大豆油和月桂酸制备MLM型结构脂质工艺优化及其性质分析

王 博,鞠兴荣*,周润松,何 荣,季圣阳

(南京财经大学食品科学与工程学院,江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心,江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室,江苏 南京 210023)

摘 要: 以大豆油和月桂酸作为反应底物,采用Lipozyme RM IM催化合成中长碳链(middle-long-middle,MLM)型结构脂质。通过响应面试验优化方法研究不同底物(月桂酸∶大豆油)物质的量比、反应温度、反应时间、脂肪酶添加量对合成结构脂质中月桂酸插入率的影响,并研究在最佳反应条件下MLM型结构脂质的理化性质。结果表明,最佳合成工艺条件下所得结构脂质的月桂酸插入率为29.26%,该条件为底物物质的量比6∶1、反应温度45 ℃、反应时间24 h、脂肪酶添加量为底物质量的13%。理化性质研究表明,与原大豆油相比,MLM型结构脂质碘值(97.38 g/100 g)、黏度(70.39 cP)均降低,皂化值(以KOH计)(229.58 mg/g)、结晶开始温度(4.89 ℃)和熔融开始温度(-19.87 ℃)均显著提高(P<0.05),而烟点(231.24 ℃)无显著差异(P>0.05)。本研究合成的MLM型结构脂质,提高了原大豆油的营养价值,为开发抗肥胖、降血脂的优质油脂提供理论依据。

关键词: 大豆油;月桂酸;结构脂质;酶催化;理化性质

大豆油是中国人最常用的食用油脂之一,目前中国大豆油的进口量居世界首位 [1] 。大豆油原料比较丰富,获取途径比较容易且价廉。月桂酸属于饱和脂肪酸,其心血管疾病风险比其他饱和脂肪酸要低,在椰子油、棕榈仁油这些天然油脂中大量含有 [2] 。月桂酸单甘油酯具有较强的抗原虫、抗菌、抗病毒、抗感染的能力,广泛应用于婴幼儿奶粉、米粉等产品中。Li Qingsheng等 [3] 在以雌猴为研究对象的实验中发现,月桂酸单甘油酯可以有效帮助雌猴避免感染猴免疫缺陷病毒。

结构脂质是指采用一定的方法 [4-5] 对天然油脂进行改性,进而甘油三酯骨架上的脂肪酸种类和含量发生变化,使其具有特定生理功能和营养价值 [6-9] 。甘油三酯s,n-1,3位上含有中链脂肪酸(medium chain fatty acids,MCFA)(C 6:0 ~C 12:0 [10] ,s,n-2位置含有必需长链脂肪酸所形成的结构脂质称为中长碳链(middle-longmiddle,MLM)型结构脂质 [11-12] 。消化过程中,油脂先与胆汁、胰汁混合,乳化形成微粒结构,再被水解成脂肪酸、2-单甘酯和少量甘油 [13] 。然而,MCFA在消化时不需要与其他脂类物质形成乳糜微粒 [14] ,也不易与蛋白质结合形成脂蛋白,不会增加血液中胆固醇的含量,具有一定调节血脂作用 [15-16] 。Ifeduba等 [17] 用高硬脂酸大豆油和辛酸合成结构脂质,改善了其结构与性能。Moreira等 [18] 使用大豆油和橄榄油得到富含必需脂肪酸的油脂。此外,辛酸或癸酸作为底物合成MLM结构脂质研究也有诸多报道 [17,19] 。由此可见,提高油脂中MCFA含量,开发具有特定生理功能和营养价值的MLM型结构脂质成为研究热点 [20-22]

本研究以大豆油和月桂酸作为反应底物,采用Lipozyme RM IM催化合成MLM型结构脂质,并通过响应面试验分析底物(月桂酸∶大豆油)物质的量比、反应时间、反应温度、脂肪酶添加量4 个因素对生成的结构脂质中月桂酸插入率的影响,明确最佳制备工艺,并分析在该条件下合成的MLM型结构脂质理化性质,为开发抗肥胖、降血脂的优质油脂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

固定化1,3位置特异性脂肪酶Lipozyme RM IM丹麦Novozyme公司;精炼大豆油 镇江中储粮油脂有限公司;月桂酸(纯度>98%) 麦克林生化科技有限公司;脂肪酸甲酯混标 美国Sigma公司;所有实验用有机溶剂均为分析纯或色谱纯。

1.2 仪器与设备

6890N气相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司;SHA-B恒温水浴振荡器 常州华冠仪器有限公司;N-1100D-WD旋转蒸发仪 上海珂淮仪器有限公司;PE DSC8000差示扫描量热仪 美国珀金埃尔默有限公司;BSA223S-CW电子天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;J6冷冻离心机 美国贝克曼库尔特有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶法制备MLM型结构脂质工艺流程

取1 mmol精炼大豆油置于25 mL锥形瓶,按一定物质的量比例加入月桂酸颗粒,3 mL正己烷,适量脂肪酶,以及酶质量8%的去离子水,在一定反应温度条件下,以180 r/min搅拌速率反应一定时间后,离心(4 000 r/min,10 min)去除脂肪酶,得到的反应产物经旋转蒸发除去溶液中正己烷,得到制备MLM型结构脂质的混合物。

1.3.2 结构脂质的分离纯化

采用碱性萃取脱酸法除去1.3.1节制备的MLM型结构脂质混合物中游离脂肪酸 [23-24] 。具体操作如下:先在上述混合物中加入10 mL 95%乙醇溶液和1 滴1%酚酞的乙醇溶液,混合均匀,逐滴加入0.7 mol/L KOH溶液直至溶液出现粉红色且在30 s内不褪色,转移至分液漏斗中,加入15 mL正己烷剧烈振荡后静置分层,收集上层(正己烷与MLM型结构脂质)溶液,通过无水硫酸钠柱除去溶液中残留水,转移至旋转蒸发器中除去正己烷,并用氮吹仪除去多余有机溶剂,即获得制备MLM型结构脂质,-20 ℃保存备用。

1.3.3 气相色谱分析

SP-2560毛细管柱(100 m×0.25 mm,0.25 μm);氢离子化检测器;进样口温度240 ℃;分流比50∶1;进样量1.0 μL;载气N 2 流速2 mL/min;升温程序:初温140 ℃保持5 min,以5 ℃/min的速率升温至240 ℃,保持30 min。

1.3.4 熔融特性分析

取4~6 mg样品放在10 μL容量的铝盘中压片,使用差示扫描量热仪测定1.3.2节制备的MLM型结构脂质熔融特性。升温条件:第1阶段:样品从室温快速加热至80 ℃,保持10 min;第2阶段:将样品以10 ℃/min速率冷却至-40℃,保持30 min;第3阶段:样品以5 ℃/min速率加热至80 ℃。

1.3.5 理化指标测定

酸价测定参照GB/T 5009.229—2016《食品中酸价的测定》,结果以KOH计;皂化值测定参照GB/T 5534—2008《动植物油脂 皂化值的测定》,结果以KOH计;碘值测定参照GB/T 5532—2008《动植物油脂 碘值的测定》;烟点测定参照GB/T 20795—2006《植物油脂烟点测定》。

1.3.6 单因素试验

单因素试验中各因素的固定值分别为底物(月桂酸∶大豆油)物质的量比4∶1,反应时间20 h,反应温度45 ℃,脂肪酶添加量为底物质量的10%。保持其他3 个因素不变,每次改变1 个因素,设计底物物质的量比分别为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1,反应时间分别为12、14、16、18、20、22、24、26 h,反应温度分别为30、35、40、45、50、55、60、65 ℃,脂肪酶添加量分别为4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%,以月桂酸插入率作为评价指标,计算公式如下:

式中:C为月桂酸插入率/%;A 1 为结构脂质中月桂酸甲酯气相色谱图中对应峰面积;A 2 为结构脂质中所有脂肪酸甲酯气相色谱图所对应峰面积。

1.3.7 响应面试验设计

在单因素试验的基础上,采用Box-Behnken试验设计方案,以底物物质的量比(A)、反应时间(B)、反应温度(C)脂肪酶添加量(D)为考察变量,以月桂酸插入率为响应值(Y),设计4因素3水平响应面试验,确定最佳工艺。每一变量的低、中、高水平分别以-1、0、1编码,试验因素与水平见表1。

表1 响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels used for Box-Behnken design

1.4 数据处理

所得数据采用Excel和SPSS 20.0软件进行均值方差分析,使用Origin 8.5 Pro软件进行绘图分析。响应面试验用Design-Expert 8.0软件进行试验设计并对回归模型进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

由图1A可以看出,底物(月桂酸∶大豆油)物质的量比对酸解反应具有较大影响,在底物物质的量比为5∶1时,月桂酸插入率达到最大值,然而当底物物质的量比大于5∶1时,月桂酸插入率没有再继续增加反而出现下降趋势。可能是高水平的游离脂肪酸会产生大量的羧酸基团,从脂肪酶表面剥夺必需的水分,从而导致反应介质被破坏,反应朝着逆反应方向进行 [25] 。Nunes等 [26] 在研究橄榄油与辛酸或癸酸优化反应中,得到最佳比例为2.8∶1和3∶1,可能是月桂酸熔点高常温条件下呈固体,需要更多的量才能使反应充分进行。由图1B可知,当反应时间小于22 h,月桂酸插入率随着反应时间的延长呈现很明显的增加趋势,但反应时间在22~26 h时,月桂酸插入率的增长趋势表现相对平稳。不同温度脂肪酶催化效果不同 [27] ,如图1C所示,在45 ℃时,月桂酸的插入率效果最好,与Lipozyme RM IM最佳催化温度(45 ℃)相一致。如图1D所示,脂肪酶添加量为12%时,月桂酸插入率达到最大值。然而,过高的脂肪酶添加量并没有明显提高月桂酸插入率,主要由于底物浓度限制,多余的脂肪酶并未能参与催化反应 [28]

图1 各因素对月桂酸插入率的影响
Fig. 1 Effects of various factors on the insertion rate of lauric acid

2.2 MLM型结构脂质合成工艺条件的优化

2.2.1 响应面试验优化结果

表2 响应面试验设计方案及结果
Table 2 Experimental design with response variable

在单因素试验基础上,继续对提取条件进行优化。采用响应面软件Design-Expert 8.0.6设计试验方案,并对结果进行回归分析,见表2。经回归拟合,可以得到月桂酸插入率(Y)对底物物质的量比(A)、反应时间(B)、反应温度(C)、脂肪酶添加量(D)的回归方程:Y=29.44+4.57A+0.32B+0.12C+0.94D-0.12AB+0.17AC-0.34AD-0.27BC-0.75BD-0.56CD-4.44A 2 -1.78B 2 -1.51C 2 -2.38D 2

2.2.2 模型方程建立与显著性检验

由表3可知,此模型P值小于0.000 1,达到极显著水平,且失拟项不显著(P=0.185 3>0.05),校正模型的相关系数R 2 为0.907 8,决定系数 为0.926 1,说明回归模型与实际值拟合良好,能较好地反映出各因素对月桂酸插入率的影响。由表3可以看出,一次项中,底物物质的量比(A)、反应时间(B)影响极显著(P<0.001)、脂肪酶添加量(D)影响显著(P<0.05),二次项中,BC、C 2 影响显著(P<0.05),A 2 、B 2 、D 2 影响极显著(P<0.001)。

表3 回归模型的方差分析
Table 3 Analysis of variance of regression model

注:*.差异显著(P<0.05);**.差异极显著(P<0.001)。

2.3 各因素交互作用对月桂酸插入率的影响

图2 各因素交互作用对月桂酸插入率影响的响应面图
Fig. 2 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on the insertion rate of lauric acid

从图2a~c可以看出,底物物质的量比的曲线最陡,幅度最大,可知底物物质的量比对产物中月桂酸插入率影响最显著。从图2a、d、e可以看出,反应时间的曲线比较平缓,而从图2c、e、f可以看出,脂肪酶添加量的曲线也比较平缓,因此,反应时间与脂肪酶添加量对月桂酸插入率的影响程度小于底物物质的量比。由图2b、d、f可以看出,反应温度的响应面曲线幅度最为平滑,反应温度对月桂酸插入率的影响最小。

在选取的试验因素和水平范围内,根据回归模型分析,以月桂酸插入率为评价指标,可以确定最佳的提取工艺条件为底物物质的量比5.9∶1、反应时间23.56 h、反应温度45.28 ℃、脂肪酶添加量13.03%,该条件下的月桂酸插入率预测值为29.87%。在实际操作中,将工艺条件修正为底物物质的量比6∶1、反应时间24 h、反应温度45 ℃、脂肪酶添加量13%,3 次平行验证实验,月桂酸插入率的平均值为29.26%,与理论值基本相符,表明本实验的优化工艺参数具有实际应用指导价值。

2.4 结构脂质物理化学性质分析

表4 大豆油和结构脂质理化性质分析
Table 4 Physicochemical properties of soybean oil and MLM-type structured lipids

注:所有数据表示为±s,n=3;同一行不同字母表示差异显著(P<0.05)。

在最佳工艺条件下合成MLM型结构脂质,并测定其理化指标。如表4所示,碘值是衡量油脂中不饱和度的指标,MLM型结构脂质的碘值小于没有改性的大豆油(106.45 g/100 g),主要因为在改性过程中加入的MCFA是饱和脂肪酸,油脂的不饱和度也随之降低,碘值也随之降低。此外,测定结果显示MLM型结构脂质的皂化值要明显大于原大豆油样品(190.71 mg/g),说明接入月桂酸后,MLM中脂肪酸分子质量降低。黏度是流体对流动阻力的量度,通过脂肪酶酸解合成结构脂质由于插入MCFA,其具有更低的分子质量和不饱和程度,对黏度产生一定的影响,所以MLM型结构脂质黏度(70.39 cP)小于大豆油黏度(78.61 cP)。制备的MLM型结构脂质烟点比大豆油样品略有提高,但无显著差异(P>0.05)。品质没有受到加工过程的影响。与Jennings等 [29] 测定结果相一致。

2.5 结构脂质熔融特性分析

图3 大豆油和结构脂质熔融结晶曲线图
Fig. 3 DSC thermograms of soybean oil and structured lipids

油脂的热性能受甘油三酯种类、脂肪酸组成和饱和度的影响 [30] 。从图3可以看出,MLM型结构脂质的熔融开始温度为-19.87 ℃,比大豆油(-32.52 ℃)高。原大豆油结晶开始温度为-7.65 ℃,MLM型结构脂质结晶开始温度为4.89 ℃,说明MLM型结构脂质具有更高的结晶点。因此,MLM型结构脂质有和大豆油不一样的熔融特性。熔融曲线特点与Jennings等 [29] 研究结果相同。

3 结论与讨论

MLM型结构脂质是改性油脂研究的热点,由于其特殊的结构特征,在体内消化时不会与其他脂类物质形成乳糜微粒,可以快速为人体供能,减少体内脂质的堆积。Moreira等 [18] 使用橄榄油,Ifeduba [17] 和Jennings [19] 等使用辛酸或癸酸作为底物合成MLM结构脂质研究都有诸多报道。本研究对大豆油和月桂酸合成MLM型结构脂质的合成工艺进行优化,结果表明,其最佳酶催化合成工艺条件为底物(月桂酸∶大豆油)物质的量比6∶1、反应温度45 ℃、反应时间24 h、脂肪酶添加量13%,该条件下月桂酸的插入率可以达到29.26%。理化性质方面,MLM型结构脂质的碘值、黏度要低于大豆油,皂化值和熔融结晶温度均高于大豆油,烟点略微升高,可以用于日常烘焙与食品制备。在后续研究中,进一步进行动物实验和临床研究,来确定MLM结构脂质的抗肥胖、降血脂等功能性作用,使其更安全有效地应用到日常生活中。

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Optimized Preparation and Characterization of MLM-Type Structured Lipids from Soybean Oil and Lauric Acid

WANG Bo, JU Xingrong*, ZHOU Runsong, HE Rong, JI Shengyang(Jiangsu Key Laboratory of Quality Control and Further Processing of Cereals and Oil,
Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety, College of Food Science and Engineering,Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210023, China)

Abstract: MLM-type (medium-long-medium carbon chain) structured lipids were synthesized by the reaction between lauric acid (C 12:0 ) and refined soybean oil using Lipozyme RM IM lipase as a catalyst. The effects of molar ratio of between soybean oil and lauric acid, reaction temperature, reaction time and lipase dosage on the insertion rate of lauric acid were studied.The physicochemical properties of the MLM-type structured lipids prepared under optimized reaction conditions were determined. The optimal conditions for the synthesis of MLM-type structured lipids were as follows: molar ratio of soybean oil to lauric acid 6:1, reaction temperature was 45 ℃, reaction time was 24 h, and enzyme/substrate ratio 13%. Under these conditions, the insertion rate of lauric acid was 29.26%. The iodine value (97.38 g/100 g) and viscosity (70.39 cP)of the structurzed lipids were lower than those of soybean oil, and the saponification value (calculated as KOH equivalent)(229.58 mg/g), crystallization starting temperature (4.89 ℃) and melting starting temperature (−19.87 ℃) were significantly higher than those of soybean oil (P < 0.05), while no significant different (P > 0.05) in smoke point (231.24 ℃) was found.The MLM-type structured lipids synthesized in this study had higher nutritional value than soybean oil and could be developed as anti-obesity and lipid-reducing high-quality oils.

Keywords: soybean oil; lauric acid; structured lipid; lipase catalysis; physicochemical properties

WANG Bo, JU Xingrong, ZHOU Runsong, et al. Optimized preparation and characterization of MLM-type structured lipids from soybean oil and lauric acid[J]. Food Science, 2018, 39(18): 249-254. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201818038. http://www.spkx.net.cn

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文章编号: 1002-6630(2018)18-0249-06

引文格式:

中图分类号: TS224.8

文献标志码: A

*通信作者简介: 鞠兴荣(1957—),男,教授,博士,研究方向为食品营养、功能食品及农产品深加工。E-mail:xingrongju@163.com

DOI: 10.7506/spkx1002-6630-201818038

基金项目: “十三五”国家重点研发计划重点专项(2016YFD0400206);江苏省高校优势学科建设工程资助项目(PAPD)

第一作者简介: 王博(1992—),男,硕士研究生,研究方向为油脂精深加工。E-mail:bowan@163.com

收稿日期: 2018-03-26