杀菌是保障食品质量安全、延长货架期、维护市场稳定的重要手段。21世纪以来，随着经济社会的发展，人们对食品安全的要求越来越高，绿色、安全、有效的杀菌工艺成为食品工业发展的重要方向之一[1]。根据作用方式不同，杀菌可以分为化学杀菌和物理杀菌两种，化学杀菌主要采用山梨酸、苯甲酸、亚硝酸盐等抑菌剂或杀菌剂，虽然效果好，却容易对消费者造成急性或慢性的潜在危害。物理杀菌又分为热杀菌和非热杀菌，前者主要采用65～120 ℃温度处理杀死细菌营养体，在食品产业中应用广泛[2-3]，但是过高的温度可能会对食品品质和风味造成影响；后者则主要采用辐照、微波、超声波、高密度二氧化碳等方法使细胞破裂或蛋白质变性，达到杀菌的目的，具有方便快捷、安全无污染等特点，是目前食品杀菌的研究重点[4]。
化学和非热物理杀菌都可以实现永久性灭活食品中细菌的营养体和繁殖体，但对抗逆性极强的芽孢则效果较差。芽孢是细菌生长发育后期为应对恶劣生存环境而形成的一种休眠体，具有极强的抗热（营养体的104 倍）、抗辐射（营养体的103 倍）和抗酸碱等能力[5-6]。普通方法无法完全杀灭芽孢，不利条件消除后其可重新成为营养体，这是导致非高温灭菌食品腐败的主要原因。因此，如何有效杀灭细菌芽孢是食品保质保鲜的重要课题。已有研究表明，芽孢萌发后其抗性能力立即消失，可被常规手段杀灭，因此，促进芽孢萌发，降低抗逆性是目前杀灭芽孢、保障食品安全的有效途径[7]。超声作为一种非热杀菌技术，具有能耗低、食品品质损伤小、绿色友好等优点，是近年来快速发展的杀菌技术之一。它主要是借助超声过程中的空化效应[8]，使受体某一区域形成局部负压区，并产生空穴或气泡，当这些空穴或气泡突然闭合时产生激波，在局部微小区域内产生巨大的压强，导致一系列物理和化学反应的发生，从而达到杀菌的目的[9-10]。众多国内外学者都证实了超声技术良好的杀菌效果[11-15]，但是将超声技术用于芽孢萌发与杀灭的研究还鲜见报道。
本实验以枯草芽孢杆菌为研究对象，研究超声和热处理、化学诱导剂等对芽孢萌发和杀灭的协同作用，旨在探究非高温条件下芽孢灭活的新方法，以期降低热杀菌温度，减少化学防腐剂的添加，为食品杀菌工艺的发展提供有效依据。
1 材料与方法
1.1 菌种、试剂与培养基
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）（冻干菌种，编号：20622） 中国工业微生物菌种保藏中心；L-丙氨酸 北京博奥拓达科技有限公司；肌苷国药集团化学试剂有限公司；2,6-吡啶二羧酸（2,6-pyridinedicarboxylic acid，DPA） 北京伊诺凯科技有限公司；溶菌酶 北京博奥拓达科技有限公司；大蒜、生姜精油 天津春发生物科技有限公司；乳酸链球菌素（Nisin） 洛阳奇泓生物科技有限公司；胰蛋白胨大豆琼脂 青岛高科园海博生物技术有限公司；普通营养肉汤培养基、平板计数琼脂 北京陆桥技术有限责任公司；促芽孢生长培养基（在上述普通胰蛋白胨大豆琼脂培养基中加入一定量的MnCl2，使培养基中Mn2+的质量浓度为50 mg/L，调整pH 7.0～7.2，灭菌，备用）。
1.2 仪器与设备
JY92-ⅡDN型超声波破碎仪 宁波新芝生物科技股份有限公司；GI54DWS全自动高压灭菌锅 美国致微公司；KBF115恒温恒湿箱 德国宾德公司；AB2-6S1型生物安全柜 新加坡艺斯高科技有限公司；Sorvall LYNX 4000高速落地离心机 美国赛默飞世尔科技公司。
1.3 方法
1.3.1 枯草芽孢杆菌芽孢培养和悬液制备
将冻干菌种用营养肉汤培养基活化3 代后，接种于斜面促芽孢生长培养基，（35±1）℃条件下培养5 d，之后室温培养2 d，碱性复红染色，镜检，当产芽孢率达到90%～95%时，用接种环和无菌去离子水将试管斜面上的芽孢洗涤并收集到离心管中，重复冲洗菌苔两次，一并收集到离心管中。（80±1）℃水浴10 min，杀死营养体，6 000 r/min离心15 min，弃去上清液，用无菌蒸馏水溶解制成芽孢悬液，调整芽孢浓度为108～109 CFU/mL，4 ℃冰箱保存，一个月内使用[16]。
1.3.2 单一因素对芽孢的诱导杀灭作用
将1.3.1节制备得到的芽孢悬液稀释到1.0×107 CFU/mL，参照文献[17-19]的方法，按照表1所示的添加水平对芽孢悬液进行处理，探究不同单一因素用于芽孢萌发时的最适水平，比较不同方式对芽孢萌发的影响。
表1 单一因素对芽孢诱导杀灭的作用条件
Table 1 Effect of single factors on the induction and inactivation of spores
注：AGFK. L-天冬酰胺、D-葡萄糖、D-果糖、KCl 4 种试剂的组合。
1.3.3 超声协同热处理对芽孢的诱导杀灭作用
分别在40、60 ℃和80 ℃条件下，对稀释过的芽孢悬液（1.0×107 CFU/mL）施加频率25 kHz，功率100、300、600 W和900 W的超声处理。时间15 min，期间每工作2 s停歇1 s，探究超声协同热处理对芽孢的诱导作用。
1.3.4 超声协同诱导剂对芽孢的诱导杀灭作用
试验设计如表2所示，分别探究超声与DPA、L-丙氨酸+肌苷、AGFK、溶菌酶的协同作用。其中，DPA的添加浓度为6 mmol/L，L-丙氨酸和肌苷的添加浓度分别为50 mmol/L和6 mmol/L，溶菌酶的添加浓度为10 mmol/L，AGFK的添加浓度分别为L-天冬酰胺10 mmol/L、D-葡萄糖10 mmol/L、D-果糖10 mmol/L和KCl 50 mmol/L。温度60 ℃，超声时间15 min，期间每工作2 s停歇1 s，探究超声协同诱导剂对芽孢的诱导杀灭作用。
表2 超声与诱导剂协同作用对芽孢诱导杀灭的作用条件
Table 2 Synergistic effect of ultrasound and inducer on the germination and inactivation of spores
1.3.5 超声功率梯度式变化对芽孢的诱导杀灭作用
调整超声功率的变化梯度，探究不同梯度模式下超声对芽孢萌发和杀灭的作用效果。试验条件如表3所示，其中，L-丙氨酸和肌苷的浓度分别为50 mmol/L和6 mmol/L，温度60 ℃，各功率条件下均处理3 min，每工作2 s停歇1 s。
表3 超声功率变化对芽孢诱导杀灭的作用条件
Table 3 Decreasing gradients of ultrasonic power for spore germination and inactivation
1.3.6 芽孢的诱导杀灭效果评价
将处理后的芽孢悬液立即置于（80±1）℃水浴中保温15 min，随后移入冰水浴中迅速冷却，用移液枪分别吸取1 mL芽孢悬液，加入平板培养皿中，倾注约15～20 mL的培养基，摇匀，37 ℃下培养48 h[20]。以芽孢萌发率表示不同处理下的诱导杀灭效果，按下式计算。
式中：N0为未经任何处理的菌浓度/（CFU/mL）；N为经过超声或诱导剂处理后，芽孢悬液经过80 ℃水浴杀死萌发的营养体后，在平板计数培养基上培养的可见菌浓度/（CFU/mL）。
1.4 数据分析
应用Excel 2010和SAS/PC（9.2）软件对实验结果等进行均值差异显著性检验，方差分析中的多重比较项采用新复极差法（S-N-K）法，分组显著性水平0.05。
2 结果与分析
2.1 单一因素对芽孢的诱导杀灭效果比较
图1 不同诱导方法芽孢萌发效果
Fig. 1 Effects of different induction methods on spore germination
由图1可知，热处理、L-丙氨酸+肌苷、AGFK、Nisin和生姜精油等用于芽孢诱导时，芽孢萌发率均小于30%，说明这些诱导方法并无明显诱导作用，无法刺激芽孢大量萌发。而溶菌酶、大蒜精油对芽孢有一定的诱导作用，其中溶菌酶的最适添加水平为10 mmol/L，对应的芽孢萌发率为52.17%；大蒜精油的最适添加水平为20 mmol/L，对应的芽孢萌发率为45.63%。两种方法的萌发率都没有超过60%，说明这些方法虽然可以实现芽孢的部分萌发，但仍不能满足大量萌发的需要，无法得到有效的杀菌效果。超声或添加DPA则得到了较好的诱导效果，其中，超声功率的最佳水平为600 W，可以杀灭62.94%的芽孢；而DPA的最适添加水平为12 mmol/L，芽孢萌发能够达到99.45%，可以实现体系内大部分芽孢的萌发和杀灭工作。但是，考虑到食品的可食性和安全性，本研究选择以超声为基础，辅以其他诱导剂协同作用，进一步探究中温环境下提升芽孢萌发率的方法，实现杀灭大量芽孢的需要，延长食品货架期的同时避免对食品安全和品质造成负面影响。
2.2 超声协同不同诱导方法对芽孢的致死效果
经过以上不同方法的单一诱导研究，确定了以超声技术为基础的芽孢杀灭方法。在此基础上，设计比较了超声技术和热处理、超声技术和不同诱导剂组合以及超声功率的不同变化等对芽孢萌发效果的影响，寻找不同条件下超声技术用于芽孢诱导杀灭的最佳效果。
2.2.1 超声协同热处理对芽孢的诱导杀灭效果
热处理温度设置为40、60、80 ℃，探究不同温度下超声功率的变化对芽孢致死率的影响，结果如图2所示。3 种温度处理下的芽孢萌发率均随着超声功率的提高呈现出先升后降的趋势，其中，40 ℃处理时，在600 W达到最高，最高萌发率为59.85%；60 ℃和80 ℃处理时均在300 W达到最高，最高萌发率分别为64.24%和63.12%。整体上，实验得到的3 种最佳条件下的杀菌率并无显著差异（P＞0.05），且均未超过65%，但是可以证明超声和热处理协同作用下对枯草芽孢杆菌芽孢有一定的杀灭作用，对比之下选择60 ℃作为芽孢萌发诱导的热处理条件。
图2 超声和不同温度协同作用对芽孢萌发率的影响
Fig. 2 Effect of ultrasonic power combined with different temperatures on spore germination
2.2.2 超声协同不同诱导剂对芽孢的诱导杀灭效果
在上述研究的基础上，将超声技术与常用的芽孢萌发诱导剂DPA、L-丙氨酸+肌苷、AGFK和溶菌酶复合使用，设定功率分别为100、300、600 W和900 W，频率25 kHz，温度60 ℃，处理时间15 min，工作2 s，停歇1 s。探究不同的使用功率下，超声与不同诱导剂协同作用的效果，结果如图3所示。
图3 超声功率和不同诱导剂协同作用对芽孢萌发率的影响
Fig. 3 Effect of ultrasonic power combined with different inducers on spore germination
超声技术与DPA共同作用时，虽然芽孢萌发率很高，但是超声功率的变化对萌发率并无显著影响（P＞0.05）；超声技术与L-丙氨酸+肌苷协同作用时，随着超声功率的提高，芽孢萌发率有着显著的升高（P＜0.05），尤其功率大于300 W以后，芽孢的萌发率超过了95%，最高达到了98.23%；与AGFK或溶菌酶协同作用时，芽孢萌发率随着功率的提升也有改善，但是都没有超过85%，与AGFK协同作用最高为84.67%；而与溶菌酶协同作用时最高为77.71%。
经过不同方法的对比与筛选，最终确定超声处理和L-丙氨酸+肌苷的复合作用诱导芽孢萌发能获得不错的效果，其萌发率能够达到98%以上，且不同于传统采用DPA为诱导剂，超声联合丙氨酸和肌苷共同作用不仅能够有效实现芽孢萌发，降低热致死温度，而且对食物安全和风味影响较小，可以有效延长食品货架期，实现非高温杀菌产品的长时间贮存。
2.3 超声处理模式对枯草芽孢杆菌芽孢的诱导杀灭效果
采用温度60 ℃，L-丙氨酸+肌苷为诱导剂，对芽孢悬液进行梯度式超声处理，探究不同超声处理模式对芽孢萌发的影响，处理结果如图4所示。
图4 超声功率的梯度变化对芽孢萌发的影响
Fig. 4 Effect of variation in ultrasonic power on spore germination
100 W-300 W-600 W-900 W的功率递增模式与功率恒定模式相比，芽孢萌发并无改善，其得到的萌发率为80.25%；采用600 W-100 W-300 W-900 W和300 W-600 W-100 W-900 W的超声模式，相比递增模式效果较好，芽孢萌发率分别为85.94%和87.40%；而采用900 W-600 W-300 W-100 W的递减功率则有最好的诱导效果，芽孢萌发率可以达到94.86%，可以实现芽孢的大量萌发。对比不同的超声模式可知，相比其他模式，采用超声功率由高到低的递减模式具有更好的促萌发效果，可以有效用于体系内芽孢的杀灭工作。
3 讨 论
不同方法在诱导芽孢萌发时的效果有很大差异，这主要与诱导剂对芽孢的作用位点和受体敏感度有关。通常情况下细菌的基因组有多个受体操纵子，这些能形成孢子的细菌往往通过多种受体响应不同类型的萌发剂。如枯草芽孢杆菌中gerA是产芽孢细菌类中第一个被描述的操纵子，其同源基因编码孢子膜上有3 个相关蛋白：GerAA、GerAB、GerAC，这3 个蛋白在芽孢中相互作用并形成一个受体复合物GerA，是L-丙氨酸的受体之一，这3 个蛋白中任何一个组分的失活都会影响整个受体的功能。同理，由gerB和gerK编码的GerB和GerK等则是AGFK和葡萄糖的受体[21-22]。正是这些诱导剂对应着不同的芽孢受体，所以在芽孢萌发过程中，受限于诱导剂的类型、穿过孢子衣时的信号强弱以及受体的种类和完整性等，不同诱导剂的诱导效果会有很大差异。王一晓[23]在实验中尝试比较了L-丙氨酸、肌苷、D-葡萄糖和十二铵等不同类型的诱导剂对芽孢萌发的诱导效果，结果表明，DPA的诱导效果较好，L-丙氨酸和肌苷次之，葡萄糖等效果最差，这与武玉艳[24]、Corthouts[25]等的研究结果相近。从本研究中不同诱导方法的杀灭效果也可发现：L-丙氨酸+肌苷、AGFK、大蒜精油、生姜精油的诱导效果较差，原因可能是仅仅靠自身的分子运动，单一的营养素诱导剂难以通过芽孢衣和皮层达到对应的受体位点，加上受体位点少或缺失，致使芽孢萌发率很低。而溶菌酶、DPA促进芽孢萌发是非生理性的，尤其DPA是芽孢萌发时自身释放的重要成分，对于引起后续折光性消失，促进皮层水解和水分进入起到重要作用；因此外源添加DPA是目前效果最好的芽孢诱导方法。溶菌酶则是通过水解芽孢衣和皮层，促进水分子进入引导芽孢萌发，因而受到芽孢抗性、酶活力和添加量影响较大，效果并不稳定。
超声杀菌主要是借助声波产生的空化效应，在受体局部区域形成反差巨大的正负压区，巨大的压强变化产生一系列物理和化学反应，能够有效杀灭一般细菌。Ha[26]、Khanal[27]、谭海刚[28]等分别在实验中探究了超声技术用于大米、牛乳以及菌悬液等环境下的杀菌效果，但是只有少数人将超声用于食品体系中芽孢的萌发与杀灭，并取得较好的效果。其中Khanal等[27]采用5 000 W、20 kHz的超声条件结合巴氏杀菌（63 ℃，30 min）收到了较好的结果，芽孢的杀灭率达到了6 个数量级。而本研究中，借助超声频繁的压力变化改变芽孢内膜蛋白的理化性质，影响膜的通透性，从而使水分子进入，同时破坏芽孢衣的结构，增加受体蛋白与营养素的接触几率，促进萌发机制启动，达到杀灭芽孢的目的，这与Rao Lei[29]、Spilimbergo[30]、Aouadhi[31]等的研究理论相近。通过本研究中超声和不同诱导剂协同作用结果也可以看出，L-丙氨酸+肌苷、AGFK和溶菌酶在超声作用下，都能使芽孢萌发率得到显著提升，这是超声作用改变内膜通透性，增加了诱导剂与受体位点的接触机会带来的结果。而探究超声与热处理复合作用时，同一温度下，芽孢的萌发率随着超声功率的升高呈现出先升后降的趋势，原因可能是一定功率下，超声作用产生的物化反应促进了芽孢内膜的变化，促进了芽孢的萌发，但当功率过大时则会形成大量的空穴或气泡，既不利于热量和水分的传递，也会使芽孢产生局部聚集，耐受性增强，因而降低了芽孢的萌发效率。因此通过图3所示的模式筛选，调整超声功率的输出模式，开始采用大功率超声，有效提升体系温度，并快速改变芽孢内膜的通透性，随后逐渐降低输出功率，适当减少空穴和气泡，促进营养素诱导剂的转运，提高其与芽孢内膜的接触机会，达到了提升萌发率的效果。
4 结 论
本研究以枯草芽孢杆菌为研究对象，探究超声、热处理和不同诱导剂促进芽孢萌发的最适条件。结果表明：1）通过不同方法的对比分析，确定超声处理和DPA为最佳的诱导处理方法，考虑到实际应用时的安全性和可食性，确定超声为基础、辅以其他方法的诱导模式。2）比较超声与热处理、诱导剂等协同作用于芽孢的诱导结果，最终确定采用超声功率600 W、L-丙氨酸和肌苷浓度分别为50 mmol/L和6 mmol/L、温度60 ℃的复合诱导模式，芽孢萌发率能够达到98.23%，实现芽孢的大量萌发和杀灭；3）进一步对比不同超声模式，确定采用功率递减的900 W-600 W-300 W-100 W的处理方法能够有效提高芽孢萌发时的处理效率，为减少热损伤和化学试剂的使用、延长产品货架期、保障食品安全和食用品质提供了理论依据。
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