生活于低温环境的生物体，为了抵御低温胁迫，会适应性地产生一种具有抗冻活性的特殊蛋白质——抗冻蛋白（antifreeze proteins，AFPs），亦称为冰结合蛋白或冰结构蛋白。AFPs是一类以非依数性形式降低体系冰点、改变冰晶形态、抑制冰晶生长、防止冰晶对生物体细胞造成的损伤和致死的特殊蛋白质[1]。AFPs能够降低体系的冰点，但对体系的融点却影响较小；因此，导致了体系的融点和冰点出现差值，这个差值称为热滞活性（thermal hysteresis activity，THA）[2]。
THA是评价AFP抗冻活性的重要指标，目前评价THA的方法主要有毛细管单晶生长观察法，纳升渗透压法和差示扫描量热（differential scanning calorimetry，DSC）法等。毛细管单晶生长观察法是最早用于THA测定的方法，该法不需要大型的仪器设备，但操作过程较复杂、耗时长，而且人为误差较大[3-4]。纳升渗透压法主要基于珀尔帖原理实现控温[5-8]，但该法依然依靠人工观察完成，容易出现误差，温度的变化速率和波动也无法实现精准的控制[4]。DSC法主要是基于样品结晶过程中吸热和放热的变化，检测体系发生的物理变化，精确迅速测定热容和热焓，从而确定真实的结晶起始温度，进而获得样品的THA，并能精确测定体系的冰晶含量[9]。DSC法能够精确测定体系的吸热和放热，反映AFPs特殊的相变和热力学行为。DSC法因其稳定性和精确性，得到了越来越广泛的应用[10-11]。
南极磷虾（Euphausia superba Dana）是一种生活在南极海域的小型浮游类海洋动物，生物量巨大（约为6.5亿～10.0亿 t）[12-15]。因此，南极磷虾己经成为近年来食品科学等学科的研究热点[16]。南极磷虾生活于南极海域冰冷的海水中（水温约为-1.9 ℃）[17]，研究表明南极磷虾主要依靠AFPs应对南极海域的低温胁迫[17-18]。作为一种潜在、广泛的天然AFPs来源，南极磷虾AFPs具有重要的应用前景；对于提高南极磷虾附加值也具有重要意义。本实验以纯化的南极磷虾AFPs为研究对象，采用DSC法评价其THA；重点考察了升降温速率、南极磷虾AFPs质量浓度、冰晶含量、缓冲体系等参数对THA的影响，以为AFPs的评价研究及抗冻机理提供基础信息。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
南极磷虾由上海开创远洋渔业有限公司2016年11月于南极设得兰群岛海域捕获，冷藏运回国内，实验室于-80 ℃贮藏备用；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 国药集团化学试剂有限公司；标准蛋白Marker 美国Bio-Rad公司。
1.2 仪器与设备
FreeZone真空冷冻干燥机 美国LABCONCO公司；204 F1 DSC仪 德国NETZSCH公司；电泳仪 美国Bio-Rad公司。
1.3 方法
1.3.1 南极磷虾AFPs的提取
以南极磷虾蛋白为原料提取南极磷虾AFPs，参照Kuiper等[19]方法构建特异性亲和吸附法提取南极磷虾AFPs，将提取的南极磷虾AFPs进行真空冷冻干燥。采用pH 7.8的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）分别配制不同质量浓度的AFPs溶液和BSA溶液。
1.3.2 南极磷虾AFPs的SDS-PAGE电泳
采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）进行南极磷虾AFPs的纯度鉴定，按照5∶1（V/V）的比例将样品与上样缓冲液混合，置于沸水中煮沸5 min，取15 μL样品上样，12.5%分离胶和4.0%浓缩胶，样品在120 V恒压条件下进行电泳。电泳完毕后，将凝胶置于质量分数0.4%的考马斯亮蓝R-250中染色2 h，在醋酸脱色液中脱色至背景无色，采用凝胶分析仪进行拍照。
1.3.3 DSC法测定样品的THA
采用DSC法测定南极磷虾AFPs的THA，以BSA为对照。参照Ding Xiangli等[20]的方法稍作改动。将10 μL质量浓度为1.0 mg/mL的南极磷虾AFPs密封于铝制坩埚中，放置在样品池中央，以空铝皿为参比。设备稳定后，以1.0 ℃/min的升降温速率从室温降温至-30 ℃，然后升温至20 ℃，再降温至-30 ℃，获得南极磷虾AFPs的熔融焓（ΔHm）和熔点（Tm）。接着，从-30 ℃缓慢升温至样品体系为固液混合物状态，称为保留温度（Th），停留5 min，使冰晶完全孵化，再将温度从Th降低至-30 ℃，重复上述过程，在不同的Th下停留5 min。记录不同Th下，样品结晶的起始温度（T0）和结晶焓（ΔHf）。按照公式（1）和（2）计算样品的THA和冰晶含量。
1.3.4 DSC法测定THA条件的优化
参照文献[10]，考察DSC法测定南极磷虾AFPs的THA影响因素，优化其评价条件以获得最佳的测定条件。
1.3.4.1 升降温速率对THA评价的影响
分别选取升降温速率为0.50、0.75、1.00、2.50、5.00 ℃/min，南极磷虾AFPs质量浓度为1.0 mg/mL，以PBS为缓冲体系开展实验。以THA为评价指标，考察升降温速率对南极磷虾AFPs的THA的影响。
1.3.4.2 南极磷虾AFPs质量浓度对THA评价的影响
分别选取南极磷虾AFPs质量浓度为0.1、0.5、1.0、2.5、5.0 mg/mL，升降温速率为1 ℃/min，以PBS为缓冲体系开展实验。以THA为评价指标，考察南极磷虾AFPs质量浓度对THA评价的影响。
1.3.4.3 冰晶含量对THA评价的影响
采用DSC法测定THA时，冰晶含量与Th有着密切的关系，Th越接近平衡熔点，冰晶含量就越小。因此，分别选取-2.3～-3.0 ℃间不同的Th，南极磷虾AFPs质量浓度为1.0 mg/mL，升降温速率为1 ℃/min，以PBS为缓冲体系开展实验。以THA为评价指标，考察冰晶含量对THA评价的影响。
1.3.4.4 缓冲体系对THA评价的影响
将南极磷虾AFPs分别溶解于水、PBS、Tris-盐酸不同的缓冲体系，并以BSA为对照，南极磷虾AFPs质量浓度为1.0 mg/mL，升降温速率为1 ℃/min开展实验。以THA为评价指标，考察缓冲体系对THA评价的影响。
2 结果与分析
2.1 SDS-PAGE对南极磷虾AFPs分子质量及纯度的鉴定
图1 南极磷虾AFPs的SDS-PAGE图
Fig. 1 SDS-PAGE profile of AFPs
通过SDS-PAGE对南极磷虾AFPs的分子质量及纯度进行鉴定，由图1可知，样品呈现单一条带，无其他杂带。结果表明，所提取的南极磷虾AFPs具有较高的纯度，分子质量约为76 kDa。
2.2 南极磷虾AFPs的THA
由图2和表1可知，AFPs由完全结冰被加热到不同的保留温度Th，从不同Th开始降温时，已融化的部分没有立即结冰，而是出现了冰点的滞后现象，Th与T0之间相差较大，这表明南极磷虾AFPs具有THA。而BSA从不同Th开始降温时，已融化的部分立即结冰，Th等于T0，没有出现冰点的滞后现象，即BSA没有表现出THA。因此，DSC法可以用于测定南极磷虾AFPs的THA。冰晶含量为11.02%时，南极磷虾AFPs的THA为1.76 ℃。
由图2A和表1也可知，随着Th的升高，冰晶含量不断的下降，南极磷虾AFPs的THA呈现升高趋势，Th为-2.60 ℃时，冰晶含量为5.79 %，THA达到了2.74 ℃，此时的THA可能是由于过冷现象造成的。冰晶结晶过程中，是以体系中已含有的冰晶为冰核开始结晶，体系中冰晶含量越少，冰晶表面AFPs的吸附覆盖程度越高，AFPs抑制冰晶继续生长的作用就越强，其溶液完全结晶所需的时间就越长，测得的THA也就越高[21]。但若AFPs溶液中任意一个区域内都没有形成至少一个足够大的冰核，此时水分子无法包围着晶核结冰，使得溶液出现过冷现象，从而造成冰点比熔点低很多，但此时所测定的冰点并没有真实地反映南极磷虾AFPs的THA。
图2 AFPs与BSA的DSC热流曲线
Fig. 2 DSC curves of partially melted AFPs and BSA
表1 AFPs与BSA的Th、T0、冰晶含量和THA
Table 1 Hold and onset temperature (Th and T0), ice fraction and THA of AFPs and BSA
2.3 DSC法测定THA的条件优化
DSC法是一种热分析方法，能够通过测定升、降温过程中热焓的变化直接反映样品冰点与熔点之间的差异，获得其THA。这种方法避免了直接观察法容易引入人为误差的缺陷[21]。但是由于AFPs来源和特性的不同，采用DSC法测定AFPs是的THA时，可能受到一些因素的影响，如样品质量浓度、升降温速率、冰晶含量和缓冲体系等的影响。因此，需要对其评价条件进行优化[22-23]。
2.3.1 升降温速率对THA的影响
图3 不同升降温速率下AFPs的DSC热流曲线图
Fig. 3 DSC curves of AFPs at different cooling rates
从图3中可以看出，除过冷状态，当升降温速率为5.00 ℃/min时，THA都超过2 ℃。如图3A所示，Th为-2.30 ℃，THA为2.92 ℃；当升降温速率为2.50 ℃/min时，THA在2.00 ℃左右；而当升降温速率为1.00、0.75、0.50 ℃/min时，如图3F所示，THA都稳定在1.70 ℃左右。因此，当升降温速率较快时，THA呈现被升高状态，这可能是由于过高的升降温速率使得体系的换热不充分，冰晶冻结的滞后现象被放大[11]，热流曲线图上的表现为在-10 ℃以下，体系依然处于结晶状态。
当升降温速率为0.50～1.00 ℃/min时，样品结晶时放热处于相对正常的范围，体系换热充分。因此，能够测得相对稳定的南极磷虾AFPs的THA。但升降温的速率过低，耗时太长，因此，选择1.00 ℃/min作为升降温速率较为合适。这也与多数研究中选择的升降温速率相吻合[24-26]。
2.3.2 样品质量浓度对THA的影响表2 不同质量浓度AFPs的Th、T0、冰晶含量和THA
图4 不同质量浓度AFPs的DSC热流曲线图
Fig. 4 DSC curves of AFPs at different concentrations
表2 不同质量浓度AFPs的Th、T0、冰晶含量和THA
Table 2 Th, T0, ice fractions and THA of AFPs at different concentrations
由图4和表2可知，随着南极磷虾AFPs质量浓度的增加，THA先快速升高；当样品质量浓度达到1.0 mg/mL后，THA的变化趋向于平稳，THA的增量收窄。因此，南极磷虾AFPs的THA在一定的范围内呈质量浓度依赖关系。其他研究也表明，部分AFPs的THA具有质量浓度依赖性，THA不仅需要AFPs分子吸附于冰晶上，还需要溶液中有自由AFPs分子的存在[27-30]。基于吸附抑制机理可知，AFPs吸附于冰晶的部分表面，而非整个表面，以一种类似网状结构形式存在，AFPs分子彼此之间存在一定的间隔[31-33]。AFPs会改变冰水界面的局部表面张力，干扰其所覆盖的冰晶生长，使得其所覆盖区域的冰晶生长受到抑制，而其他区域不受抑制[34]。当所吸附的AFPs彼此之间的平均间隔等于或小于两倍的冰晶冰峰临界曲率半径时，冰晶的生长就会受到抑制。因此，如果AFPs的质量浓度过低，形成的网状结构AFPs分子之间的距离过大，冰晶生长的抑制效果就会较差，THA表现的较低。
目前的研究也表明，在某些AFPs（如鱼类AFPs）中，THA与AFPs分子和冰晶面的结合速率以及其质量浓度密切相关，THA在一定的质量浓度范围内呈依赖关系，通常与AFPs质量浓度的平方根成正比[1,30,35]。而对于高活性AFPs（如昆虫AFPs），其能够与冰晶的基面结合[36-37]，当将吸附了AFPs分子的冰晶周围环境的AFPs除去后，THA依然保持不变，这表明，其THA不直接依赖于溶液中的AFPs的质量浓度，而与AFPs分子在冰晶面上的表面密度相关[1,34,38]。
2.3.3 冰晶含量对THA的影响
研究表明，冰晶的含量与粒径会对THA产生影响[39-40]。当冰晶的含量和粒径足够小时，冰晶所吸附的AFPs的数量很少。因此，当THA评价时剩余样品溶液中AFPs的质量浓度保持相对稳定，若冰晶含量或粒径过大，剩余样品溶液中AFPs的质量浓度因大量吸附而降低，AFPs在冰晶表面的吸附度会降低，这将导致THA的降低[27]。采用传统方法或者纳升渗透压计法测定AFPs的THA时，体系中都是仅保留一个冰晶，通过显微镜观察冰晶的生长情况，以获得样品的THA，尽量降低冰晶含量和粒径对THA的影响，存在人为误差。采用DSC法测定时，虽然无法直接观察到冰晶的情况，但可以通过计算（公式2）获得样品中的冰晶含量。
图5 不同Th下样品的冰晶含量与THA间的关系
Fig. 5 Relationship between ice crystal fraction and THA of AFPs at different Th
先前的研究指出，冰晶含量在0.13%～10.00%间，THA与冰晶含量呈现幂指数函数的增长关系[40]，而当冰晶含量在10%～90%时，THA就会呈现相对稳定的数值[11,20]。由图5可知，当冰晶含量低于4%时，出现样品的过冷现象，即样品在零下十几度才会出现结晶现象，不能将其用于真实THA的计算。相反，当冰晶含量高于20%时，样品立刻结冰，检测不到THA；冰晶含量在4%～20%之间时，THA呈现下降趋势；冰晶含量为4%～10%之间时，THA普遍超过2 ℃，这可能是由于部分过冷造成；冰晶含量在10%～15%之间时，THA最为稳定，在1.7 ℃附近波动；随着冰晶含量的继续升高，THA开始降低。因此，冰晶含量应在10%～15%之间，这也与Ding Xiangli等[20]的研究结果相近。
2.3.4 缓冲体系对THA的影响
图6 不同缓冲体系中南极磷虾AFPs和BSA的DSC热流曲线图
Fig. 6 DSC curves of AFPs and BSA in different buffer systems
1～5.分别代表AFPs的水溶液、BSA的PBS溶液、AFPs的PBS溶液、BSA的Tris-盐酸溶液、AFPs的Tris-盐酸溶液，缓冲液的pH值都为7.8。
表3 不同缓冲体系AFPs样品与BSA的Th、T0、冰晶含量和THA
Table 3 Th, T0, ice fractions and THA of AFPs and BSA in different buffer systems
注：1～5.分别代表AFPs的水溶液、BSA的PBS、AFPs的PBS、BSA的Tris-盐酸溶液、AFPs的Tris-盐酸溶液，缓冲液的pH值都为7.8。
采用了不同的缓冲体系，如Tris-盐酸缓冲液（pH 8.0）[41]、PBS（pH 7.4）[24]开展相关实验。不同缓冲体系对南极磷虾AFPs THA的影响如图6和表3所示。BSA无论在任何缓冲体系中都没有表现出THA，南极磷虾AFPs在水中的THA仅为0.08 ℃，在pH值都为7.8的PBS缓冲液和Tris-盐酸缓冲液，THA较为接近，分别为1.62、1.67 ℃，这表明不同缓冲体系能够影响AFPs的THA。
研究表明AFPs的冰晶结合位点是相对疏水的，将AFPs溶解于水中，其冰晶结合位点可能无法完全展开，活性因此受到抑制，引起THA的下降[42-43]。此外，低分子质量的溶质以及盐离子可能也会对THA造成影响[44-49]，通常，能够将AFPs的THA提高数倍[44]，如Xu Yao等[29]将AFP-Ⅲ样品分别溶于水和0.5 mol/L的柠檬酸钠溶液，溶于水中的AFP-Ⅲ样品的THA呈线性下降。即使是同一种缓冲液，体系pH值的影响也较大，如Tris-盐酸缓冲液，体系pH值为7.2[50]、7.5[51]、8.0[41]等，但都为偏碱性的条件。盐离子及pH值对南极磷虾AFPs的THA的确切影响，在后面的实验中将会重点考察。
3 结 论
本实验以纯化的南极磷虾AFPs为研究对象，采用DSC法评价了影响其THA的因素。研究结果表明，南极磷虾AFPs的分子质量约为76 kDa，THA为1.76 ℃。优化确定DSC法评价南极磷虾AFPs的THA升降温速率为1.00 ℃/min，样品质量浓度为1.0 mg/mL，冰晶含量为10%～15%之间。此外，缓冲体系对THA也有较大的影响，通常选择偏碱性的缓冲溶液体系。盐离子含量、种类及体系pH值等对南极磷虾AFPs的THA影响仍待后续深入研究。
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