黑木耳多糖AAP-10对免疫抑制小鼠的免疫调节作用

（1.广东药科大学公共卫生学院，广东广州 510310；2.广东药科大学食品科学学院，广东中山 528453；3.广东药科大学基础学院，广东广州 510006；4.无限极（中国）有限公司，广东新会 529156）

摘要：通过热水浸提、分级醇沉的方法，从产自浙江龙泉地区的黑木耳中提取分离得到一种多糖（命名为AAP-10）；采用一系列理化分析手段对多糖进行了初步表征；采用环磷酰胺（cyclophosphamide，CPA）免疫抑制小鼠动物模型，研究AAP-10对小鼠免疫功能的调节作用。结果表明：AAP-10为一种纯度较高、分子质量较均一的多糖；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生高效液相色谱法测得AAP-10主要由葡萄糖、甘露糖组成（物质的量比为6∶1）；高压凝胶色谱法测得AAP-10的重均分子质量为6.56×105Da。动物实验结果表明：一定剂量的AAP-10给药能帮助小鼠较快克服CPA注射对其体质量及脾脏造成的负面影响，提高CPA免疫抑制小鼠的脾淋巴细胞转化增殖能力，增强CPA免疫抑制小鼠单核-巨噬细胞的吞噬能力和自然杀伤细胞活性；其中低剂量（2.5 mg/（kg·d））及中剂量（5.0 mg/（kg·d））AAP-10给药效果最佳，说明黑木耳多糖AAP-10具有一定的免疫调节作用。

黑木耳（Auricularia auricula-judae）是一种大型食用真菌，是人工种植最早的商品菌类之一。目前我国黑木耳的年产量估计在300万 t左右，黑木耳资源非常丰富。黑木耳的碳水化合物含量较高，一般占其子实体干质量的60%以上，且大部分为非淀粉多糖[1]。相关研究表明黑木耳多糖具有免疫调节、降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗凝血等多种药理活性[2-7]，被认为是黑木耳的主要功能因子之一。

天然多糖作为一种生物大分子，在组成、结构方面存在多样性；产地、菌种及提取、制备方法不同，得到的多糖在组成、结构方面会存在一定的差异，进而影响其生物活性[8-12]。本课题组的前期研究发现，产自浙江龙泉地区的一种黑木耳不仅多糖含量较高，且其粗多糖具有增强小鼠非特异性免疫的功效[13]。为进一步开发该黑木耳多糖，本研究采用分级醇沉的方法从该黑木耳中获得水溶性多糖AAP-10，并重点研究了其对免疫抑制小鼠的免疫调节作用。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

近交系BALB/c小鼠，雌性，体质量18～22 g，合格证号：SCXK（粤）2013-0020，购自广州中医药大学（大学城）实验动物中心。

水解蛋白酶（novozym37071）诺维信（中国）生物技术有限公司；刀豆蛋白（concanavalin A，ConA）、噻唑蓝（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、葡萄糖、甘露糖等单糖标准品美国Sigma公司；DEAE-52纤维素柱、Sephacryl S-400凝胶柱、葡聚糖标准品（重均分子质量分别为670、270、80、25、12、5 kDa）上海玉博生物科技有限公司；RPMI 1640培养基、新生牛血清美国GIBCO公司；印度墨汁上海亿欣生物科技有限公司；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

752型紫外-可见分光光度计上海棱光技术有限公司；1260高效液相色谱仪美国安捷伦公司；ELx808酶标仪美国BioTek公司；CO2培养箱上海安竞实验设备有限公司；BT100S/YZ15恒流泵上海精科实业有限公司。

1.3 方法

取50.00 g粉碎过筛的黑木耳粉，按课题组前期优化得到的黑木耳多糖提取最佳工艺进行黑木耳多糖提取[13]，重复提取3 次，合并3 次提取液，适当浓缩后调节pH值至7.0，按底物质量的1%加入水解蛋白酶，于55 ℃下搅拌酶解12 h以分解提取液中的游离蛋白。酶解结束后沸水浴加热保温20 min，灭酶，向其中缓慢加入一定量的无水乙醇，直至体系中乙醇的质量分数达到10%，适当搅拌使乙醇分布均匀后置于4 ℃冰箱中醇沉12 h，4 000 r/min离心10 min，收集沉淀物，用蒸馏水将其完全溶解。先用流动自来水透析24 h，再用蒸馏水透析48 h，期间每12 h换一次水，截留液冷冻干燥，得到一种初步精制的黑木耳多糖，命名为AAP-10。准确称质量，记录AAP-10冻干粉的质量，以冻干粉质量与黑木耳粉质量之比计算黑木耳的多糖得率。

准确称取AAP-10冻干粉0.30 g，溶于100 mL蒸馏水中，取经0.45 μm滤膜过滤后的多糖溶液10 mL，过DEAE-52纤维素柱，用1.5 g/L NaCl溶液洗脱，洗脱剂流速为1.0 mL/min，自动部分收集器每5 min收集一管溶液，以苯酚-硫酸法跟踪检测多糖含量。以管号为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制APP-10过DEAE-52纤维素柱的洗脱曲线，收集并合并同一部分。取收集到的主要洗脱部分5.00 mL，直接过Sephacryl S-400凝胶柱，用1.5 g/L NaCl溶液洗脱，采用与DEAE-52纤维素柱类似操作，绘制AAP-10过Sephacryl S-400凝胶柱的洗脱曲线。

参照文献[13]的方法，测定1.3.2节中配制好的AAP-10冻干粉水溶液（过滤膜前）的多糖含量，计算AAP-10的纯度。采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）柱前衍生高效液相色谱法测定多糖的糖基组成[14]；以不同重均分子质量的葡聚糖为标准品，采用高压凝胶渗透色谱法测定多糖的分子质量[15]。

取小鼠40 只，随机分成5 组，分别为正常对照组、环磷酰胺（cyclophosphamide，CPA）模型组以及AAP-10低、中、高剂量给药组，每组8 只。除正常对照组外，其余各组连续3 d每天按体质量80 mg/kg腹腔注射CPA，建立免疫低下小鼠模型。随后，多糖给药组每天灌胃给药，根据前期研究结果，确定AAP-10低、中、高剂量组的多糖给药量分别为2.5、5.0、10.0 mg/（kg·d），灌胃量均为0.2 mL/只，正常对照组和CPA模型组每天灌胃等体积的生理盐水。期间每天定时测动物体质量，2 周后（第17天），各组随机取一半动物进行相关指标检测，另一半动物继续灌胃2 周后（第31天）进行相关指标检测。以脏器质量与体质量的比值表示脏器指数；采用MTT法通过ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验检测小鼠脾淋巴细胞转化增殖能力[16-17]；通过小鼠碳廓清实验检测单核-巨噬细胞功能[18]；采用乳酸脱氢酶测定法检测自然杀伤（natural killer，NK）细胞活性[19]。

1.4 数据统计分析

实验数据均以 ±s表示，运用SPSS 22.0软件，采用单因素方差分析对组间差异进行比较，组内比较采用t检验，以P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 AAP-10的基本理化性质分析

由50.00 g黑木耳子实体干粉得到4.47 g初步精制的AAP-10，多糖得率为8.94%。苯酚-硫酸法测得AAP-10的纯度为97.58%，说明其纯度较高；紫外-可见分光光度计扫描结果表明，AAP-10的水溶液在260、280 nm波长处都没有吸收峰出现，说明多糖冻干粉中不含核酸和蛋白质。

图 2 AAP-10过Sephacryl S-400凝胶柱的洗脱曲线
Fig. 2 Elution prof i le of AAP-10 on Sephacryl S-400 column

从图1可以看出洗脱曲线只有一个峰，说明AAP-10中多糖的性质较为接近。由图2可知曲线只有一个单一对称峰，说明黑木耳多糖AAP-10为分子质量分布较均一的多糖。糖基组成分析结果表明，AAP-10主要由葡萄糖和甘露糖组成，物质的量比为6∶1；分子质量分析结果表明，AAP-10的分子质量为6.56×105Da。

2.2 AAP-10给药对免疫抑制小鼠体质量的影响分析

CPA是一种应用广泛的化疗药物，属于烷化剂类免疫抑制剂，常用于制备免疫抑制动物模型。一定剂量的CPA灌胃或注射，会引起动物体质量下降、免疫器官质量降低等生理反应[20]。从图3可以看出，注射CPA后，小鼠体质量开始显著下降，一直到第7天前后才开始停止下降并逐渐恢复，其中AAP-10中剂量组恢复得最快，CPA模型组及AAP-10高剂量组恢复得较慢。

表 1 AAP-10给药对小鼠体质量的影响
Table 1 Effect of AAP-10 administration on body mass of mice

注：与正常对照组相比，△.差异显著（P＜0.05），△△.差异极显著（P＜0.01）；与CPA模型组相比，*.差异显著（P＜0.05），**.差异极显著（P＜0.01）；下同。

从表1可以看出，在实验第1天各组小鼠体质量无明显差异；与正常对照组相比，在第17天，CPA模型组小鼠体质量显著偏低（P＜0.05）；在第31天，CPA模型组和AAP-10高剂量组小鼠的体质量均极显著低于正常对照组（P＜0.01），但AAP-10低、中剂量组小鼠体质量与正常对照组间差异不显著。实验结果说明，一定剂量的AAP-10给药可改善CPA注射导致的小鼠体质量低于正常对照组的现象。

2.3 AAP-10给药对免疫抑制小鼠脏器指数的影响

从表2可以看出，与正常对照组相比，CPA模型组及AAP-10给药各组小鼠第17天的肝脏指数极显著增大（P＜0.01）；AAP-10给药各组小鼠第31天的肝脏指数与CPA模型组差异不明显。CPA注射小鼠的体质量略低于正常小鼠（表1），可能是导致其的肝脏指数高于正常对照组的原因之一。

表 2 AAP-10给药对小鼠脏器指数的影响
Table 2 Effect of AAP-10 administration on liver index and spleen index of mice

CPA模型组小鼠的脾脏指数与正常对照组间差异不显著；由于注射CPA会导致小鼠体质量下降，因此可以认为CPA注射导致了小鼠脾脏质量低于正常小鼠。AAP-10给药各组小鼠第17天的脾脏指数与正常组相比均极显著升高（P＜0.01），与肝脏指数的结果类似，推测与CPA注射导致小鼠的体质量略低于正常小鼠有关。与CPA模型组相比，在第17天，AAP-10给药各剂量组小鼠的脾脏指数均极显著增加（P＜0.01）；而在第31天，仅有AAP-10低剂量组小鼠脾脏指数极显著增加（P＜0.01）。实验结果表明，AAP-10给药能在一定程度上升高CPA免疫抑制小鼠的脾脏指数，即缓解了CPA注射对小鼠脾脏的负面影响。

2.4 AAP-10给药对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞转化增殖能力的影响分析

表 3 AAP-10给药对小鼠脾淋巴细胞转化增殖能力的影响
Table 3 Effect of AAP-10 administration on lymphocyte activity of mice

从表3可以看出，与正常对照组相比，CPA模型组小鼠脾淋巴细胞转化增殖能力极显著下降（P＜0.01），而AAP-10各剂量组小鼠脾淋巴细胞转化增殖能力无显著差异（P＞0.05）。与CPA模型组相比，AAP-10各剂量组小鼠脾淋巴细胞转化增殖能力均显著提高（P＜0.05，P＜0.01），说明AAP-10能够显著提高免疫抑制小鼠的细胞免疫功能。

2.5 AAP-10给药对免疫抑制小鼠单核-巨噬细胞功能的影响分析

单核-巨噬细胞属于机体固有免疫系统重要成员，具有免疫防御、免疫监视、免疫调节以及抗原递呈等多种免疫功能。小鼠碳廓清实验可用于评价小鼠单核-巨噬细胞吞噬廓清异体颗粒的能力，从而评价小鼠的非特异性免疫功能。

表 4 AAP-10给药对小鼠碳廓清能力的影响
Table 4 Effect of AAP-10 administration on carbon clearance capacity of mice

从表4可以看出，CPA模型组小鼠碳廓清能力极显著低于正常对照组（P＜0.01），说明CPA注射导致小鼠单核-巨噬细胞吞噬廓清异体颗粒的能力有所下降。在第31天，AAP-10各剂量组小鼠碳廓清能力与正常对照组相比存在显著差异（P＜0.05，P＜0.01），但一定剂量的多糖可使吞噬指数增大。与CPA模型组比较，在第17天，AAP-10各剂量组均能极显著提高CPA免疫抑制小鼠的碳廓清能力（P＜0.01），但在第31天差异不显著。从实验结果可以看出，多糖给药能改善CPA免疫抑制小鼠单核-巨噬细胞的吞噬廓清能力，说明AAP-10具有一定的免疫调节功能。

2.6 AAP-10给药对免疫抑制小鼠NK细胞活性的影响

表 5 AAP-10给药对小鼠NK细胞活性的影响
Table 5 Effect of AAP-10 administration on NK cell activity of mice

从表5可以看出，与正常对照组相比，CPA模型组小鼠的NK细胞活性虽有所下降，但差异不显著（P＞0.05）；与CPA模型组相比，AAP-10各剂量组小鼠NK细胞活性在第17天均有显著提高（P＜0.05，P＜0.01），但在第31天差异不显著，可能是随着时间的延长CPA对小鼠的负面影响逐渐减弱所致。

3 讨论

乙醇沉淀是将多糖从其水溶液中分离出来最常用的方法，该方法利用乙醇的脱水作用，降低多糖在水中的溶解度，使多糖沉淀析出。乙醇质量分数不同，沉淀析出的多糖在组成结构和功能方面会有一定的差别[21-23]。本研究利用质量分数10%的乙醇溶液，从产自浙江龙泉地区的一种黑木耳的水提物中分离得到一种组成结构和分子质量分布较均一的多糖AAP-10，得率为8.94%，经精制后纯度达到97.58%。

恶性肿瘤是威胁人类健康的重大疾病，近年来其发病率在全球范围内总体呈上升趋势。据估计，我国2013年新发恶性肿瘤约368.2万例，死亡222.9万例，全国恶性肿瘤发病率为270.59/10万例，防控形势非常严峻[24]。放化疗是目前中晚期恶性肿瘤的主要治疗方法，但副作用较大，且对有些恶性肿瘤疗效并不理想。黑木耳多糖被报道具有明显的抗肿瘤活性[25-26]，在我国民间也有在将黑木耳作为肿瘤放化疗病人辅食的做法。CPA是一种烷化剂，可干扰DNA及RNA功能，抑制DNA合成，发挥杀伤肿瘤细胞的作用，但对机体正常细胞也有杀伤作用，具有免疫抑制等毒副作用[27-28]。多糖能够在一定程度上调节机体的免疫功能，拮抗CPA的毒副作用，发挥减毒增效作用[29-30]。脾脏是重要的外周免疫器官，是机体对血源性抗原产生免疫应答的主要场所。本研究结果表明，一定剂量的AAP-10给药能缓解CPA注射对小鼠脾脏的负面影响。此外，较低剂量（2.5～5.0 mg/（kg·d））的AAP-10给药就能增强CPA免疫抑制小鼠的脾淋巴细胞转化增殖能力、单核-巨噬细胞的吞噬廓清能力、NK细胞活性。因此可以认为，黑木耳多糖AAP-10具有增强CPA免疫抑制小鼠免疫功能的作用，且在保健食品、特殊医学用途食品等领域具有良好的应用前景。

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Auricularia auricula-judae Polysaccharide AAP-10 and Its Immunoregulatory Activity on Immunosuppressed Mice

GAN Ni1, XU Hailin1, WU Xiaoyong2,*, YIN Hui3, HUANG Yansheng4, NING Chuguang4
(1. School of Public Health, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510310, China;2. School of Food Science, Guangdong Pharmaceutical University, Zhongshan 528453, China; 3. School of Basic Courses,Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China; 4. Inf i nitus (China) Co. Ltd., Xinhui 529156, China)

Abstract:In this study, a polysaccharide named AAP-10 was isolated from Auricularia auricula-judge from Longquan region of Zhejiang province by hot water extraction and stepwise ethanol precipitation. Physicochemical analyses were used to characterize the polysaccharide. Furthermore, this study evaluated the immunomodulatory effect of polysaccharide AAP-10 in a mouse model of immunosuppression induced by cyclophosphamide (CPA). Results indicated that AAP-10 had high purity and was a homogeneous polysaccharide. Monosaccharide composition analysis showed that AAP-10 was mainly composed of glucose and mannose at a molar ratio of 6:1 as determined by high performance liquid chromatography with precolumn derivatization with 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone. High-performance gel-permeation chromatography analysis showed that the average molecular mass of AAP-10 was 6.56 × 105Da. Moreover, the negative effect of CPA on body mass and spleen of immunosuppressed mice was improved by AAP-10 administration at a certain dose. In addition,AAP-10 enhanced the proliferation of splenic lymphocytes and natural killer cell activity, as well as mononuclear macrophage phagocytosis, especially at low and intermediate doses (2.5 and 5.0 mg/(kg·d)). These results showed that AAP-10 had good immunoregulatory effect in immunosuppressed mice.

Keywords:Auricularia auricula-judae; polysaccharide; immunoregulation; cyclophosphamide

GAN Ni, XU Hailin, WU Xiaoyong, et al. Auricularia auricula-judae polysaccharide AAP-10 and its immunoregulatory activity on immunosuppressed mice[J]. Food Science, 2018, 39(19): 196-200. (in Chinese with English abstract)

甘霓, 许海林, 吴小勇, 等. 黑木耳多糖AAP-10对免疫抑制小鼠的免疫调节作用[J]. 食品科学, 2018, 39(19): 196-200.

*通信作者简介：吴小勇（1972—），男，副教授，博士，研究方向为功能性食品的研究与开发。E-mail：perryfe@163.com

第一作者简介：甘霓（1992—），女，硕士研究生，研究方向为多糖结构与功能。E-mail：280413302@qq.com