热处理对大豆11S球蛋白表面疏水性的影响及拉曼光谱分析

齐宝坤 1 ,赵城彬 2 ,江连洲 1 ,徐 靓 1 ,李 红 1 ,李 杨 1, *

(1.东北农业大学食品学院,黑龙江 哈尔滨 150030;2.吉林农业大学食品科学与工程学院,吉林 长春 130118)

摘 要: 研究热处理对大豆11S球蛋白表面疏水性(H 0 )的影响,并对蛋白质拉曼光谱进行分析。随着热处理时间的延长,在80 ℃热处理下,大豆11S球蛋白的H 0 增加,二级结构中α-螺旋结构转变为β-转角和无规卷曲结构。在90 ℃和100 ℃热处理下,H 0 先增加后稍有降低,且100 ℃热处理下H 0 变化地更快,且变化程度更大,α-螺旋和β-折叠结构转变为β-转角和无规卷曲结构。此外,热处理会使蛋白分子中的酪氨酸和色氨酸残基趋于“暴露”态,同时改变11S球蛋白分子间二硫键的振动模式,使二硫键由g-g-g构型转变为t-g-t构型,这可能会导致蛋白质H 0 的升高。

关键词: 热处理;大豆11S球蛋白;表面疏水性;拉曼光谱

表面疏水性是用来表征蛋白质分子表面疏水基团与蛋白质外部极性溶液环境结合数目的一个指标,也是衡量分子间相互作用强弱的重要参数,对于蛋白质其他功能特性具有重要影响 [1] 。蛋白质表面疏水性也会受到一些因素的影响,如蛋白质自身的理化性质、空间结构、蛋白质生产加工条件等 [2] 。大豆11S球蛋白是一种具有不均匀性的寡聚蛋白,由酸性多肽链(A亚基,分子质量350~370 kDa)和碱性多肽链(B亚基,分子质量约20 kDa)构成 [3] 。由于11S球蛋白具有紧密的分子结构,多数活性基团被包裹在球状结构的内部,这是限制大豆蛋白在食品中应用的关键因素 [4] 。近年来,热处理对大豆蛋白功能特性的影响一直是大豆蛋白研究领域的热点之一。热处理温度和时间等因素对蛋白质的功能性质及分子结构具有重要影响,可以通过调整热处理条件控制蛋白质的聚集程度,从而控制蛋白质的功能性质 [5] 。拉曼光谱作为一种新技术,广泛应用于蛋白质空间结构的研究中,它可以通过鉴别蛋白质结构特征峰的变化,得到蛋白质分子多肽链骨架构型改变的信息和分子侧链微环境变化的信息 [6] 。目前,已有不少研究以大豆11S球蛋白为对象,探讨热处理过程中蛋白质的结构变化及聚集行为。Marcone等 [7] 利用傅里叶变换红外光谱法研究热处理对大豆11S球蛋白结构的影响,指出酰胺I带1 635 cm -1 处红外光谱峰强度的增加,表明大豆11S球蛋白在热聚集过程中分子间维持β-折叠的氢键加强。Mill等 [8] 利用核磁共振光谱研究热处理过程中大豆11S球蛋白二级结构的变化,表明当加热温度升高至95 ℃时,大豆11S球蛋白富含谷氨酰胺和谷氨酸残基的高可变区中具有氢键结构的α-螺旋结构消失。

本研究设计了3 个温度梯度(80、90、100 ℃)对大豆11S球蛋白进行热处理0~90 min,对大豆11S球蛋白表面疏水性进行测定,同时采用拉曼光谱分析蛋白质的分子结构,探究热处理对大豆11S球蛋白表面疏水性和分子结构的影响规律,为改善大豆11S球蛋白表面性质及扩宽其应用范围提供实验支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆(东农46) 东北农业大学大豆研究所;Lowry法蛋白质含量测定试剂盒 上海荔达生物科技有限公司;牛血清白蛋白、8-苯胺基-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalene-sulfonate,ANS) 美国Sigma公司;其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

DK-98-1型电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司;低温高速离心机 美国Beckman公司;FD 5-3型冷冻干燥机 美国SIM公司;AKTA-蛋白质纯化仪美国GE公司;F-4500荧光分光光度计 日本Hitachi公司;Raman Station 400拉曼光谱仪 美国PE公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆11S球蛋白的制备

大豆11S球蛋白的制备根据Nagano等 [9] 的方法。

大豆→脱皮→粉碎→过60 目筛→正己烷脱脂→脱脂大豆粉→与水混合(料液比1∶15(g/mL))→调节pH 7.5→提取2 h→离心分离(10 000×g,15 min)→取上清液→添加亚硫酸钠(0.98 g/L)→提取1 h→调节pH 6.4→4 ℃过夜→离心分离(12 000×g,20 min)→沉淀→冻干→大豆11S球蛋白粗提物

应用AKTA-蛋白质纯化仪和HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade凝胶制备级预装柱,对大豆11S球蛋白粗提物进行纯化,并进一步采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析蛋白质组成,通过光密度扫描测得大豆11S球蛋白纯度约为92%。

1.3.2 大豆11S球蛋白的热处理

将一定量的纯化大豆11S球蛋白溶于50 mL、0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液中,配制成质量分数为2%的蛋白溶液,蛋白质浓度采用Lowry法测定,参比蛋白为牛血清白蛋白。将蛋白溶液分别密封于加热套管中在温控水浴锅中分别进行80、90、100 ℃的热处理,热处理时间分别为10、20、30、45、60、90 min。

1.3.3 表面疏水性的测定

采用ANS荧光探针法测定蛋白质表面疏水性 [10] 。将大豆11S球蛋白样品溶于0.01 mol/L磷酸盐缓冲液中配成10 mg/mL的蛋白溶液,室温条件搅拌1 h后10 000×g离心30 min,上清液用相同的磷酸盐缓冲液稀释至0.07~0.67 mg/mL(采用Lowry法测定蛋白浓度)。分别取不同浓度的样品溶液4 mL,加入8 mmol/L的ANS溶液40 μL,充分振荡混匀后静置3 min,测定样品的荧光强度。激发波长为390 nm,发射波长为470 nm,夹缝宽均为5 nm。以蛋白质浓度为横坐标,荧光强度为纵坐标作图,曲线初始斜率即为蛋白质的表面疏水性(H 0 )。

1.3.4 拉曼光谱的测定

参考张萍等 [11] 的测定方法,将大豆11S球蛋白用缓冲溶液配制成质量浓度为100 mg/mL的溶液进行测定。激发光波长设定为785 nm,激光功率为300 mW,扫描范围400~2 000 cm -1 ,每次扫描时间60 s,积分10 次,4 次扫描进行累加。拉曼图谱处理:谱图基线校正、谱峰查找采用ACD Labs V12软件,以苯丙氨酸((1 003±1)cm -1 )作为归一化因子,以此作为各拉曼峰强度变化的依据,得到不同条件下大豆11S球蛋白的拉曼光谱,采用Raman Spectral Analysis Package Version 2.1软件计算大豆11S球蛋白各结构的百分含量。

1.4 数据统计分析

每个样品重复3 次实验,ANOVA差异显著性分析利用SPSS V17.0软件完成,P<0.05为显著性差异,采用Origin 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 热处理对大豆11S球蛋白表面疏水性的影响

如图1所示,与未经热处理的大豆11S球蛋白相比,不同条件热处理后11S球蛋白的H 0 发生了明显改变。在80 ℃热处理条件下,随着热处理时间的延长,大豆11S球蛋白的H 0 逐渐增加;在90 ℃热处理条件下,H 0 在0~30 min内随着处理时间的延长而增加,之后又逐渐降低;在100 ℃热处理条件下,H 0 在20 min内迅速增加,之后又出现降低。在90 ℃和100 ℃热处理条件下,H 0 具有相似的变化趋势。然而,100 ℃热处理比90 ℃热处理下H 0 变化的更快,且变化程度更大。这与Petruccelli等 [12] 的研究结果相似,证实热处理温度和时间均会影响蛋白质的表面疏水性。

图1 热处理对大豆11S球蛋白表面疏水性(H 0 )的影响
Fig. 1 Effect of heat treatment on surface hydrophobicity (H 0 ) of 11S glycinin

大豆11S球蛋白H 0 的变化与蛋白质变性和热聚集体的形成有关,H 0 的变化可能是由于热处理改变了蛋白质的分子结构以及ANS荧光探针结合位点暴露导致的 [13] 。热处理会改变大豆11S球蛋白分子的空间结构,诱导蛋白分子解折叠展开,使得包埋于球蛋白分子内部的疏水基团外露,ANS荧光探针结合位点增加,从而导致蛋白质H 0 增加。另外,热变性过程中所发生的蛋白质亚基解离及多肽链的裂解也是造成H 0 升高的可能因素 [14] 。当加热温度接近大豆11S球蛋白变性温度和热处理时间达到一定值时,蛋白分子已经基本上达到最大化的伸展,H 0 达到最大值。当温度继续升高或处理时间继续延长时,蛋白质分子吸收热能运动加剧,分子间的接触和交联机会增加,使伸展的亚基和肽链互相靠近,通过疏水相互作用结合成为可溶聚集体 [15] ,使疏水基团重新包裹在蛋白质分子内部,从而导致H 0 略有降低。综上所述,热处理过程中发生的蛋白质分子展开、亚基解离是造成H 0 升高的可能因素,而亚基重新聚合形成不溶性或可溶性热聚集体又会导致H 0 下降。

2.2 热处理大豆11S球蛋白拉曼光谱分析

拉曼光谱中峰位置及强度的变化主要用于分析蛋白质二级结构及疏水微环境。可以根据蛋白质分子结构所指认特征吸收峰的相对强度,即指认吸收峰强度与苯丙氨酸吸收峰强度的比值表示蛋白分子结构变化的定量信息 [16] 。由图2可以看出,大豆11S球蛋白经热处理后苯丙氨酸的吸收峰增强,且C—H键弯曲振动的吸收强度也增加。热处理10 min时吸收峰最强,随着热处理时间的延长,这两处的吸收峰稍有减弱,但是仍强于未经热处理的11S球蛋白。然而,热处理使大豆11S球蛋白拉曼光谱变化最显著的为酰胺I带处吸收峰增强,这与蛋白质主链构象变化有关。大豆11S球蛋白的主链构象主要由拉曼光谱酰胺I带(1 630~1 690 cm -1 )的特征峰确定,酰胺I带主要为多肽链中C=O的伸缩振动,但N—H振动、C—C—N振动和C—N伸缩振动也会引起酰胺I带的微弱变化 [17] 。酰胺I带拉曼特征峰的结构归属普遍认为:α-螺旋结构为1 645~1 658 cm -1 ;β-折叠结构为1 665~1 680 cm -1 ;β-转角结构为1 640~1 644 cm -1 和1 681~1 690 cm -1 ;无规卷曲结构为1 659~1 664 cm -1[18]

图2 不同热处理条件下大豆11S球蛋白的拉曼光谱图
Fig. 2 Raman spectra of 11S glycinin under different heat treatment conditions

2.2.1 主链构象(二级结构)分析

图3 热处理对大豆11S球蛋白二级结构含量的影响
Fig. 3 Effect of heat treatment on secondary structure contents of 11S glycinin

利用Raman Spectral Analysis Package Version 2.1软件分析计算不同热处理条件下大豆11S球蛋白各二级结构含量。由图3A可以看出,在80 ℃热处理下,大豆11S球蛋白分子中α-螺旋结构相对含量随热处理时间的延长逐渐降低,β-转角和无规卷曲结构相对含量随热处理时间的延长逐渐升高,β-折叠结构相对含量没有发生明显改变,这表明大豆11S球蛋白二级结构中α-螺旋结构转变为β-转角和无规卷曲结构。由图3B和图3C可以看出,在90 ℃和100 ℃热处理下,随着热处理时间的延长,大豆11S球蛋白中α-螺旋和β-折叠结构相对含量呈下降趋势,而β-转角和无规卷曲结构相对含量逐渐升高,表明大豆11S球蛋白分子二级结构中α-螺旋和β-折叠结构转变为β-转角和无规卷曲结构。这可能是由于热处理使大豆11S球蛋白分子发生变性,变性的蛋白分子内部氢键遭到破坏 [19] 。80 ℃热处理只破坏了α-螺旋结构中的氢键,对β-折叠中的氢键影响较小。而90 ℃和100 ℃热处理使蛋白质完全变性,α-螺旋和β-折叠结构中的氢键均被破坏,导致α-螺旋和β-折叠结构相对含量降低,并转变为β-转角和无规卷曲结构,这也说明β-转角和无规卷曲结构在新形成的热聚集体中具有重要作用 [20] 。本研究采用拉曼光谱分析得到了与Li Xianghong等 [21] 研究相同的结果,即热处理对大豆蛋白的二级结构具有显著影响,能够使α-螺旋和β-折叠结构转变为β-转角和无规卷曲结构。

2.2.2 氨基酸侧链分析

表1 不同热处理条件下酪氨酸(I 850 /I 830 )和色氨酸(I 760 )的包埋/暴露情况
Table 1 Analysis of buried and exposed tyrosine (I 850 /I 830 ) and tryptophan (I 760 ) residues under different heat treatment conditions

蛋白质拉曼光谱的850 cm -1 和830 cm -1 谱峰是酪氨酸残基的对位取代苯的有关振动,两峰的强度比(I 850 /I 830 )即费米共振线可用来表征酪氨酸残基的包埋与暴露情况 [22] 。由表1可以看出,与未经热处理的11S球蛋白相比,80 ℃热处理时酪氨酸费米共振线(I 850 /I 830 )变化较小,表明酪氨酸残基微环境在80 ℃热处理过程中得以保持。然而,在90 ℃和100 ℃热处理条件下,随着热处理时间的延长,I 850 /I 830 比值增大,这表明热处理破坏了维持蛋白质三级结构的主要作用力,使包埋于大豆11S球蛋白分子内部的酪氨酸残基暴露于分子表面,并作为氢键的供体或受体与水相互作用 [23] 。酪氨酸疏水基团的暴露使蛋白质H 0 增加,这与本实验中热处理对H 0 影响的结果相符(图1)。

拉曼光谱中760 cm -1 附近的谱带归属为色氨酸侧链,吸收峰强度可以反映色氨酸微环境极性的变化。Li-Chan [24] 研究表明760 cm -1 附近区域的拉曼峰强度高低与色氨酸残基的“包埋”和“暴露”有关,热变性造成蛋白质结构的破坏,色氨酸残基由埋藏在分子内部向分子外表面暴露,在拉曼谱图中表现为色氨酸谱带强度(I 760 )降低。由表1可知,与未经热处理的11S球蛋白相比,80 ℃热处理引起760 cm -1 附近区域的拉曼峰强度降低,表明色氨酸残基趋向于“暴露”态。而90 ℃和100 ℃热处理引起760 cm -1 附近区域的拉曼峰强度先降低后稍有升高,表明色氨酸残基先趋向于“暴露”态,而后又趋向于“包埋”态。色氨酸残基的暴露是由于蛋白质发生变性,分子结构展开导致的;而色氨酸残基的包埋可能与热聚集体的形成有关 [25] 。整体来看,色氨酸残基趋向于“暴露”态,色氨酸的暴露也可能是导致蛋白质H 0 增加的一个原因。

2.2.3 二硫键分析

二硫键是维持蛋白质三级结构的主要作用力,在热聚集体形成的过程中可能会发生二硫键的断裂与形成 [26] 。蛋白质拉曼光谱500~550 cm -1 是二硫键伸缩振动的特征频率,一般情况下将500~510 cm -1 附近谱峰归属为g-g-g构型,515~525 cm -1 附近谱峰归属为g-g-t构型,535~545 cm -1 附近谱峰归属为t-g-t构型 [27] 。采用Peak Analyzer软件进行多峰值Guassina拟合,得到不同热处理条件下大豆11S球蛋白二硫键构型相对含量的变化,结果如图4所示。

图4 不同热处理条件下大豆11S球蛋白二硫键构型相对含量的变化
Fig. 4 Conformational change of disulfide bond of 11S glycinin under different heat treatment conditions

由图4可以看出,未经热处理的大豆11S球蛋白中二硫键主要以g-g-g构型为主,这与Przulj等 [28] 发现的天然大豆分离蛋白中g-g-g构型二硫键所占比例最大的结果一致。随着热处理时间的延长,80~100 ℃热处理均会使大豆11S球蛋白二硫键中g-g-g构型的相对含量减少,t-g-t构型的相对含量增加。80 ℃热处理不会改变g-g-t构型的相对含量(图4A),90 ℃热处理使g-g-t构型的相对含量降低(图4B),100 ℃热处理使g-g-t构型的相对含量增加(图4C)。热处理后t-g-t构型成为大豆11S球蛋白二硫键的主要构型。这一发现与Ellepola等 [29] 对大米球蛋白二硫键构型的研究结果相似,其研究表明热处理能够促进蛋白分子间二硫键的形成,导致二硫键由g-g-g构型向t-g-t构型转变。结合H 0 分析可知,二硫键中g-g-g构型可能会阻碍疏水基团的暴露,而H 0 的升高可能与t-g-t构型相对含量的增加有关。

3 结 论

随着热处理时间的延长,80 ℃热处理下大豆11S球蛋白的H 0 逐渐增加,90 ℃和100 ℃热处理下H 0 呈先增加后稍有降低的趋势,且100 ℃热处理比90 ℃热处理下H 0 变化的更快,且变化程度更大。拉曼光谱分析表明,在80 ℃热处理下,大豆11S球蛋白二级结构中α-螺旋结构转变为β-转角和无规卷曲结构。在90 ℃和100 ℃热处理下,α-螺旋和β-折叠结构转变为β-转角和无规卷曲结构。此外,热处理过程中蛋白分子中的酪氨酸和色氨酸残基趋于“暴露”态,这可能会导致大豆11S球蛋白H 0 的升高。热处理能够改变11S球蛋白分子间二硫键的振动模式,使二硫键由g-g-g构型向t-g-t构型转变,H 0 的升高可能与t-g-t构型相对含量的增加有关。

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Effect of Heat Treatment on Surface Hydrophobicity of 11S Glycinin and Raman Spectroscopy Analysis

QI Baokun 1 , ZHAO Chengbin 2 , JIANG Lianzhou 1 , XU Liang 1 , LI Hong 1 , LI Yang 1, *
(1. College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China;2. College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Abstract: The effect of heat treatment on the surface hydrophobicity (H 0 ) of 11S glycinin was researched and its secondary structure was analyzed by Raman spectroscopy before and after heat treatment. As the heat treatment time increased(80 ℃), H 0 was increased and α-helix was transformed to β-turn and random coil structures. At both 90 and 100 ℃, H 0 increased first and then decreased, while it changed faster and more significantly at 100 ℃, and α-helix and β-sheet were transformed to β-turn and random coil structures. Moreover, the tyrosine and tryptophan residues in the protein molecule were exposed after heat treatment. At the same time, the vibration mode of intermolecular disulfide bond in 11S glycinin was changed, transforming the disulfide bond from g-g-g configuration to t-g-t configuration, which may lead to an increase in protein surface hydrophobicity.

Keywords: heat treatment; 11S glycinin; surface hydrophobicity; Raman spectroscopy

QI Baokun, ZHAO Chengbin, JIANG Lianzhou, et al. Effect of heat treatment on surface hydrophobicity of 11S glycinin and Raman spectroscopy analysis[J]. Food Science, 2018, 39(18): 15-20. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201818003. http://www.spkx.net.cn

齐宝坤, 赵城彬, 江连洲, 等. 热处理对大豆11S球蛋白表面疏水性的影响及拉曼光谱分析[J]. 食品科学, 2018, 39(18):15-20. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201818003. http://www.spkx.net.cn

文章编号: 1002-6630(2018)18-0015-06

引文格式:

中图分类号: TS201.2

文献标志码: A

*通信作者简介: 李杨(1981—),男,副教授,博士,研究方向为粮食、油脂及植物蛋白工程。E-mail:liyang@163.com

DOI: 10.7506/spkx1002-6630-201818003

基金项目: “十三五”国家重点研发计划重点专项(2016YFD0401402)

第一作者简介: 齐宝坤(1986—),男,讲师,博士,研究方向为粮食、油脂及植物蛋白工程。E-mail:zhaochengbin66@126.com

收稿日期: 2017-08-13