李 鑫 1,2 ，刘 霞 1, *，李培武 2, *，王秀嫔 2
（1.湖南农业大学食品科学技术学院，食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128；
2.中国农业科学院油料作物研究所，农业部油料作物生物学与遗传改良重点实验室，农业部油料及制品质量监督检验测试中心，农业农村部油料产品质量安全风险评估实验室（武汉），农业部生物毒素检测重点实验室，湖北 武汉 430062）
摘 要： 建立基于高效液相色谱-离子阱质谱脂质识别技术，用于鉴别合成乙酯型和天然甘油酯型深海鱼油。使用反相液相色谱，C 18 色谱柱，异丙醇和乙腈梯度洗脱分离脂质。使用离子阱质谱数据依赖型二级扫描获得脂质多级碎裂指纹信息。通过总离子流、一级质谱、二级质谱离子树识别脂质指纹信息。识别获知二十二碳六烯酸（docose hexaenoie acid，DHA）和二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）在乙酯型深海鱼油中存在方式为CH 3 CH 2 ODHA和CH 3 CH 2 O-EPA，而在天然甘油酯型深海鱼油的存在方式为甘油三酯指纹信息。此方法能准确区分乙酯型深海鱼油和甘油酯型深海鱼油。
关键词： 深海鱼油；快速鉴别；离子阱质谱；脂质；二十二碳六烯酸；二十碳五烯酸
自20世纪70年代，深海鱼油被报道含有多元不饱和脂肪酸二十二碳六烯酸（docose hexaenoie acid，DHA）和二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA），深海鱼油就一直以其在保健、疾病预防等方面的显著作用而备受人们关注 [1] 。深海鱼油中的主要营养物质是EPA和DHA，其对精神疾病如各种类型的痴呆、认知障碍 [2-3] 、阿尔兹海默病等 [4-6] 表现出明显的治愈效果；对于降低血脂 [7] 、预防脑血栓 [8-9] 、中风及脑溢血、预防血液凝固等心血管疾病也有显著疗效 [10-11] ；同时也有研究表面，深海鱼油中的不饱和脂肪酸与人体肿瘤、糖尿病、抗炎机制 [12-13] 等都有着密切相关 [14-18] 。
目前市场上的深海鱼油主要分为乙酯型和甘油酯型2 种，2 种不同类型的深海鱼油功效不同，价格差异大。甘油酯型鱼油是DHA和EPA天然的存在形式，食用安全，易被人体消化吸收 [19] ，是人们能普遍接受的一种产品形式。据报道 [20-21] ，2 种不同类型的深海鱼油有着较大差异，甘油酯型鱼油与乙酯型鱼油相比，其吸收率高达乙酯型鱼油的3 倍，因为甘油三酯能被人体胰脏和肝脏的主要脂肪酶专一性水解 [22-23] ，而乙酯型鱼油却不能被有效水解而释放游离脂肪酸以被人体吸收 [24-25] 。此外，乙酯型鱼油也有着功能上的缺陷，乙酯型鱼油在胃肠道能分形成乙醇，对乙醇耐受性不良的人容易引起不良反应，如过敏症，尤其不适宜儿童食用；乙酯型鱼油脂肪酸被小肠吸收后进入人体通常会被作为能源物质供能而被氧化，影响了鱼油的保健功效 [26-27] ；长期以脂肪酸、乙醇作为膳食来源，也易引起人体内甘油的缺失或不足，从而拉动人体糖代谢，这样易造成人体内糖代谢不平衡从而产生一定的副作用 [28-29] 。目前对于2 种不同类型深海鱼油的鉴别研究还鲜见报道，对深海鱼油中不饱和脂肪酸如EPA、DHA的研究主要通过气相色谱、液相色谱-质谱联用 [30-31] 等手段，其前处理复杂、需要衍生，成本损耗较大，且精密度不高 [32-33] 。本研究运用高效液相色谱-离子阱质谱的方法，通过数据依赖型扫描所获得的一级精确质量数，加以二级特征分子碎片离子峰的辅助验证，能准确鉴别乙酯型和甘油酯型的深海鱼油，具有快速、简便、灵敏度高、准确性高的优点。
不同品牌深海鱼油样品（乙酯型深海鱼油2 个，甘油酯型深海鱼油7 个） 市购；甲醇（色谱纯） 美国Fisher公司；异丙醇（色谱纯） 北京百灵威科技有限公司；正己烷、乙腈（均为色谱纯） 安徽时联特种溶剂股份有限公司；乙酯酰基EPA、乙酯酰基DHA、十六碳烯酸甘油酯标准品（纯度＞97%） 美国Sigma公司。
高效液相色谱-质谱联用仪（Surveyor液相色谱仪包括四元输液泵、自动进样器、二极管阵列检测器、LTQXL质谱检测器、离子源为大气压化学电离源）、Hypersil GOLD C 18 色谱柱（150 mm×2.1 mm，3 μm） 美国Thermo Scientific公司；CPA224S电子分析天平 德国Sartorius公司；微量移液枪 德国Eppendorf公司；KQ-300E超声仪 中国昆山仪器有限公司；0.22 μm一次性有机滤膜 美国Millipore公司；HQ-60型涡旋混合器北方同正生物技术发展公司。
1.3.1 样品前处理
称取30 mg深海鱼油，采用异丙醇-乙腈-正己烷（2∶2∶1，V/V）混合溶剂提取获得其中脂质组分后，用甲醇-异丙醇（1∶1，V/V）溶液稀释100 倍，经0.22 μm的有机滤膜过滤后，进样到高效液相色谱-质谱联用仪中分析，进样量10 μL。
1.3.2 色谱条件
Thermo Scientific Hypersil GOLD C 18 色谱柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）；流动相A相为异丙醇，B相为乙腈，梯度洗脱：0 min，10% A，90% B；20 min，59% A，41% B；20.01～25 min，10% A，90% B（按体积分数计）；流速200 μL/min；进样量10 μL。
1.3.3 质谱条件
大气压化学电离源；正离子采集模式；扫描模式：数据依赖型二级扫描；质量扫描范围m/z 100～1 200；离子源温度275 ℃；毛细管温度275 ℃；鞘气压力30 psi；辅助气压力5 psi；碰撞能量35 eV。
根据采集到的质谱图和出峰保留时间与脂质数据库（http://www.lipidmaps.org/）比对，进行定性分析。数据处理采用Xcalibur软件（Version 2.0.7，美国Thermo公司），对峰面积积分并计算，进行定量分析。
图1 乙酯酰基EPA和乙酯酰基DHA一级质谱图（A）及其对应二级质谱图（B、C）
Fig. 1 Mass spectra (A) and tandem mass spectra (B, C) of ethyl acetyl EPA and ethyl acetyl DHA
如图1A所示，乙酯酰基EPA特征分子离子峰（[CH 3 CH 2 O-EPA＋H] ＋ ，m/z 331.3）和乙酯酰基DHA特征分子离子峰（[CH 3 CH 2 O-DHA＋H] ＋ ，m/z 357.4）。如图1B、C所示，在分子离子峰二级全扫描质谱图中分别出现了其碎片离子[EPA-OH] ＋ （m/z 285.27）和[DHA-OH] ＋ （m/z 311.28）。
图2 PoEPADHA一级质谱图（A）和对应二级质谱图（B）
Fig. 2 Mass spectra (A) and tandem mass spectra (B) of PoEPADHA
三酰甘油酯在离子阱多级质谱中的碎裂方式是一级分子离子峰会任意丢失一个脂肪酸中性碎片而形成二级碎片离子，通过将一级分子离子和二级碎片离子信息与脂质数据库（http://www.lipidmaps.org/）进行比对，并结合一级分子离子和二级碎片离子的m/z特征信息可推测丢失的脂肪酸种类，从而识别甘油三酯，如图2A所示，一种甘油三酯组分PoEPADHA的分子离子峰[PoEPADHA＋H] ＋ （m/z 923.63）会失去任意一个脂肪酸中性碎片而形成二级碎片离子[EPADHA] ＋ （m/z 671.50）、[PoDHA] ＋ （m/z 621.50）和[PoEPA] ＋ （m/z 595.47），见图2B，由此可识别该组分为PoEPADHA。
图3 乙酯型深海鱼油（A）和甘油酯型深海鱼油（B）一级总离子流图
Fig. 3 Total ion current chromatograms of ethyl ester-type (A) and glyceride-type (B) deep sea fish oils
表1 甘油酯型鱼油中甘油三酯定性结果
Table 1 Qualitative analysis of triglycerides of glyceride-type fish oils
注：M.十四碳脂肪酸；P.十六碳脂肪酸；Po.十六碳烯酸；Ma.十七碳脂肪酸；S.十八碳脂肪酸；O.十八碳烯酸；St.十八碳四烯酸；G.二十碳烯酸；Ar.二十碳四烯酸；B.二十二碳脂肪酸。下表同。
如图3A所示，2.86 min处有乙酯酰基EPA分子离子峰（[CH 3 CH 2 O-EPA＋H] ＋ ，m/z 331.34）和乙酯酰基DHA分子离子峰（[CH 3 CH 2 O-DHA＋H] ＋ ，m/z 357.41）的色谱峰。如图3B所示，5.5～18 min之间的峰为甘油酯型深海鱼油中脂质组分包括三酰甘油酰基EPA和三酰甘油酰基DHA多组分的手指形色谱峰。甘油酯型深海鱼中可识别的甘油三酯见表1。因此，鉴别乙酯型深海鱼油和甘油酯型深海鱼油的方法为只含有乙酯酰基EPA和乙酯酰基DHA，该样品即为乙酯型深海鱼油；样品中只含有三酰甘油酰基EPA和三酰甘油酰基DHA，且不含有乙酯酰基EPA和乙酯酰基DHA，该样品即为甘油酯型深海鱼油。
表2 不同脂质在鱼油样品中的相对含量
Table 2 Relative contents of different lipids in fish oil samples
注：—.未检出。
选用9 份鱼油样品进行方法验证，如表2所示。乙酯型鱼油特征标志物CH 3 CH 2 O-EPA，CH 3 CH 2 O-DHA存在于样品2和样品9中，而在其他样品中未检出。同时样品1、3～8中只存在甘油酯型鱼油的特征物。由此可说明，样品2、9为乙酯型鱼油，其余为甘油酯型鱼油。
本研究建立基于高效液相色谱-离子阱质谱仪的脂质识别技术，以及鉴别乙酯型和甘油酯型深海鱼油的方法。通过总离子流、一级质谱和二级质谱离子树识别脂质指纹信息，从而对鱼油样品进行定性，可精确鉴别乙酯型鱼油和甘油酯型鱼油，具有快速、准确、灵敏度高的优点。该技术的建立为保证市场上深海鱼油的质量安全提供理论依据。
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Detection of Deep Sea Fish Oil Adulteration by Lipid Analysis Using Ion Trap Mass Spectrometry
LI Xin 1,2 , LIU Xia 1, *, LI Peiwu 2, *, WANG Xiupin 2
(1. Hunan Province Key Laboratory of Food Science and Biotechnology, College of Food Science and Technology,Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Oil Crops,Ministry of Agriculture, Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Oilseed Products (Wuhan), Ministry of Agriculture,Key Laboratory of Detection for Mycotoxins, Ministry of Agriculture, Quality Inspection and Test Center for Oilseeds Products,Ministry of Agriculture, Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430062, China)
Abstract: In this paper, a high performance liquid chromatography coupled to ion trap mass spectrometry (HPLC-ITMS)method was used to identify synthetic ester-type and natural glyceride-type deep sea fish oils by lipid analysis. Lipids were separated by reversed phase HPLC on a C 18 column using gradient elution with isopropyl alcohol and acetonitrile.Multistage fragmentation fingerprints were acquired by ion trap mass spectrometry under a data-dependent scan mode. The fingerprint information was identified from the total ion current spectra, mass spectra and tandem mass spectra. It was found that docose hexaenoie acid (DHA) and eicosapentaenoic acid (EPA) existed in ester-type fish oil as CH 3 CH 2 O-DHA and CH 3 CH 2 O-EPA, respectively, while both existed as triglycerides in glyceride-type fish oil. This method can accurately distinguish between ethyl ester-type and glyceride-type deep sea fish oils.
Keywords: deep sea fish oil; rapid identification; ion trap mass spectrometry; lipid; docose hexaenoie acid; eicosapentaenoic acid
LI Xin, LIU Xia, LI Peiwu, et al. Detection of deep sea fish oil adulteration by lipid analysis using ion trap mass spectrometry[J]. Food Science, 2018, 39(18): 199-203. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201818031. http://www.spkx.net.cn
李鑫, 刘霞, 李培武, 等. 离子阱质谱测定脂质鉴别深海鱼油[J]. 食品科学, 2018, 39(18): 199-203. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201818031. http://www.spkx.net.cn
文章编号： 1002-6630（2018）18-0199-05
引文格式：
中图分类号： S565.9
文献标志码： A
*通信作者简介： 刘霞（1976—），女，教授，博士，主要从事食品分析与生物技术研究。E-mail：liuxiaspr@aliyun.com李培武（1961—），男，研究员，博士，主要从事农产品质量标准与检测技术研究。E-mail：peiwuli@oilcrops.cn
DOI: 10.7506/spkx1002-6630-201818031
基金项目： 农业部引进国际先进农业科学技术计划（948计划）项目（2016-x29）
第一作者简介： 李鑫（1993—），男，硕士研究生，主要从事食品安全与检测研究。E-mail：835150937@qq.com
收稿日期： 2017-10-20