图1 数据分析流程图
Fig. 1 Flow chart of data analysis
王文秀，彭彦昆*，孙宏伟，魏文松，郑晓春
（中国农业大学工学院，国家农产品加工技术装备研发分中心，北京 100083）
摘 要： 为探究二维相关同步光谱优选生鲜肉新鲜度特征变量的可行性，采集生鲜猪肉在1～15 d共58 个样品的可见-近红外反射光谱信息，并参照国标方法测定其挥发性盐基氮值（total volatile basic nitrogen，TVB-N）。然后，以TVB-N为“外界扰动”，选择10 条代表性光谱并进行包络线去除，结合光谱差异选取了7 个子区间。通过对每个子区间作二维相关分析，解析其二维相关同步谱和自相关谱，获取与TVB-N变化密切相关的敏感变量。最后，利用所选特征变量，分别基于原始、标准正态变量变换预处理和归一化预处理的光谱，建立猪肉新鲜度的支持向量机（support vector machine，SVM）判别模型。结果表明，利用二维相关光谱分析共提取到17 个特征波长，仅占总变量个数的1.61%，建立的SVM模型总体正确率分别为94.83%、98.28%和98.28%。这表明所建立的模型具有较好的判别效果，也说明二维相关分析用于筛选与生鲜肉新鲜度相关特征变量的方法是可行的。这有利于解析生鲜肉在腐败变质过程中的光谱特征信息变化，也为近红外光谱分析中变量筛选提供了一种新的思路。
关键词： 可见-近红外光谱；二维相关光谱；新鲜度；生鲜肉；判别模型
生鲜肉作为蛋白质的主要来源，在人们的日常饮食结构中占据非常重要的地位。2016年我国肉品的总产量达8 625万 t，整个肉品行业发展潜力巨大。然而，由于肉品本身富含营养物质和水分，容易被其他微生物入侵而发生系列变化，导致肉的腐败变质，给消费者的健康安全造成威胁。因此，对肉的新鲜度进行快速评价具有非常重要的现实意义。
可见-近红外光谱技术具有无损伤、操作简单、无需样品前处理的优点，已被证实可以对生鲜肉的品质安全参数进行快速分析 [1-4] 。目前，基于光谱技术对肉品新鲜度评价可以参照GB 2707—2016《鲜（冻）畜、禽产品》预测挥发性盐基氮值（total volatile basic nitrogen，TVB-N）评价新鲜度。也可借助化学计量学方法，直接将光谱信息与新鲜度建立联系作出评价。马世榜等 [5] 利用近红外光谱结合支持向量机（support vector machine，SVM）对牛肉的新鲜度进行定性判别，验证集正确率为88.89%。蔡健荣等 [6] 利用近红外光谱对猪肉中TVB-N进行定量分析，预测集相关系数为0.823 8。然而，由于近红外光谱数据量大，光谱信息复杂且具有多重共线性，因此不少学者展开特征波长筛选的研究。如马世榜 [7] 、刘飞 [8] 等利用无信息变量消除和连续投影算法提取有效变量，建立了更为简化的TVB-N预测模型。这些方法大多通过多次采样分析，构建多个子模型，通过评价模型误差确定最优变量组合。然而，不同方法筛选的变量个数和分布常常有所不同，部分变量缺乏化学意义上的响应机理解释，因此变量优选仍是目前近红外光谱分析面临的重要问题。
二维相关光谱通过将光谱信号扩展到第二维上，可以使原来一维光谱上的弱峰和重叠峰更加清晰，从而提高光谱分辨率。同时，通过添加一定的外界扰动，对动态光谱进行二维相关计算，可以解析光谱细微特征的变化，寻找与微扰相关的敏感变量 [9-11] 。目前，已有学者将二维相关光谱应用在牛奶掺杂鉴别 [12] 、食用油掺杂检测 [13] 、中药掺伪 [14] 、蛋白饲料原料判别 [15] 、红枣营养成分变化解析 [16] 等的研究上，表明通过分析二维相关光谱特性，可以观察到各吸收峰随外部扰动的变化关系以及对外部扰动的敏感程度。结合本实验的研究，将所有样品（从新鲜到腐败）整体作为待研究体系，以TVB-N为外部扰动，原始光谱可看作是外扰诱发的动态光谱。通过二维光谱计算，解析同步光谱，观察外部扰动对不同波长下动态光谱的影响，可以从机理上确立与外部扰动相关的敏感波长。目前将二维相关近红外光谱应用在生鲜肉新鲜度评价的研究尚鲜见报道。
为探究二维相关光谱优选新鲜度特征变量的可行性，本研究以生鲜猪肉中TVB-N为外界干扰对光谱进行调制，通过研究在外部扰动存在下体系的变化，解析二维相关同步光谱和自相关谱，分析随外部扰动变化的光谱特征信息，确定与TVB-N相关的特征变量，建立生鲜猪肉的快速判别模型。
冷鲜猪肉背最长肌购买于北京美廉美超市。将其修整为长×宽×高约8 cm×5 cm×2.5 cm的肉块，放置在自封袋中运输至无损检测实验室。将所有样品按顺序编号后无积压放置在4 ℃冰箱中保存，每12 h取出2 个样品进行光谱采集和理化值测定，共进行15 d，获得有效样品58 个。
自行搭建的实验用可见-近红外光谱采集系统主要包括卤钨灯光源、AvaSpec-2048光谱仪（荷兰Avantes公司）、光纤、环形光导、计算机等硬件。光谱范围为350～1 100 nm，分辨率为0.59 nm。采集光谱前，将仪器预热约30 min，然后依次采集参比光谱、暗背景光谱以实现校正，最后采集样品的光谱信息。整个实验过程中，保证光纤探头与待测物距离一致，每个样品采集5 个不同位置处光谱信息并求取平均值，从而减少实验误差。光谱数据的获取和保存通过光谱仪配套软件Avasoft完成。
光谱信息采集完成后，参照GB 5009.228—2016《食品中挥发性盐基氮的测定》中的方法对猪肉样品中的TVB-N进行测定，并参照文献[17]将TVB-N小于15 mg/100 g的样品定义为新鲜肉，将TVB-N介于15～25 mg/100 g之间的样品定义为次新鲜肉，将TVB-N大于25 mg/100 g的样品定义为腐败肉，以此为标准对猪肉的新鲜度进行划分。
首先基于全波段光谱信息建立猪肉新鲜度的判别模型。由于近红外光谱采集过程中常常伴随基线漂移、杂散光等噪音信号，因此本研究采用标准正态变量变换（standard normal variate，SNV）、归一化的预处理方法来减少干扰信息，并进行分析比较。建模采用了SVM判别分析方法，该方法以结构风险最小化为准则构造决策超平面，使不同种类样品的间隔最大 [18] 。
以TVB-N为外部微扰，进行二维相关同步光谱解析，寻找与新鲜度评价相关的特征变量。第1步：根据TVB-N实测值，从最小值和最大值之间以均匀浓度梯度共选取10 个代表性样品用于二维相关光谱分析。第2步：提取光谱特征，本研究采用包络线去除方法来扩大较弱的特性信息，同时压抑背景光谱 [19] 。第3步：根据包络线去除后的光谱，选择不同TVB-N对应光谱具有明显差异的敏感波段。第4步：对上述敏感波段分别进行二维相关同步光谱分析，获取其二维同步光谱及自相关谱。第5步：通过解析同步谱和自相关谱，明确与TVB-N变化密切相关的特征波长。
基于所选的特征波长，分别从原始、经SNV预处理、归一化预处理后的光谱中提取相应的光谱数据组成新的光谱矩阵，建立优化的判别模型。整个数据分析流程图如图1所示。上述预处理和建模过程在Matlab 2012a平台下利用PLS-Toolbox完成，二维光谱解析在萨斯喀彻温大学加拿大光源编写的MIDAS软件下完成。
图1 数据分析流程图
Fig. 1 Flow chart of data analysis
根据测定的TVB-N对58 个猪肉样品的新鲜度进行统计分析，共有14 个新鲜肉、34 个次新鲜肉以及10 个腐败肉。将所有样品按照3∶1的比例分为校正集和验证集，校正集有43 个样品，验证集有15 个样品。将3 类样品分别赋值为1、2、3，各子集样品的新鲜度情况如表1所示。
表1 3 种新鲜度猪肉的类别赋值及其在校正集和验证集中分布
Table 1 Category assignment of three kinds of pork and their distribution in calibration and prediction set
由于原始光谱信息两端噪音较大，信噪比低，因此只截取400～1 000 nm波段范围内的光谱用于后续定性判别分析。从新鲜、次新鲜和腐败猪肉中各取一个样品进行光谱信息的对比分析，其原始一维近红外光谱如图2a所示，3 类样品整体上趋势一致，在545～585 nm之间具有明显差异，该波段范围与肉中色素的变化有关 [20] 。经过SNV和归一化预处理后的光谱曲线如图2b和c所示，2 种预处理方法均能有效消除基线漂移、光散射等噪音信号，提高光谱分辨率和灵敏度。
图2 样品光谱曲线
Fig. 2 Spectral curves of samples
为寻找能对猪肉新鲜度快速评价的关键变量，以TVB-N为外部微扰条件，选择10 条代表性光谱并进行包络线去除，以增强对TVB-N变化敏感波段的光谱特征，同时也增强每条曲线上各个波段之间光谱信息的对比性。包络线去除前后的光谱曲线对比如图3所示，经过包络线去除后光谱集中在0～1之间，且在460、590 nm及960 nm波长处出现明显的波谷，可见光波段范围内的波谷与肉中肌红蛋白的浓度和状态有关，960 nm波长处与N—H键的二级倍频有关。在进行二维相关光谱分析之前，为尽可能详尽的挖掘有效变量，避免微弱的特征信息被隐藏，结合包络线去除后的光谱曲线，将不同TVB-N光谱曲线之间具有差异的波段细分为7 个子区间，分别进行二维同步光谱解析。这7 个子区间分别为400.1～429.4、430.6～494.8、496.0～550.4、555.1～584.0、585.7～680.3、835.9～954.7、955.8～999.5 nm。
图3 代表性光谱包络线去除前后对比图
Fig. 3 Comparison of representative spectra before and after continuum removal
对7 个子区间分别进行二维光谱分析，其三维投影图和自相关谱图分别如图4、5所示。三维立体图形的X轴和Y轴为独立的变量轴，一般为波长或波数，本研究中的变量为波长；Z轴为因变量轴，本研究中以相关强度为Z轴构成三维投影图 [21] 。同步谱反映了动态光谱信号随外部扰动发生变化的协同程度，它关于主对角线对称分布，可以从三维同步图中直观地观察到自相关峰的位置、强度。自相关峰位于主对角线上，它的强度反映了该变量处光谱信号随外部扰动变化的程度 [22-28] 。结合自相关谱图，在波峰位置处相关强度大，表明该变量处光谱信号对微扰较敏感，即为所要寻找的与新鲜度密切相关的特征信息。
结合图4a、5a，在400.1～429.4 nm波长范围内，主对角线上411 nm和428 nm波长处出现微弱的自相关峰，表明这两个波长下的光谱信号对外部微扰敏感，与TVB-N的变化有一定的关系。根据Benesch等 [29] 的研究，415 nm为氧合血红蛋白的吸收峰，430 nm为脱氧血红蛋白的吸收峰，本研究中的波长位置与之稍有偏移，这可能与所用光谱仪器的响应有关。结合图4b、5b，在430.6～494.8 nm波长范围内，434、461 nm和490 nm波长处出现自相关峰，434 nm为脱氧肌红蛋白的吸收峰，该处的相关强度高于461 nm和490 nm，从三维投影图的颜色参考图中也可以直观地看出。结合图4c、5c，在496.0～550.4 nm波段范围内，508、521 nm和537 nm波长处出现自相关峰，且537 nm处的强度高于前二者，表明该位置处对应的官能团随TVB-N变化更加明显。根据Liu Yang等 [30] 的研究，505 nm为高铁肌红蛋白的吸收峰，535 nm为氧合肌红蛋白的吸收峰，本研究的特征变量虽稍有偏移，但仍可将其归属为二者的吸收峰。结合图4d、5d，在555.1～584.0 nm波段范围内，560、569 nm和580 nm处出现自相关峰，其中580 nm处的强度最高。参考Mancini等 [20] 研究可知，530～580 nm波段范围为肌红蛋白色素的特征波段。结合图4e、5e，在585.7～680.3 nm波段范围内，595 nm波长处出现较强的自相关峰，在620、630 nm和667 nm波长处出现3 个相对弱的自相关峰。其中，630 nm为硫化肌红蛋白的吸收峰，这是由于肉在放置过程中细菌产生的H 2 S气体与肌红蛋白结合，形成了硫化肌红蛋白。结合图4f、5f，在835.9～954.7 nm波段范围内，937 nm波长处出现一个较强的自相关峰，其与C—H键的三级倍频有关。结合图4g、5g，在955.8～999.5 nm波段范围内，977 nm波长处出现较弱的自相关峰，与O—H键的一级倍频有关。
图4 不同波段范围内猪肉样品的二维相关同步光谱
Fig. 4 2D-correlation spectra of pork samples in different spectral regions
图5 不同波段范围内的自相关谱
Fig. 5 Autocorrelation spectra in different spectral regions
综合各个波段，可以发现通过解析二维相关同步光谱，得到的17 个特征变量多集中在可见波段。这与肉在贮藏放置过程中，由于微生物繁殖产生氢过氧化物，引起肉中色素发生变化有关。同时，由于厌氧菌分解蛋白质和氨基酸等产生吲哚、甲胺和H 2 S等物质，脂肪氧化形成硫代巴比妥酸等物质，这些均会促进肌红蛋白的转化和血红素的氧化 [31] 。
表2 基于全波段光谱的SVM判别分析模型结果
Table 2 Discrimination results of SVM models based on full-band spectra
首先，基于全波段光谱数据建立猪肉新鲜度的SVM判别模型，并比较原始、经SNV预处理和归一化预处理光谱的建模效果，如表2所示。可见基于这3 类光谱信息，在校正集中分别有6、4、5 个样品误判，验证集中均有1 个样品误判，且均为腐败样品被误判，总体判别正确率为87.93%、91.38%和89.66%，同时也可看出预处理对模型的效果有所改善，预测总体正确率有所提高。
然后，利用解析二维相关光谱得到的17 个特征变量，建立优化的判别分析模型。基于所选特征波长，利用原始光谱信息建立的SVM模型，校正集中次新鲜样品全部判断正确，新鲜和腐败样品各有1和2 个误判，验证集样品全部判断正确，总体判别正确率为94.83%。利用SNV预处理后光谱建立的SVM模型，校正集中新鲜和次新鲜样品全部判断正确，腐败样品有1 个误判，验证集样品全部判断正确，总体判别正确率为98.28%。利用归一化预处理后光谱信息建立的模型效果与SNV预处理后建模效果一致，总体判别正确率为98.28%，其校正集和验证集样品判别结果如图6所示，可见除第40号腐败样品被误判为次新鲜外，其余样品均判断正确。同时也进一步验证了光谱的预处理有助于改善模型，提高模型预测效果。优化后的判别模型，仅利用了总体变量1.61%（原始变量个数为1 059）的特征变量，取得了更佳的模型结果。这表明通过二维同步光谱分析选出的17 个变量，能够反映与猪肉新鲜度密切相关的特征信息，表征不同TVB-N的光谱变化，简化判别模型，缩短运算处理时间。
图6 基于归一化预处理光谱特征变量的判别模型结果
Fig. 6 Discrimination results using feature variables based on spectra after normalization
以TVB-N为外界干扰，通过解析二维相关同步光谱和自相关谱，共提取到17 个与新鲜度有关的特征变量。基于原始、SNV预处理及归一化预处理后的光谱，利用特征波长对应光谱建立的SVM模型效果优于全波段光谱，总体判别正确率为94.83%、98.28%和98.28%。同时也说明，光谱的预处理有助于改进模型效果。可见-近红外光谱结合二维相关分析，可以有效的解析肉在腐败变质过程中的光谱特征信息变化，确定与新鲜度相关的敏感变量。该方法简单快速，为近红外光谱特征变量筛选提供了一种新的方法。二维相关光谱包含信息丰富，选择的外扰不同得到的谱图不同，可进一步借助化学计量学方法，对各官能团的变化进行有效解析，提取特征光谱信息。
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Evaluation of Pork Freshness Using Two-Dimensional Correlation Visible/Near-Infrared Spectroscopy Combined with Support Vector Machine
WANG Wenxiu, PENG Yankun*, SUN Hongwei, WEI Wensong, ZHENG Xiaochun
(National Research and Development Center for Agro-Processing Equipment, College of Engineering,China Agricultural University, Beijing 100083, China)
Abstract: In order to explore the feasibility of two-dimensional correlation synchronous spectra to select feature variables for meat freshness, visible/near infrared reflectance spectral information and total volatile basic nitrogen (TVB-N) content of 58 pork samples stored for 1–15 days were obtained. Then TVB-N content was employed as “external disturbance”and 10 representative spectra were selected for continuum removal. Seven spectral subregions were chosen according to the spectral difference and used for two-dimensional correlation analysis. By analyzing the synchronization spectra and the autocorrelation spectra, sensitive variables, which were closely related to TVB-N content, were obtained. Finally,using the selected variables, support vector machine (SVM) models for discrimination of pork freshness were established based on the original, standard normal variate preprocessed and normalized spectra, respectively. The results showed that 17 characteristic wavelengths, which accounted for only 1.61% of the total variables, were extracted by twodimensional correlation spectral analysis, and that the overall accuracy rates of the SVM models were 94.83%, 98.28%and 98.28% respectively, indicating that the models performed well. Hence two-dimensional correlation analysis can be used to screen out the characteristic variables related to meat freshness. The research will be helpful for analyzing the change of spectral characteristics during meat spoilage and also provide new insights into variables selection in near infrared spectroscopy analysis.
Keywords: visible/near-infrared spectroscopy; two-dimensional correlation spectrum; freshness; pork; discrimination model
WANG Wenxiu, PENG Yankun, SUN Hongwei, et al. Evaluation of pork freshness using two-dimensional correlation visible/near-infrared spectroscopy combined with support vector machine[J]. Food Science, 2018, 39(18): 273-279. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201818042. http://www.spkx.net.cn
王文秀, 彭彦昆, 孙宏伟, 等. 二维相关可见-近红外光谱结合支持向量机评价猪肉新鲜度[J]. 食品科学, 2018, 39(18):273-279. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201818042. http://www.spkx.net.cn
文章编号： 1002-6630（2018）18-0273-07
引文格式：
中图分类号： O433
文献标志码： A
*通信作者简介： 彭彦昆（1960—），男，教授，博士，研究方向为农产品无损检测技术与装备研发。E-mail：ypeng@cau.edu.cn
DOI: 10.7506/spkx1002-6630-201818042
基金项目： “十三五”国家重点研发计划重点专项（2016YFD0401205）；国家农产品质量安全风险评估项目（GJFP201701504）
第一作者简介： 王文秀（1989—），女，博士研究生，研究方向为农产品无损检测技术与装备研发。E-mail：Godlovexiu@163.com
收稿日期： 2017-10-17