类似。然而，根据图2结果没有发现热处理时间对罗非鱼皮ASC的组分产生明显的影响。
2.3 热处理时间对罗非鱼皮ASC黏度和热变性温度的影响
热处理时间对罗非鱼皮ASC的比浓黏度的影响结果如图3所示。在检测温度低于25 ℃时，罗非鱼皮ASC的比浓黏度为28.9 dL/g，当测定温度高于30 ℃时，比浓黏度出现急剧下降，在40 ℃时趋于稳定。这主要是随着温度的升高，溶液中胶原分子间的氢键发生断裂，三螺旋结构发生解离、胶原发生明胶化 [21-23]，结果导致黏度下降。当罗非鱼皮ASC经过5 min热处理后，胶原溶液的比浓黏度随温度变化的趋势虽然没有明显变化，但检测温度低于25 ℃条件下的比浓黏度显著低于未经热处理的样品。随着热处理时间进一步延长，胶原溶液的比浓黏度随温度升高出现的转折逐渐变得不明显，推测在42 ℃条件下热处理10 min后罗非鱼皮胶原就完全变性。胶原的热变性是胶原三螺旋结构解离转变成无规则卷曲，导致胶原溶液的黏度发生下降，通常可以利用胶原溶液比浓黏度变化一半时所对应的温度作为胶原的变性温度（T d） [24]。根据比浓黏度变化（图3），经过0、5、10、20、40、80 min热处理的罗非鱼皮ASC的T d分别为32.6、32.5、30.3、27.3、27.2 ℃和27.0 ℃。
图 3 热处理对罗非鱼皮ASC比浓黏度的影响
Fig. 3 Effect of thermal treatment time on specif i c viscosity of ASC from tilapia skin
图 4 罗非鱼皮ASC的DSC曲线
Fig. 4 DSC thermograms of ASC from tilapia skin
另一方面，利用DSC对罗非鱼皮ASC的热转变温度（T m）进行测定，结果如图4所示。未经热处理的ASC的T m为38.15 ℃，低于Komsa-Penkova等 [25]报道的牛皮胶原的T m（40.8 ℃）。热处理5 min的ASC在DSC曲线上出现两个明显的峰，波峰的温度分别是28.86 ℃和39.24 ℃，分别代表完全变性胶原和未变性胶原的T m，表明罗非鱼皮ASC经过5 min热处理后还没有完全变性。然而，进一步延长热处理时间，得到的变性ASC在DSC曲线上都只出现一个波峰，它们的T m集中分布在29.2～29.3 ℃（图4）。这些结果再次表明罗非鱼皮ASC在42 ℃条件下热处理10 min后就完全变性。
2.4 罗非鱼皮ASC浊度实验结果
图 5 罗非鱼皮ASC的浊度-时间曲线
Fig. 5 Turbidity-time curves of ASC from tilapia skin
在自组装过程中，胶原溶液的浊度会随着胶原纤维的形成而增加 [26]。因此，检测了罗非鱼皮ASC的浊度-时间曲线变化，结果如图5a所示。未经热处理的ASC的成纤维过程可以分为3 个阶段：第1阶段是迟滞期，溶液的浊度基本上无变化；第2阶段是增长期，浊度快速增加；第3阶段是成熟期，浊度基本恒定，此时胶原纤维的三维结构已经形成。这与Yan Mingyan等 [27]报道的现象一致。当ASC经过5 min热处理后，成纤维的迟滞期和增长期出现明显延长，而且3 个阶段的界限变得较模糊。当ASC的热处理时间超过10 min后，胶原溶液的浊度不再随时间发生变化（图5a），表明完全变性的胶原不具备成纤维能力。另一方面，当罗非鱼皮ASC中添加了20%的不同时间热处理的变性胶原（图5b），结果发现添加的变性胶原热处理时间越长，ASC的成纤维能力越弱，表明热变性的胶原不仅不具备成纤维能力，还会阻碍未变性胶原的纤维形成。贾媛君 [28]也报道了类似的现象，青鱼皮胶原的体外自组装能力与胶原的变性程度具有一定的相关性，完全变性的胶原会丧失体外组装能力。
2.5 热处理时间对罗非鱼皮ASC胶原膜性质的影响
2.5.1 微观结构
由图6可知，利用天然胶原制备的蛋白膜其表面呈现出明显的纤维状网络结构（图6a）。当胶原经过5 min热处理时，制备的蛋白膜表面纤维状结构开始出现模糊（图6b）。当胶原经过10 min热处理后，蛋白膜表面逐渐出现类似皱纹的纹理结构（图6c）。而且伴随热处理时间的延长，这种类似皱纹的纹理结构逐渐增加、密集（图6d～f）。这可能是成膜溶液在干燥过程中，表面与内部水分蒸发不同步造成的。也可能是天然胶原受热发生变性，胶原的三螺旋结构逐渐打开，形成无规则线链状分子 [29]，在干燥过程中相互之间更容易缠绕在一起，有利于形成致密的网络结构，今后将利用透射电子显微镜对膜的内部微观结构进行深入研究。
图 6 罗非鱼皮ASC膜的SEM图
Fig. 6 SEM micrographs of ASC fi lm prepared from tilapia skin
2.5.2 机械性能
表 1 热处理时间对胶原膜机械性能的影响
Table 1 Effect of thermal treatment time on mechanical properties of collagen fi lms
注：同行肩标不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
热处理时间/min0510204080 TS/MPa30.81±2.89 a28.46±3.31 a35.05±2.00 b37.62±3.91 b35.05±0.94 b41.33±0.85 cEAB/%8.95±2.19 ab7.49±1.70 a24.25±1.38 c11.16±2.44 b12.05±2.94 b11.59±3.37 b
热处理时间对罗非鱼皮胶原膜机械性能的影响如表1所示。与未经热处理的胶原制备的蛋白膜比较，利用热处理5 min的胶原制备的蛋白膜其TS没有发生显著变化。然而，随着热处理时间延长，胶原膜的TS出现一定程度的上升。另一方面，伴随着热处理时间的延长，胶原膜的EAB出现先上升后下降的趋势，在热处理10 min时蛋白膜的EAB达到最大值。虽然变性胶原在溶液中无法形成纤维，但是胶原经过热处理后，分子间的氢键发生断裂，三螺旋结构逐渐解离，可以更均匀地分散在成膜溶液中，随着成膜溶液水分的蒸发，均匀分散的胶原分子更有利于聚集形成致密的网络结构（图5），结果使膜的机械性能得到增强（表1）。也有研究发现明胶溶液在干燥成膜过程中可以发生部分复性形成三股螺旋结构，进而提高膜的机械强度 [30-31]。
2.5.3 颜色和透光率
表 2 热处理时间对胶原膜的颜色和透明度的影响
Table 2 Effect of thermal treatment time on color parameters and transparency of collagen fi lms
注：同列肩标不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
热处理时间/min颜色透明度值（T）L *a *b *白板91.86－0.881.42 089.18±0.27 a－1.35±0.15 a2.93±0.05 a2.42±0.29 a589.62±0.13 b－1.48±0.07 a2.95±0.01 ab3.63±0.23 b1089.51±0.06 b－1.41±0.04 a3.01±0.05 ab3.37±0.35 b2089.50±0.05 b－1.42±0.11 a3.01±0.04 ab3.13±0.20 b4089.57±0.01 b－1.47±0.03 a3.00±0.05 ab3.23±0.49 b8089.53±0.18 b－1.37±0.03 a3.04±0.10 b3.33±0.60 b
热处理时间对罗非鱼皮胶原膜的颜色和透明度的影响如表2所示。随着热处理时间的延长，胶原膜的a *值没有发生显著变化，而L *值和b *值都出现一定程度的增加。另一方面，蛋白膜的透明度值也随着胶原热处理时间的延长也出现一定程度的增加，表明胶原膜越不透明，这可能是热处理的胶原在干燥成膜时蛋白分子更容易聚集在一起，导致单位面积内的蛋白分子数目相对增多，使光线不易透过，导致蛋白膜的透光性能下降。
热处理时间对罗非鱼皮酸溶性胶原的紫外吸收和蛋白组成没有明显影响。然而，伴随热处理时间的延长，胶原的比浓黏度和热变性温度均出现下降。当热处理时间超过10 min时，胶原就失去成纤维能力。另一方面，随着热处理时间的延长，制备的蛋白膜机械性能和透明度值都出现一定程度上升，膜的纤维状网络结构变成类似皱纹的纹理结构。
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Effect of Thermal Treatment on the Properties of Acid-Soluble Collagen from Tilapia Skin
ZHANG Linlin
1, CHEN Jun
1,2, WENG Wuyin
1,2,*
(1. College of Food and Biological Engineering, Jimei University, Xiamen 361021, China; 2. Xiamen Key Laboratory of Marine Functional Food, Xiamen 361021, China)
Abstract：The effect of thermal treatment time on physicochemical properties and film-forming ability of acid-soluble collagen (ASC) from tilapia skin was investigated. No significant difference in UV absorption or molecular weight distribution of ASC was observed during thermal treatment. With increasing thermal treatment time, the specif i c viscosity of ASC was decreased, and the denaturation temperature and thermal transition temperature were decreased from 32.6 to 27.0 ℃ and from 38.15 to 29.19 ℃, respectively. When thermal treatment time was more than 10 min at 42 ℃, The results of turbidity experiments indicated that the ASC did not possess fibril-forming ability after 10 min treatment at 42 ℃. Furthermore, the fibril formation of natural collagen was also hindered by thermally denatured collagen. On the other hand, the tensile strength of collagen f i lms was increased from 30.81 to 41.33 MPa, the elongation at breaks from 8.95% to 11.59%, and the transparency value from 2.42 to 3.33 with increasing thermal treatment time. Based on the results of scanning electron microscopy, it was found that the f i brous structure of collagen f i lms was gradually converted to a wrinklelike structure during thermal treatment. From the above results, it could be concluded that the f i bril-forming ability of ASC from tilapia skins was decreased after thermal denaturation, while the f i lm-forming ability was increased.
Key words：acid-soluble collagen; thermal treatment; fi bril-forming ability; fi lm-forming ability; tilapia skin
DOI：10.7506/spkx1002-6630-201705013
中图分类号：TS254.9
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2017）05-0080-06
引文格式：
张琳琳, 陈俊, 翁武银. 热处理对罗非鱼皮酸溶性胶原性质的影响[J]. 食品科学, 2017, 38(5): 80-85. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201705013. http://www.spkx.net.cn
ZHANG Linlin, CHEN Jun, WENG Wuyin. Effect of thermal treatment on the properties of acid-soluble collagen from tilapia skin[J]. Food Science, 2017, 38(5): 80-85. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201705013. http://www.spkx.net.cn
收稿日期：2016-04-05
基金项目：国家自然科学基金面上项目（31271984；31571835）；福建省杰出青年科学基金项目（2014J06013）；
厦门市海洋经济发展专项资金项目（14CZP031HJ05）；福建省海洋经济创新发展区域示范项目（2014FJ05）
作者简介：张琳琳（1992—），女，硕士研究生，研究方向为水产品加工。E-mail：812455717@qq.com
*通信作者：翁武银（1974—），男，教授，博士，研究方向为水产加工及其副产物综合利用。E-mail：wwymail@jmu.edu.cn