表 1 qPCR引物序列
Table 1 Primer sequences used for qPCR
刘 聪1，孙伟静1，李 宁1，高佳琪1，于泽鹏1，敬 舒2，王春梅1，孙靖辉1，陈建光1，李 贺1,*
（1.北华大学药学院药理教研室，吉林 吉林 132013；2.北华大学附属医院，吉林 吉林 132013）
摘 要：目的：观察五味子乙素（schisandrin B，SCB）对D-半乳糖致衰老小鼠学习记忆能力的改善作用。方法：ICR小鼠随机分为4 组，即正常对照组（灌胃蒸馏水，皮下注射生理盐水）、衰老模型组（灌胃蒸馏水，皮下注射220 mg/kg D-半乳糖）、SCB（M）组（灌胃20 mg/kg SCB，皮下注射D-半乳糖220 mg/kg）、SCB（C）组（灌胃20 mg/kg SCB，皮下注射生理盐水），连续给药7 周。通过避暗实验及Morris水迷宫实验观察SCB对小鼠学习记忆能力的影响；通过WST-1法检测小鼠脑组织中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力；通过硫代巴比妥酸法检测小鼠脑组织中丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量；通过实时定量聚合酶链式反应及Western blot法，检测小鼠脑组织中p19、p53、p21基因表达情况。结果：SCB能够明显改善D-半乳糖诱导的脑衰老小鼠的学习记忆能力，提高脑衰老小鼠脑组织中SOD活力，降低MDA水平，明显降低脑组织中的p19、p53、p21基因的表达水平。结论：SCB能够改善D-半乳糖诱导的小鼠脑衰老，该作用可能与其提高小鼠抗氧化能力及下调小鼠脑组织中p19、p53、p21基因表达水平有关。
关键词：五味子乙素；改善老年记忆障碍；p19基因；p53基因；p21基因
随着全球人口不断老龄化，衰老人群日益增多。学习记忆能力减退与障碍是衰老人群的主要特征。研发具有辅助改善记忆功能的保健食品及药物前景广阔。本研究前期工作显示，五味子总木脂素对D-半乳糖所致衰老小鼠具有显著的改善记忆作用[1-2]。但该作用主要由哪些活性成分引起尚不清楚。五味子乙素（schisandrin B，SCB）是五味子木脂素中含量最高的联苯环辛烯类单体化合物，是五味子中主要活性成分之一[3-4]。已有研究报道SCB具有较强的抗氧化性[5-8]，但目前鲜有SCB对D-半乳糖致衰老小鼠学习记忆能力影响的相关研究。因此，本研究通过D-半乳糖建立小鼠衰老模型，探讨SCB的改善记忆作用及相关机制，为开发辅助改善记忆功能的保健食品及药物提供依据。
清洁级健康ICR小白鼠，雄性，体质量（20±2）g，由吉林大学实验动物研究中心提供，实验动物生产许可证号SCXK（吉）：2015-0005。小鼠采取分笼饲养，且维持12 h∶12 h昼夜循环，饲料供给充足，自由饮水。
SCB 四川省维克奇生物科技有限公司；羧甲基纤维素钠（分析纯） 山东潍坊力特复合材料有限公司；二氧化钛（分析纯）、吐温20（分析纯） 天津永大试剂公司；D-半乳糖 美国S i g m a公司；HCl-Tris、30%丙烯酰胺、TEMED、过硫酸铵、Tris、甘氨酸 北京鼎国试剂公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒、MDA试剂 南京建成生物工程研究所；脱脂奶粉 美国BD公司；p53蛋白、p21蛋白、p19蛋白 英国Abcam公司；ECL显色液碧云天生物制品有限公司；RNA抽提试剂盒 美国Vazyme公司；SYBR Green Real-time 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）Super Mix 美国Invitrogen公司。
infiniteM200全自动酶标仪 瑞士TECAN公司；Western blot电泳仪、电转仪及实时荧光定量（quantitative real-time PCR，qPCR）仪 美国Bio-Rad公司；ChampChemi Professional+全自动多色荧光及化学发光凝胶成像系统 北京赛智创业科技有限公司；DT-200小鼠避暗仪、MT-200 Morris水迷宫分析仪 成都泰盟科技有限公司。
1.3.1 动物分组及给药
ICR小鼠随机分为4 组，每组15 只。1）正常对照组（CON）组：每天灌胃蒸馏水及颈后皮下注射生理盐水；2）衰老模型（MOD）组：每天灌胃蒸馏水及颈后皮下注射220 mg/kg D-半乳糖；3）SCB（M）组：每天灌胃20 mg/kg SCB，皮下注射220 mg/kg D-半乳糖；4）SCB（C）组：每天灌胃20 mg/kg SCB，皮下注射生理盐水。
1.3.2 小鼠避暗实验
将小鼠放入避暗仪中，面部背向洞口放入明室，从小鼠进入洞口至其到达暗室的时间即为潜伏期。本实验对小鼠训练5 min，记录在5 min内小鼠的错误次数。间隔24 h后进行第二次实验。记录每只鼠的潜伏期以及在5 min内出现的错误次数[9]。
1.3.3 Morris水迷宫实验
将小鼠放在Morris水迷宫视频跟踪测试系统中，设置小鼠的训练时间设定为120 s，在120 s内未达到终点的小鼠按120 s记录。每隔24 h训练1 次，采集第5天的实验数据。第一次实验之前将小鼠放在平台附近，使其自动爬上3 次。以后每次训练前将小鼠放在平台附近，使其自主爬上到平台一次。第6天把平台去掉统计小鼠空间搜索能力。并记录小鼠穿越平台的次数和穿越有效区的次数[10]。
1.3.4 SCB对衰老小鼠体内SOD活力和MDA含量的影响
从1.3.3节的各组中随机选取10 只小鼠，在末次给药后30 min后处死小鼠，取出脑组织及血清，应用WST-1法检测SOD活力，应用硫代巴比妥酸法检测MDA含量。具体方法参照试剂盒说明书。
1.3.5 小鼠脑组织中p19、p53、p21基因表达的检测
1.3.4节中小鼠末次给药后30 min，每组取3 只小鼠脑组织，应用试剂盒提取细胞总RNA，按逆转录反应试剂盒说明操作合成cDNA。按试剂盒说明进行qPCR扩增，在GenBank里查找各基因序列号，采用Primer 6.0软件进行引物设计，由北京鼎国昌盛生物工程公司合成，以β-actin为内参基因，引物序列见表1。
表 1 qPCR引物序列
Table 1 Primer sequences used for qPCR
qPCR条件为95 ℃、10 min，1 个循环；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，40 个循环。95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃、15 s，1 个循环，制备溶解曲线。采用2-△△Ct进行相对定量。
1.3.6 Western blot法检测脑组织中p19、p21及p53蛋白的表达情况1.3.4节中小鼠末次给药后30 min，每组取3 只小鼠脑组织，加入裂解液，冰上裂解1 h，高速离心机离心取上清液。以二喹啉甲酸法测定组织蛋白浓度，以10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶电泳分离p19、p53、p21蛋白。2 h电转移至聚丙二氟乙烯膜，取出膜在Tris缓冲液（TBS-T）中漂洗5 min，然后用封闭液封闭1 h（含5%脱脂奶粉的TBS-T）。室温孵育后弃去封闭液，分别加入一抗p19（1∶1 000）、p53（1∶1 000）、p21（1∶1 000），4 ℃温育过夜后，TBS-T洗5 次，每次5 min。加入二抗（1∶2 000）温育2 h，TBS-T洗5 次，每次5 min，最后加入显色液ECL显色。
采用SPSS 19.0软件进行统计分析。避暗实验中的潜伏期、错误次数、Morris水迷宫实验中的穿越平台、穿越有效区次数、在目标象限停留时间及穿越平台次数，小鼠脑组织中的SOD活力、MDA含量，qPCR和Western blot的实验数据用
±s表示，组间两样本均数比较采用t检验。
避暗实验结果显示，第2天的记忆测试中（图1A），与CON组相比，MOD组小鼠潜伏期明显缩短（P＜0.01），SCB（C）组小鼠未见明显差异；与MOD组比较，SCB（M）组小鼠潜伏期明显延长（P＜0.05）。如图1B所示，与CON组相比，MOD组小鼠5 min内错误次数明显增多（P＜0.01），SCB（C）组小鼠未见明显差异；与MOD组比较，SCB（M）组错误次数减少（P＜0.05）。以上结果提示SCB能够提高D-半乳糖所致衰老小鼠的学习记忆能力。
图 1 避暗实验观察SCB对脑衰老小鼠潜伏期和错误次数的影响（n＝ 15）
Fig. 1 Effect of SCB on learning and memory in aging mice in dark avoidance test (n = 15)
2.2.1 定位航行实验结果
图 2 定位航行实验中小鼠游泳潜伏期（n＝15）
Fig. 2 Swimming latency of mice in orientation navigation test (n = 15)
定位航行实验结果如图2显示，随训练时间延长，各组小鼠找到平台时间逐渐缩短。与CON组比较，MOD组小鼠在训练第4天（P＜0.05）及第5天（P＜0.01）找到平台时间明显延长；SCB（C）组未见明显差异。与MOD组比较，在训练第5天，SCB（M）组小鼠找到平台潜伏期明显缩短（P＜0.05）。以上结果进一步提示SCB能够提高D-半乳糖所致衰老小鼠的学习记忆能力。
2.2.2 空间搜索实验结果
如图3、4所示，与CON组比较，MOD组小鼠在平台所在象限的停留时间明显缩短（P＜0.01），穿过原平台的次数减少（P＜0.05），SCB（C）组未见明显差异。与MOD组相比，SCB（M）组在平台所在象限的停留时间明显延长（P＜0.05）。以上结果进一步证实SCB能够提高D-半乳糖所致衰老小鼠的学习记忆能力。
图 3 空间搜索实验中SCB对脑衰老小鼠目标象限停留时间及经过平台次数的影响（n ＝15）
Fig. 3 Effect of SCB on the time spent in target quadrant and the number of platform crossing in aging mice in spatial probe test (n = 15)
图 4 空间搜索实验中小鼠游泳轨迹图（n＝15）
Fig. 4 Swimming trajectory of mice in spatial probe test (n = 15)
图 5 SCB对脑衰老小鼠脑组织中SOD活力（A）及MDA含量（B）的影响（n＝15）
Fig. 5 Effect of SCB on SOD activity (A) and MDA content (B) in the brain tissue of aging mice (n = 15)
如图5A所示，与CON组比较，MOD组小鼠脑组织SOD活力明显降低（P＜0.01），SCB（C）组小鼠脑组织SOD活力明显增高（P＜0.05）；与MOD组比较，SCB（M）组小鼠脑组织SOD活力明显增高（P＜0.05）。对各组小鼠脑组织M D A含量检测结果如图5 B所示，与CON比较，MOD组小鼠脑组织MDA含量明显升高（P＜0.01），SCB（C）组小鼠脑组织MDA含量明显降低（P＜0.05）；与MOD组比较，SCB（M）组小鼠脑组织MDA含量明显降低（P＜0.05）。上述结果提示SCB可能通过提高小鼠脑组织的抗氧化能力而发挥抗脑衰老作用。
图 6 SCB对小鼠脑组织p19、p53、p21 mRNA表达的影响（n＝3）
Fig. 6 Effect of SCB on mRNA expression of p19, p53 and p21 genes in the brain tissues of mice (n = 3)
本研究应用qPCR及Western blot方法分别从mRNA水平及蛋白水平观察各组小鼠p19、p53、p21基因的表达情况。qPCR结果如图6所示，与CON组比较，MOD组小鼠脑组织p19、p53、p21 mRNA表达量明显增多（P＜0.05）；与MOD组相比，SCB（M）组p19、p53、p21 mRNA表达量明显减少（P＜0.05）。SCB（C）与CON组相比未见统计学差异。上述结果提示SCB可能通过抑制p19、p53、p21 mRNA的表达而发挥改善记忆作用。
图 7 SCB对小鼠脑组织p19、p53、p21蛋白表达的影响（n＝3）
Fig. 7 Effect of SCB on protein expression of p19, p53 and p21 genes in the brain tissue of mice (n = 3)
Western blot结果如图7所示，与CON组比较，MOD组小鼠脑组织p19、p53、p21蛋白表达水平均明显增多（P＜0.01）；SCB（C）组小鼠p19（P＜0.05）、p21（P＜0.01）蛋白表达水平明显减少，p53蛋白表达水平未见明显差异；与MOD组相比，SCB（M）组p19、p53、p21蛋白表达水平明显减少（P＜0.01）。进一步验证SCB有可能通过抑制p19、p53、p21表达而发挥相关作用。
人口的老龄化使抗衰老研究成为热点。自由基损伤学说是众多科学家共识的衰老学说[11-14]。随着年龄的增长，体内多种自由基逐渐在细胞组织中累积，最终导致衰老产生。皮下注射D-半乳糖是常用的构建衰老模型的方法，此法通过自由基过量产生而引起衰老，与衰老学说的自由基理论相符合[15-17]。本研究前期结果显示，五味子总木脂素能够明显改善D-半乳糖致衰小鼠的学习记忆能力，但其主要的活性成分尚不清楚。SCB是五味子木脂素中的单体化合物成分，已有文献报道SCB具有较强的抗氧化能力[5-8]。因此，猜测五味子总木脂素的上述作用可能与SCB密切相关。前期对SCB的最佳剂量进行了摸索，结果显示20 mg/kg效果较好，因此，在本研究中将20 mg/kg SCB作为单一的给药剂量给予D-半乳糖致衰小鼠。此外，本实验设立了SCB（C）组，即将SCB应用于健康小鼠，以观察SCB对健康小鼠的影响。
SOD是机体最主要的抗氧化酶，它在机体氧化与抗氧化平衡中起着重要的作用，而MDA作为脂质过氧化反应的重要产物，在脑组织中的含量随着机体的逐渐衰老而不断升高，是反映自由基导致的机体损伤程度的重要指标[18-21]。本实验结果显示，SCB可以提高衰老小鼠脑组织SOD的活性，降低MDA含量，显示较强的抗氧化作用；另外，与空白组相比，SCB（C）组小鼠脑组织SOD活力明显增高，MDA含量明显降低，提示SCB在衰老模型鼠及健康鼠都表现出明显的抗氧化作用，该结果与其他研究SCB抗氧化功能的报道[6-8]是一致的。
氧化应激引发细胞衰老的多种途径涉及p53基因表达的改变。p53作为一种位于多种调控网络关键节点的应激蛋白，受到刺激便会大量堆积，进而促进凋亡因子Puma和Bax等的表达，诱导细胞凋亡，进而导致机体衰老[22-24]。p53水平主要取决于泛蛋白化和随后的蛋白酶降解速率。主要针对p53的E3-type泛蛋白连接酶是MDM2，可以促进p53被泛蛋白介导的蛋白酶体降解。p19ARF是p53的上游基因，p19ARF蛋白直接结合并抑制MDM2的活性，使其不能介导p53蛋白的降解，其表达水平升高是p53激活的原因之一[25-26]。p53的下游靶分子是p21，p21是Cyclin依赖的蛋白激酶的抑制因子，既可导致G1期停滞也可以导致G2期停滞，在细胞受到刺激后，p53表达水平迅速上调，激活p21基因，进而抑制Cyclin A/E-CDK2的活性，阻止细胞周期的进行[27-30]。可见，p19-p53-p21信号途径在细胞衰老中发挥重要调节作用。本研究应用qPCR及Western blot方法分别从mRNA水平及蛋白水平观察各组小鼠p19、p53、p21的表达情况。结果显示两种方法得到的结果是一致的，即SCB能够在mRNA及蛋白水平上下调D-半乳糖致衰小鼠p19、p53、p21基因的表达进而发挥相关作用。
由于小鼠学习记忆能力容易受外界环境因素的影响，本实验中选择了两种不同的行为学实验方法（避暗实验、Morris水迷宫实验）进行对比印证，以减少实验结果的不稳定性。实验结果表明，无论在避暗实验还是水迷宫实验中，与MOD组比较，SCB均表现出良好的学习记忆能力；与CON组比较，SCB（C）组未见明显差异。提示SCB能够改善D-半乳糖所致的衰老小鼠的学习记忆能力，而对健康小鼠学习记忆能力的影响较小，这可能是由于健康鼠未出现D-半乳糖所致的学习记忆障碍，SCB的抗氧化作用而发挥的记忆改善作用不能充分体现。其具体机制将在后续的实验中继续研究。
综上，本研究证实了SCB对D-半乳糖致脑衰老小鼠的学习记忆能力具有改善作用，该作用可能与其提高小鼠抗氧化能力以及降低小鼠脑组织中p19、p53、p21基因表达水平有关。本研究为开发具有辅助改善记忆功能的药物及保健食品提供理论依据。
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Schisandrin B Improves D-Galactose-Induced Learning and Memory Impairment in Aging Mice
LIU Cong1, SUN Weijing1, LI Ning1, GAO Jiaqi1, YU Zepeng1, JING Shu2, WANG Chunmei1, SUN Jinghui1, CHEN Jianguang1, LI He1,*
(1. Department of Pharmacology, College of Pharmacy, Beihua University, Jilin 132013, China;2. Aff i liated Hospital of Beihua University, Jilin 132013, China)
Abstract:Objective: To observe whether schisandrin B (SCB) can improve D-galactose-induced learning and memory impairment in aging mice. Methods: ICR mice were randomly divided into normal control group (intragastrically administered with distilled water and subcutaneously injected with normal saline), aging model group (intragastrically administered with distilled water and subcutaneously injected with 220 mg/kg D-galactose), SCB (M) group (intragastrically administered with 20 mg/kg SCB and subcutaneously injected with 220 mg/kg D-galactose), and SCB (C) group(intragastrically administered with 20 mg/kg SCB and subcutaneously injected with normal saline). The administration lasted for 7 weeks. Step-through test and Morris water maze test were applied to observe the effect of SCB on the learning and memory capacity of mice. The superoxide dismutase (SOD) activity in the brain tissue of mice was detected by the WST-1 method and the malondialdehyde (MDA) content was measured by the TBA method. The mRNA and protein expression of p19, p53 and p21 genes were detected by quantitative real-time PCR and Western blot, respectively. Results: SCB could signif i cantly improve the learning and memory ability of D-galactose-induced aging mice, increase the SOD activity in the brain tissue, decrease the MDA level, and reduce the expression of p19, p53 and p21 genes. Conclusion: SCB can improve brain aging induced by D-galactose in mice, and the mechanism may be related to the increased antioxidant capacity and the decreased expression of p19, p53 and p21 genes in the brain tissue of mice.
Keywords:schisandrin B; amelioration of age-associated memory impairment; p19 gene; p53 gene; p21 gene
LIU Cong, SUN Weijing, LI Ning, et al. Schisandrin B improves D-galactose-induced learning and memory impairment in aging mice[J]. Food Science, 2018, 39(19): 201-206. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201819031. http://www.spkx.net.cn
刘聪, 孙伟静, 李宁, 等. 五味子乙素对D-半乳糖致衰老小鼠学习记忆能力的改善作用[J]. 食品科学, 2018, 39(19):201-206. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201819031. http://www.spkx.net.cn
引文格式：
文章编号：1002-6630（2018）19-0201-06
文献标志码：A
中图分类号：R285
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201819031
*通信作者简介：李贺（1977—），女，副教授，博士，研究方向为神经药理学。E-mail：yitonglh@126.com
第一作者简介：刘聪（1992—），女，硕士研究生，研究方向为神经药理学。E-mail：372131552@qq.com
吉林市科技局项目（20166018；20163054）
基金项目：吉林省科技厅重点科技攻关计划项目（20140204012YY）；吉林省自然科学基金项目（20150101230JC）；
收稿日期：2017-04-27