表1 野生型酶和易错PCR突变酶活性和氨基酸突变
Table 1 GAD activity of the wild-type strain and mutants generated from epPCR
赵云飞，邵泽香，陆兆新，别小妹，赵海珍，张 充，吕凤霞*
（南京农业大学食品科学技术学院，江苏 南京 210095）
摘 要： 为提高巨大芽孢杆菌谷氨酸脱羧酶活性，通过定向进化技术对其进行酶工程改造。经过二轮易错聚合酶链式反应，从13 000 多个突变株中筛选到突变株A5-3、E2-4、E3-11，相对于野生型，其酶比活力提高了157%、115%、97%，且K cat /K m 都有所增大。其中A5-3氨基酸序列发生了2 个突变（A55D和D451E）。三维模拟结果表明，第55位丙氨酸突变为天冬氨酸很可能为酶促反应提供H ＋ ，从而加快酶促反应效率；突变株E2-4第34位由亮氨酸突变成谷氨酰胺，一定程度上改善了酶的热稳定性；突变株E3-11的第325位由丙氨酸突变成丝氨酸有利于蛋白内部形成更多氢键，增大了该部位的柔性，更有利于氨基酸残基之间发生相互作用。圆二色谱分析表明，突变株与野生型具有相似的三维结构，相比于野生酶，突变酶的α-螺旋减少，无规则卷曲增加，说明突变酶刚性有所下降而柔性增加。利用定向进化技术可以明显改善谷氨酸脱羧酶的酶活性，为其工业化的应用提供实验参考。
关键词： 谷氨酸脱羧酶；定向进化；酶活性
谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase，GAD，EC 4.1.1.15）是一种磷酸吡哆醛（pyridoxal 5’-phosphate，PLP）类酶，是生物合成γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的关键酶 [1] 。而GABA作为一种抑制性的神经递质 [2] ，不仅对于人体神经系统的发育、调节血压、治疗精神疾病、抗衰老等诸多方面发挥了重要作用 [3-10] ，而且能够活化肝肾功能，促进生长激素的分泌，具有优良的保健功能 [11-15] ，因而开发含有GABA的功能性 保健品具有非常良好的经济前景。GAD分布广泛，从单细胞有机体到高级哺乳动物有机体中均有GAD，但一般含量很低，无法大规模生产。而利用微生物来源的GAD催化L-谷氨酸钠（L-sodium glutamate，L-MSG）生产GABA，不受资源、环境和空间的限制，这使之成为生产GABA研究的热点。但目前生产GABA的关键酶GAD普遍只能在酸性环境中发挥作用，在酶促反应的过程中不断消耗H ＋ 导致pH值上升，但是由于在偏中性的条件下酶活性低、稳定性差的缺点而难以应用于生产。
为了提高GAD活性，通过蛋白质工程手段对GAD进行酶分子水平的改造是常用的手段。进行蛋白质工程改造主要是对酶分子进行理性设计和非理性设计（定向进化）等 [16] 。最新的研究中，Shi Feng等 [17] 为提高棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）Lb85表达的GAD在偏中性条件下的酶活性，通过易错聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）的条件得到突变株T17I、D294G，能够大幅提高偏中性环境的酶活性；Lin Ling等 [18] 通过对短乳杆菌（Lactobacillus breris）编码的GAD基因进行定向进化，得到突变株Q51H可以提高GAD最适pH值条件下的酶活性。但就目前而言，有关研究GAD分子改造方面的研究甚少，国内外关于利用定向进化技术改造巨大芽孢杆菌谷氨酸脱羧酶的相关研究尚鲜见报道。
本实验室在前期对于GAD的研究中，从土壤中筛选到一株产GABA的菌株，经鉴定为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium），其GAD基因为一段全新的序列，尚鲜见报道。然而该基因表达的GAD活性较低，极大地限制了其在工业上生产GABA的广泛应用。为了提高巨大芽孢杆菌GAD活性，本研究采用易错PCR技术进行蛋白质工程改造，以期可以获得酶活性显著提高的突变体，为GAD可以工业化生产打下基础。
pET30a（＋）-GAD重组质粒由南京农业大学酶工程实验室构建。限制性内切酶SacI与XhoI 大连宝生物公司；2×Taq PCR Mixture、卡纳青霉素、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG） 生工生物工程（上海）股份有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
LB培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L。
5840R冷冻高速离心机 德国Eppendorf公司；UV-2450紫外分光光度计 日本岛津公司；JY98-III超声波细胞粉碎机 宁波新芝科学仪器研究所；PTC-100 TM PCR仪美国MJ Research公司；PowPac TM 高电流电泳仪美国Bio-Rad公司；JS-380C全自动数码凝胶成像仪上海培清科技有限公司。
1.3.1 易错PCR突变文库的构建
以pET30a（＋）-GAD重组质粒为模板进行易错PCR扩增，扩增引物为含有SacI酶切位点（下划线）上游引物（5’-CGAGCTCATGCCTCAATGGCACCCG-3’）、含有XhoI酶切位点（下划线）的下游引物（5’-GCTCGAG TTAATGATGAAATCCATTGTCGTATTTC-3’）。每50 μL反应体系为：5 μL 10×易错PCR缓冲液；14 μL Mg 2＋ （25 mmol/L）；4 μL dNTP（2.5 mmol/L dGTP、2.5 mmol/L dCTP、2.5 mmol/L dATP、2.5 mmol/L dTTP混合溶液）；1 μL上游引物（10 pmol/L）、1 μL下游引物（10 pmol/L）、3 μL MnCl 2 溶液（5 mmol/L）、1 μL质粒模板、Taq DNA聚合酶5 U，最后加入高温灭菌的超纯水至总体积为50 μL。将第1轮易错PCR的有益突变质粒作为新1轮模板进行第2轮的易错PCR。易错PCR程序为95 ℃变性5 min后进行扩增循环，然后95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共循环30 次，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后使用DNA凝胶回收试剂盒进行纯化。纯化的易错PCR产物经限制性内切酶SacI、XhoI进行酶切。酶切后PCR产物经凝胶电泳纯化回收，纯化后的易错PCR产物与同样酶切处理后的pET-30a表达载体进行连接。连接后的连接产物转化进入大肠杆菌BL21（DE3），构建随机诱变文库。
1.3.2 突变体文库的诱导表达
通过易错PCR构建的突变体文库，采用96 微孔板法进行表达。参考Guo Fangfang等 [19] 建立的重组大肠杆菌产天冬酰胺酶的高通量筛选方法，过程稍作修改。筛选方法为：从LB-卡纳青霉素平板上挑取单菌落，接种于96孔板，每孔含有500 μL LB（50 μg/mL卡纳青霉素）培养基，以pET30a（＋）-GAD转化子作为对照；37℃、200 r/min培养12 h后，将50 μL菌液接种于另一含有600 μL LB（50 μg/mL卡纳青霉素）培养基的96孔板中；37 ℃、200 r/min培养至其OD 600 nm 达到0.6～0.8，加入IPTG至终质量浓度为100 μg/mL；16 ℃、200 r/min培养18 h。离心收集菌体，用150 μL质量浓度为1.5 mg/mL溶菌酶的磷酸缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 7）重悬，37 ℃反应30 min，然后反复冻融3 次以达到破碎细胞的目的，4 000 r/min离心10 min后，所得上清液即为粗酶液。
1.3.3 GAD突变体文库的初筛
文库筛选采用Yu Kai等 [20] 公开的高通量筛选方法，筛选在96 孔板内进行，筛选过程作一定的修改以适应实验室条件的需要。在96 孔表达板中，每孔含有200 μL 50 mmol/L的醋酸缓冲液（包含的50 mmol/L溴甲酸紫、0.04 mmol/L的PLP，pH 5），然后向每孔加入10 μL 1 mmol/L的L-MSG磷酸盐溶液（pH 5），混合均匀后，置于45 ℃保温10 min，然后快速向每孔加入10 μL粗酶液，于45 ℃反应15 min，观察每孔内颜色的变化。溴甲酚紫在pH 5.0～6.8的范围内，由黄色变为紫色，如果指示剂的颜色由黄色变成紫色，则表示具有GAD活性，相同时间内颜色变化越明显表示酶活性越高。
1.3.4 酶的表达与纯化
将初筛酶活性显示提高的突变体接种于LB培养基（含50 μg/mL卡纳青霉素）中培养至对数期，按照1%接种量接种于另一LB培养基（含50 μg/mL卡纳青霉素）中，培养至其OD 600 nm 值为0.6～0.8，加入IPTG（终质量浓度为100 μg/mL），16 ℃诱导18 h左右。将培养好的菌体离心，弃掉上清液，用50 mmol/L的PBS（含0.5%的Triton 100，pH 7.0）重悬菌体，超声破碎。破碎液离心取上清液即为粗酶液。重组pET30a-GAD表达过程中蛋白N端带有组氨酸标签，因此使用镍柱对野生型和突变型酶进行纯化。蛋白纯化之后采用Bradford法测定蛋白质浓度 [21] ，纯酶使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）检测并进行酶学性质的分析。
1.3.5 酶活性的测定
取10 μL纯化后的酶液，加入到45℃预热的490 μL底物溶液中（0.2 mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液，含0.04 mmol/L的PLP，100 mmol/L的L-MSG溶液，pH 5）。迅速混匀后在45 ℃反应5 min，反应结束后迅速放入沸水浴终止反应。采用高效液相色谱法测定反应生成的GABA的含量，以测定突变酶的活力。在同样条件下，以野生型GAD的反应作为对照。酶活力单位：在测定条件下每分钟生成1 μmol GABA所需的酶定义为1 个酶活力单位（U）。
1.3.6 酶学性质测定
1.3.6.1 酶促反应的最适温度及温度稳定性
酶促反应最适温度测定：将纯化后的酶液及底物溶液置于20～75 ℃范围内进行反应测定酶活性。温度稳定性的测定：将酶液置于4～55 ℃温度范围内处理12 h，以处理0 h酶活性作为100%，测定残余酶活性。并且将酶液在55 ℃热处理过程中间隔2 h取样，测定野生型及突变酶的半衰期。每次反应在相同条件下设置3 个平行，然后以平均值作为该条件下的酶活性。
1.3.6.2 酶促反应的最适pH值及pH值稳定性
最适反应pH值的测定：设置不同pH值范围的底物溶液（pH 3～6），45 ℃反应5 min测定酶活性。pH值稳定性的测定：将酶液置于不同pH值范围内处理12 h（pH 3～7），测定残余酶活性。
1.3.6.3 酶促反应动力学曲线的测定
在不同浓度的底物溶液（L-MSG浓度5～100 mmol/L），加入过量的纯酶液，最适条件下进行反应，测定GAD的活性，通过Lineweaver-Burk作图法计算K m 和K cat 。
1.3.6.4 三维结构模拟及分析
将野生型氨基酸序列提交到SWISS-MODEL服务器模拟其三级结构。利用PYMOL软件分析氨基酸残基之间的相互作用及突变位点对蛋白质二级结构的影响。
1.3.6.5 突变酶圆二色谱分析
将纯化后的野生型和突变型酶液溶解于10 mmol/L PBS（pH7.0）中，在190～260 nm波长范围内进行全波长扫描。以10 mmol/L PBS（pH 7.0）作为空白，分析野生型与突变型酶蛋白质二级结构的变化情况。
实验数据采用Origin软件进行作图分析，蛋白三维结构模拟需要提交到SWISS-MODEL进行模拟，三维结构模拟结果图像采用PYMOL软件进行处理。
经过两轮易错PCR，库容量达到13 000以上，从结果上来看，有5 株突变体表现出比野生型更高的酶活性（表1）。并且得到酶活性最高的突变体A5-3，酶活性是野生型的3.10 倍，其中氨基酸突变2 个位点，分别为A55D、D451E。
表1 野生型酶和易错PCR突变酶活性和氨基酸突变
Table 1 GAD activity of the wild-type strain and mutants generated from epPCR
将酶活性最高的突变体A5-3、E2-4、E3-11进行蛋白纯化，得到其蛋白酶的比活力，结果见表2。
表2 野生型酶和易错PCR突变酶活性和氨基酸突变
Table 2 GAD activity of the wild-type strain and mutants generated from epPCR
将野生型酶和突变酶表达纯化后，通过SDS-PAGE分析（图1），目的条带均在50 kDa左右，与理论值53 kDa相符。
图1 SDS-PAGE检测结果
Fig. 1 SDS-PAGE analysis of wild-type and mutant enzymes
2.3.1 酶的最适温度及温度稳定性
取10 μL重组酶与490 μL浓度为100 mmol/L的L-MSG混匀，在20～75 ℃反应5 min，然后迅速放入沸水浴中10 min灭活终止反应，结果如图2所示。E3-11最适反应温度与野生型相同，均为45 ℃；而A5-3与E2-4最适反应温度为55 ℃，高于野生型。
图2 野生型酶和突变酶最适反应温度
Fig. 2 Effects of temperature on the activity of wild-type and mutant enzymes
将野生型酶与突变酶置于4～55 ℃保温12 h测定残余酶活性，以没有处理组酶活性作为对照，结果见图3。由图3可知，当温度高于30 ℃后E2-4的残余酶活性高于野生型，A5-3的残余酶活性与野生型大致相当，而E3-11则明显低于野生型。并选择55 ℃研究野生型及突变体的半衰期。
图3 野生型酶和突变酶的温度稳定性
Fig. 3 Thermal stability of wild-type and mutant enzymes
将野生型酶和突变体置于55 ℃保温，每2 h进行取样测残余酶活性，测定野生型和突变体的半衰期。结果见表3。突变体A5-3与野生型温度稳定性无较大变化；E2-4的半衰期为21.92 h，高于野生型，说明稳定性有所改善；而E3-11半衰期为10.81 h，低于野生型，说明E3-11的稳定性有所下降。
表3 野生型酶和突变酶热稳定性
Table 3 Thermal stability of wild-type and mutant enzymes
2.3.2 酶的最适pH值及pH值稳定性
配制不同pH值的底物-缓冲液溶液（pH 2～6），测定在不同pH值条件下GAD的活性，结果如图4所示。突变体E2-4与野生型的最适pH值相同，而A5-3与E3-11的最适pH值相较于野生型往中性pH值条件偏移，其中A5-3的最适pH值为5。但是在pH值大于5的条件下野生型与突变体的酶活性均急剧下降，尤其A5-3酶活性下降的最快，说明GAD为一种酸性酶，H ＋ 的浓度严重影响酶活性。
图4 野生型酶与突变酶的最适反应pH值
Fig. 4 Effects of pH on the activity of wild-type and mutant enzymes
野生型酶与突变酶在不同pH值缓冲液（pH 3～7）的条件下保存12 h，测定残余酶活性，相对酶活性如图5所示。相较于野生型，突变体A5-3、E2-4、E3-11在pH值大于4.5的条件下具有更好的pH值稳定性。表明在偏中性的条件下，突变体更容易得到应用，能够承受偏中性条件的发酵环境。
图5 野生型酶和突变酶pH值稳定性
Fig. 5 pH stability of wild-type and mutant enzymes
2.3.3 酶的动力学参数
表4 野生型酶与突变酶的动力学常数
Table 4 Kinetic parameters of wild-type and mutant enzymes
如表4所示，突变体A5-3、E2-4的K m 值相较于野生型均略有下降，E3-11的K m 值略高于野生型，但大致相同，说明酶对底物的亲和力并没有太大变化；突变酶的K cat /K m 值都高于野生型，表明其催化活力有所提高。
2.3.4 三维结构模拟结果及分析
为探明E2-4、A5-3、E3-11酶活性提高的原因，构建蛋白质三维结构模型，从氨基酸残基之间的相互作用及空间结构发生的改变进行解析。目前微生物来源的GAD，只有源于大肠杆菌的GAD得到了晶体解析。而源于巨大芽孢杆菌的GAD三维结构尚未解析，所以将野生型的基因序列提交到SWISS-MODEL服务器中，通过对PDB库内现有的GAD三维结构进行模拟（图6A、B），相似度达到70%以上。巨大芽孢杆菌酶活性中心位点为279位的Lys，位于GAD内部的无规则卷曲处，此位点结合PLP进行催化反应；同时88位Asp直接参与催化反应，为反应提供必需的H ＋ ，因此该位点严格保守。突变体主要的突变位点在55位的Ala、34位的Leu、325位的Ala，位点突变后蛋白质二级结构变化见图6C～F。由图6可知，34位的Leu位于蛋白结构的一段无规则卷曲处，突变成Gln后酰胺键的存在一定程度上加强了这一部位的刚性，一定程度上提高了其稳定性，而且34位的Leu位于蛋白结构的表面，突变成亲水的Gln使结构变得更加合理；第55位的Ala位于GAD的一条α-螺旋臂上，并且远离活性中心，突变成了Asp之后，Asp不仅可以极大地增强供H ＋ 能力，而且可以形成氢键，很可能与51位的His形成了氢键，进而改变附近无规则卷曲的柔性，且His拥有储存H ＋ 能力，一旦催化反应消耗掉H ＋ 可以得到快速的补充，从而加快了酶的催化反应；325位的Ala位于内部的一条α-螺旋臂上，远离活性中心，突变成Ser，虽然一定程度上提高了催化反应，但是很可能增加了酶的柔性结构，导致酶本身的稳定性下降。
图6 巨大芽孢杆菌谷氨酸脱羧酶三维结构建模
Fig. 6 3D protein structure models of GAD from Bacillus megaterium
2.3.5 突变酶的圆二色谱分析
表5 突变酶二级结构的比例
Table 5 Proportions of secondary structures in mutant enzymes
在圆二色谱仪中190～260 nm波长范围内测定蛋白质的椭圆率 [22] ，对突变酶蛋白质二级结构的含量进行分析。由表5可知，与野生型相比，3 个突变体的二级结构含量变化不大，E2-4的α-螺旋含量略有增加，说明温度稳定性所有提高；A5-3、E2-4、E3-11的无规则卷曲均有增加。研究表明，无规则卷曲的增加提高了蛋白质的柔性结构，不利于蛋白质的稳定 [23-25] ，而α-螺旋能够维持蛋白结构的稳定，从而提高蛋白质的热稳定性 [26] ，这在一定程度上解释了热稳定性的研究结果。
目前有关来源于微生物的GAD的研究，主要集中于新基因的挖掘以及针对酶催化活性的分子改造。研究者经过研究，进一步阐述了GAD的作用机制，其中N端序列的氨基酸主要与GAD的空间分布有关，研究者 [27-28] 通过设计N端缺失体与野生型比较，发现在酸性pH值中N端缺失体在胞质内的分布有了显著提高。但这一部分的研究仍然不是十分明确，例如Shi Feng等 [17] 的研究源于谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）的GAD发现突变株T17I仍然能够显著提高酶活性，并且扩展GAD有效的pH值范围；另外在第300位左右的氨基酸残基会形成一个β发夹环，这个区域在不同pH值条件下会有不同的构象，对酶促反应起到了“开关”作用，在中性pH值条件下，β发夹环与C端区域的几个氨基酸残基相互作用，改变了活性中心的构象，严重影响了酶促反应。而且在中性pH值条件下，PLP也很容易与活性位点解离，C末端延伸到活性中心并与活性位点结合，挡住底物入口，阻止底物与活性位点结合，极大地降低了酶活性 [20] 。因此有研究者 [20] 通过替换β环结构区、C末端结构区域的氨基酸残基扩展GAD在偏中性条件下的酶活性，收到了很好的效果，但仍存在很大的局限性。Yu Kai等 [20] 对源于Lactobacillus breris的GAD活性中心研究阐明，Phe65与Thr215形成了疏水的底物入口，PLP与活性中心Lys279的形成共价的希夫碱结构；Asp88、Asp248是活性中心高度保守的残基，在催化过程中发挥着关键的作用；另外，His278、Ser127以及PLP磷酸基团附近的螺旋在维持的位置和正确取向方面也有着重要的意义。在更多有关GAD分子改造方面的研究也主要集中于提高GAD在偏中性条件下的酶活性，如Shi Feng等 [17] 研究得到的突变株E312S能够极大地改善偏中性条件下的酶活性，但是仍然存在酶活性低、稳定性差、难以得到实际应用的缺点。
本研究在实验室发掘到来源于巨大芽孢杆菌新的GAD基因的基础上，运用易错PCR策略对GAD基因进行改造，从13 000 多个突变株中得到了3 株酶活性提高的菌株A5-3、E2-4、E3-11，突变酶的比活力比野生型分别提高了157%、115%、97%，最优突变体A5-3酶比活力达到（143.27±1.28）U/mg，且动力学研究表明，突变位点对酶的K m 影响较小，但对K cat 影响较大，突变酶A5-3的K cat /K m 为17.29 L/（mmol·s），较野生型提高了152%，说明该突变酶的催化活性大幅提高，该结果优于Shi Feng [17] 、Lin Ling等 [18] 定向进化后突变酶的催化效率。
为了探明突变酶活性提高的原因，将野生型的氨基酸序列提交到SWISS-MODEL，得其三维结构。突变体A5-3在55位发生了突变，此位点由Ala突变成Asp，由三维结构模拟可知，此位点位于蛋白质内部的α-螺旋上，离活性中心较远。GAD作为一种酸性酶，反应中H ＋ 是必需的底物，但是在蛋白质的内部，由于反应不断消耗掉H ＋ ，因而始终处于缺H ＋ 的状态。Asp作为一种酸性氨基酸，其等电点为pH 2.77，在pH值大于2.77的条件下以质子化的形式存在，偏酸性条件下就可以解离出H ＋ ，参与酸碱催化反应，且侧链短，亲水性强，易形成氢键 [29] ，很可能与51位的His形成氢键，进而影响周围的结构，且His拥有储存H ＋ 能力，His的pK a 值接近生理pH值，所以蛋白内的组氨酸一般都是保守的。Asp55与His51的这种联系很可能形成了一种供H ＋ “通道”，一旦催化反应消耗掉H ＋ 就可以得到快速补充，从而加快酶的催化反应。将此位点定点突变成同为酸性氨基酸的Glu，亦得到了酶活性提高的突变体，说明该位点确实与酶促反应中H ＋ 的供应有关。从蛋白质结构角度看，疏水相互作用主要是影响蛋白质的构象熵，是蛋白质三级结构的形成和稳定中的最重要因素 [30] ，有研究者通过系统分析22 个蛋白质中和疏水相互作用有关的148 个突变体发现，疏水相互作用对蛋白质稳定性的贡献约为（60±4）%，而氢键对蛋白质稳定性的贡献约为（40±4）%，这表明疏水相互作用是蛋白质折叠过程中最重要的驱动力 [31-32] 。突变体E2-4在34位由Leu突变成Gln，由模拟结果可知，此位点位于N端区域，这一区域是一段无规则卷曲，构象极具柔性，目前的研究结构显示N端区域主要与GAD在胞质中的分布有关，但是对于其全部生理功能虽然尚不明确，但对于蛋白质亦不可或缺。34位的Leu位于蛋白六聚体的表面，Leu是疏水性氨基酸，位于蛋白结构表面，不利于蛋白质表面形成水化膜以保护蛋白质内部结构的稳定，而Gln侧链是亲水基团，有利于蛋白结构的稳定，且侧链酰胺基团的存在可以与附近的氨基酸残基形成氢键，一定程度上限制了周围无规则卷曲的柔性结构，因而34位的Leu突变成Gln致使突变酶的温度稳定性略有提高。圆二色谱结果表明，突变酶E2-4的α-螺旋增加，表明其温度稳定性有所改善，而E3-11的α-螺旋数减少，无规则卷曲增加，表明其柔性增加，有利于酶与辅酶、底物的结合与释放，蛋白结构柔性含量增加可能是3 个突变体酶活性提高的原因，但同时无规则卷曲的增加也使突变酶刚性结构减少，不利于蛋白质结构的稳定性，这与热稳定性研究结果一致。
通过定向进化技术提高巨大芽孢杆菌谷氨酸脱羧酶的酶催化活性，提高该酶应用于工业的潜在价值，也为GAD分子改造方面提供更多参考，利于后续有关GAD的研究。也说明通过定向进化技术可以显著提高巨大芽孢杆菌谷氨酸脱羧酶的催化活性。
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ZHAO Yunfei, SHAO Zexiang, LU Zhaoxin, BIE Xiaomei, ZHAO Haizhen, ZHANG Chong, LÜ Fengxia*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)
Abstract: In order to improve the activity of glutamate decarboxylase (GAD) of Bacillus megaterium, its encoding gene was molecularly modified by directed evolution. Mutants A5-3, E2-4 and E3-11 were screened out from more than 13 000 mutants by two rounds of error-prone PCR, whose specific activities were increased respectively by 157%, 115% and 97%and whose K cat /K m ratio was also increased compared to the wild-type strain. The amino acid sequence of A5-3 showed two mutations, A55D and D451E. From the results of 3-dimensional simulations, the alanine to aspartate mutation at position 55 may provide H + to the enzymatic reaction, thereby accelerating the reaction rate. In mutant E2-4, the leucine to glutamine mutation at position 34 may improve the thermal stability of the enzyme. As for mutant E3-11, the mutation of alanine 325 to serine was conducive to the formation of more hydrogen bonds inside the protein, increasing the flexibility of the site and facilitating the interaction between amino acid residues. The circular dichroism analysis showed that the mutants had similar three-dimensional structure to the wild-type strain. Compared to the wild-type enzyme, the mutant enzymes contained less α-helix but more random coil, indicating a slight decrease in rigidity and an increase in flexibility. This study indicates that directional evolution can effectively improve the glutamate decarboxylase activity of B. megaterium, which will lay the foundation for its industrial application.
Keywords: glutamate decarboxylase; directed evolution; enzyme activity
Improve Glutamate Decarboxylase Activity from Bacillus megaterium by Directed Evolution
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赵云飞, 邵泽香, 陆兆新, 等. 基于定向进化技术提高巨大芽孢杆菌谷氨酸脱羧酶活性[J]. 食品科学, 2018, 39(18):179-185. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201818028. http://www.spkx.net.cn
文章编号： 1002-6630（2018）18-0179-07
引文格式：
中图分类号： TS201.3
文献标志码： A
*通信作者简介： 吕凤霞（1963—），女，教授，博士，主要从事酶工程研究。E-mail：lufengxia@njau.edu.cn
DOI: 10.7506/spkx1002-6630-201818028
第一作者简介： 赵云飞（1993—），男，硕士研究生，主要从事食品微生物研究。E-mail：2015108044@njau.edu.cn
收稿日期： 2018-03-02