鲜切西兰花贮藏期病原菌分离鉴定及植物精油对其抑制效果

黄文部,马菀笛,文 豪,曾 茜,何靖柳,秦 文*

(四川农业大学食品学院,四川 雅安 625014)

摘 要:以‘冬至绿’西兰花为试材,分离、纯化并鉴定鲜切西兰花贮藏期病原菌,筛选出抑制病原菌效果较好的植物精油。通过分离、纯化及致病性实验得到病原真菌菌株AB01,以病原菌内源转录间隔区序列进行进化树分析,鉴定该病原菌为链格孢菌(Alternaria alternata)。选用肉桂、茴香、牛至、丁香、百里香和香茅6 种精油对AB01进行抑菌性实验,通过体外抑菌和活体抑菌筛选出最优的精油种类及含量。结果发现,肉桂精油对AB01的抑菌效果最好,其最低抑菌浓度和最低杀菌浓度分别为0.05 μL/mL和0.15 μL/mL,其次是茴香和牛至精油。0.15 μL/mL肉桂精油用于鲜切西兰花可有效降低花球黄花率和切面褐变率。

关键词:链格孢菌;鲜切西兰花;精油;抑菌效果

西兰花(Brassica oleracea L. var. italica),又称青花椰菜、绿花菜,具有丰富的营养价值[1],是一种常见的优质蔬菜。经过鲜切处理的西兰花细胞破裂、营养物质流失,对微生物抵抗能力下降,导致西兰花切面褐变、花球黄化等品质下降,从而缩短了货架期。刁小琴等[2]分离鉴定出西兰花黑斑病的病原菌为芸苔生链格孢菌(Alternaria brassicicola),与刘毅[3]的鉴定结果相同。接种该菌后,西兰花花球开始黄化,叶绿素迅速降解,乙烯释放量和呼吸速率显著升高,由此可见,病原菌会严重影响西兰花的贮藏品质。

因此,通过一定保鲜技术抑制西兰花病原菌的生长繁殖,能有效保证鲜切西兰花货架期间的贮藏品质。植物精油,也称挥发油,是一类安全无毒、具有一定抗菌性的天然保鲜剂[4]。研究发现,肉桂、丁香、茴香、牛至、香茅精油对链格孢菌有较好的抑制作用,可通过破坏链格孢菌细胞膜的完整性和通透性来影响细胞的外渗率,从而抑制菌丝的生长[5-9]。Ayala-Zavala[10]、Feng Wu[11]等也分别发现百里香精油(Thymus vulgaris)和肉桂精油对抑制链格孢菌活性有较好的效果。

本实验对从染病西兰花表层分离到的微生物进行纯化,将纯化后的微生物接种于健康西兰花,进行致病性实验。对病原菌菌株的内源转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列测序,通过该保守序列的进化树分析确定病原菌种属。选用百里香、肉桂、丁香、茴香、牛至和香茅精油进行抑菌性实验及活体抑菌实验,旨在为鲜切西兰花贮藏期天然杀菌保鲜剂的选择提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

西兰花(品种‘冬至绿’)(Brassica oleracea L.var. italica),采购自雅安市吉选超市。选择花球整齐、色泽绿、花形好、花蕾小、大小基本一致的健康西兰花和自然发病的西兰花,运回四川农业大学食品学院农产品贮藏与加工实验室,置于4 ℃的冰箱中预冷备用。

肉桂精油、丁香精油、茴香精油、牛至精油、香茅精油和百里香精油 吉安市国光香料厂;UNIQ-10柱式真菌基因组抽提试剂盒、UNIQ柱式DNA胶回收试剂盒上海生工生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

FR980凝胶成像仪 上海复日科技仪器有限公司;3730测序列分析仪、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪 美国Applied BioSystems公司;DYY-5型稳压稳流电泳仪 北京六一仪器厂;SW-CJ-1F洁净工作台 苏净集团安泰公司;DNP-9272型生化培养箱 上海精宏实验设备有限公司;YXQ.SG41.280手提式压力蒸汽灭菌器 上海华线医用核子仪器有限公司;SK8259真菌试剂盒 生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 病原菌分离

病原真菌的分离鉴定参考刁小琴[2]、杜小琴[12]等的方法。选取鲜切处理后腐烂变质的切面按照病症分组,采用组织分离法。剪取病健交接处约2 mm的组织,用体积分数75%的酒精表面消毒10 s后,用无菌水清洗3 次后置于PDA培养基,继续纯化至3 次连续纯化过程无其他菌落出现。

1.3.2 致病性实验

将纯化后的浓度为105CFU/mL微生物孢子悬液喷雾接种于鲜切西兰花上。每组处理约10 朵花球,重复3 次,接种后的西兰花用厚度为0.021 mm的聚乙烯保鲜膜单层包装,于25 ℃暗培养(相对湿度为(85±5)%),观察并记录发病情况,显症后再次分离鉴定并与该组接种的微生物对比,形态学鉴定一致则确定为病原菌。

1.3.3 病原菌ITS序列分析

基因组DNA的提取按SK8259真菌试剂盒操作。测定已确定病原菌的ITS序列,通过进化树分析确定病原菌种属,并以此为精油抑菌效果研究奠定基础。测序所用菌丝于25 ℃条件下预先培养5 d,DNA的提取参照Landschoot等[13]的方法,ITS序列PCR扩增引物为:ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)、ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)。

PCR体系包括10 × buffer(内含Mg2+)2.5 µL、dNTP 1 µL、正向引物10 µmol/L 0.5 µL、反向引物10 µmol/L 0.5 µL,加双蒸水至25 µL。PCR程序为:94 ℃预变性4 min;94 ℃变性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,30 个循环;72 ℃终延伸10 min,4 ℃终止反应。所得ITS产物在1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测,用胶回收试剂盒回收纯化,回收纯化产物由生工生物工程有限公司进行测序。在GenBank进行比对并收集相关菌种的ITS序列信息,用MEGA 5.02软件构建进化树,大致确定病原所属种属,为有针对性地选择抑菌剂提供依据。

1.3.4 抑菌率实验

抑菌实验参考杜小琴等[12]的方法,肉桂、丁香、茴香、牛至、百里香和香茅6 种精油在同一含量下(2.00 μL/mL)进行抑菌实验,以体积分数10%吐温-80为溶剂,将配制好的1.50 mL 20.00 μL/mL精油溶液与已灭菌的13.50 mL培养基(约50 ℃)混匀之后倒入平板中,制成含有2.00 μL/mL精油的平板,以等体积的吐温-80为对照,用无菌打孔器在病原菌(培养7 d)平板上打取直径为6 mm的菌块放入平板中央,25 ℃条件下培养3 d后用游标卡尺测量菌落直径,按照下式计算抑制率,选择抑制率较高的植物精油进行下面的实验。

1.3.5 体外抑菌实验

以体积分数10%吐温-80为溶剂,最后培养基中精油的最终含量为0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 μL/mL。每个平板加入0.5 mL孢子悬浮液(105CFU/mL),均匀涂布后于25 ℃条件下培养2 d,以抑制率100%的最低精油含量为其最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC),继续培养2 d,若仍不长菌,则为最低杀菌浓度(minimal fungicidal concentration,MFC)[14]。以添加体积分数10%吐温-80组为对照,实验重复3 次。

1.3.6 植物精油对鲜切西兰花花球黄化率和切面褐变率的影响

参照致病性实验对健康西兰花进行接种,接种后的西兰花立即喷施精油溶液,于15 ℃下阴干至表面无液体,所选精油含量设置为2 MFC、3/2 MFC、MFC、1/2 MFC(表1),喷施量约为0.4 g/50 g,以体积分数10%吐温-80喷施处理组作为对照,立即将塑料盒用保鲜膜封闭起来,置于25 ℃培养箱中暗培养,每天统计花球黄化率和切面褐变率,统计3 d,实验重复3 次。

表 1 体内抑菌实验分组
Table 1 Grouping for in vivo antimicrobial tests

2 结果与分析

2.1 病原菌分离及鉴定

根据科赫法则,从鲜切处理后腐烂变质的西兰花切面(图1A1)分离、纯化出2 种霉菌,回接致病(图1A2)和再分离纯化后,确定西兰花的病原菌为其中的一种霉菌(霉菌2号),标记为AB01。分离纯化后在25 ℃培养8 d的菌落形态见图1B1、B2,回接致病再分离纯化于25 ℃培养8 d的菌落形态见1C1、C2,孢子见图1B3、C3

图 1 西兰花贮藏期病原菌分离、菌落形态和发病症状
Fig. 1 Pathogen isolation, colonial morphology, and pathogenic symptom

AB01菌落近圆形,单菌落能扩展至直径7 cm,边缘不规则,菌落正面培养4 d内呈灰白色,4 d开始颜色加深,10 d之后为黑褐色,菌落反面培养初为淡黄色而后转为黑褐色,菌丝为树枝状无隔长菌丝,分生孢子呈手雷状。被感染西兰花在25 ℃放置1 d,切面出现褐斑,2 d后出现菌丝,以花球尤为明显,2 d后切面已基本褐变,与自然病变西兰花症状相似。

ITS全序列分析结果表明,该病原菌与链格孢菌属微生物保守序列相似度最高。该病原菌的ITS全序列NCBI登录号为MF040794。

图 2 Alternaria alternata AB01和相关菌株的系统进化树
Fig. 2 Phylogenetic tree of Alternaria alternata AB01 and their relative strains

进化树(图2)显示,病原菌AB01与链格孢菌(Alternaria alternata)亲缘关系较近,与乔木链格孢(Alternaria arborescens)、百日菊链格孢(Alternaria zinnia)也比较近,与皮思霉(Pithomyces chartarum)、齿毛菌(Chaetomium globosum)亲缘关系较远。因此可以推断,鲜切西兰花病原菌AB01为链格孢菌。

2.2 植物精油对病原菌的体外抑菌效果

如图3所示,培养3 d后,所有精油处理组均未见菌丝生长和蔓延,对照组菌丝蔓延,培养3 d时菌落直径达到(27.58±2.24)mm。由此表明,6 种精油(2 μL/mL)对AB01都具有良好的抑菌效果。

图 3 植物精油对鲜切西兰花病原菌AB01的体外抑制效果
Fig. 3 In vitro inhibitory effect of plant essential oil on AB01

表 2 植物精油对鲜切西兰花病原菌AB01的体外抑菌效果
Table 2 In vitro inhibitory effect of plant essential oil on AB01

注:+.长菌;-.未长菌。

选定6 种精油研究其对AB01的MIC和MFC。实验结果(表2)表明,对于MIC,肉桂精油(<0.3 μL/mL)<茴香精油(0.6 μL/mL)、牛至精油(0.6 μL/mL)<丁香精油(0.9 μL/mL)、百里香精油(0.9 μL/mL)<香茅精油(1.2 μL/mL);对于MFC,肉桂精油(<0.3 μL/mL)<牛至精油(0.6 μL/mL)、茴香精油(0.6 μL/mL)<丁香精油(1.2 μL/mL)<百里香精油(>1.8 μL/mL)、香茅精油(>1.8 μL/mL)。综合得出,肉桂精油对AB01的体外抑制效果最好,但更加准确的抑菌含量需要进一步实验。茴香和牛至精油对AB01的体外抑制效果较好,仅次于肉桂精油,香茅和百里香精油效果较差。

肉桂精油组最低含量(0.3 μL/mL)培养4 d仍未长菌,第二轮实验将肉桂精油的含量设置为0.30、0.25、0.20、0.15、0.10、0.05 μL/mL,共6 个含量梯度,操作同1.3.5节,进一步实验结果(表3)表明,肉桂精油对病原菌AB01的MIC和MFC分别为0.05 μL/mL和0.15 μL/mL。

表 3 肉桂精油对鲜切西兰花病原菌AB01的体外抑菌效果
Table 3 In vitro inhibitory effect of cinnamon oil on AB01

2.3 植物精油对病原菌的体内抑菌效果

根据体外抑菌实验,选取肉桂、茴香和牛至精油,探究三者对接种AB01鲜切西兰花的花球黄花率和切面褐变率的影响。结果如图4A、B所示,雷达图中数据点越接近中心,表示黄化率(褐变率)越低。对比CK1和CK2发现,接种AB01显著增大了花球黄化率,且CK1组贮藏3 d后,仍然有50%花球黄化,说明影响花球黄化的因素除了AB01,可能还有别的因素(如温度等);对比CK2和CK3发现,吐温-80作为溶剂,对花球黄化率和AB01的致病过程没有显著作用。对比肉桂精油组(A1~A4)发现,低含量的肉桂精油(A4)对AB01的抑制效果较差,随着肉桂精油含量的增加,对AB01的抑制效果增强(表3),但花球黄花率也有增加,说明过高含量(0.30 μL/mL)的肉桂精油会加速西兰花花球的黄化,这与预实验中发现的植物精油在一定含量时会造成鲜切西兰花部分黄化相吻合,肉桂精油以0.15 μL/mL(MFC)效果最佳;茴香精油组(B1~B4)中,B3和B4处理没有明显效果,B2(3/2MFC)处理效果最佳,抑菌含量比体外抑制实验要高一些;牛至精油组(C1~C4)中,含量为0.9 μL/mL和0.6 μL/mL时效果最好,二者差异不显著(P>0.05)。

图 4 精油处理对鲜切西兰花花球黄化率(A)和切面褐变率(B)的影响
Fig. 4 Effect of essential oil treatment on etiolation (A) and browning (B) in fresh-cut broccoli

切面褐变是鲜切西兰花被AB01侵染的主要表现,因此可用切面褐变率代表发病率,从而反映植物精油的体内抑菌效果。西兰花接种AB01后于25 ℃培养2 d,切面基本褐变(CK2),而无菌对照组(CK1)切面保持新鲜颜色。对比花球黄化,AB01对于鲜切西兰花切面褐变的影响更加明显。对比CK2和CK3发现,吐温-80对切面褐变没有显著作用。对于肉桂精油组(A1~A4),规律与花球黄化率实验结果相似,最优含量为0.15 μL/mL,培养3 d时,切面褐变率仅为50.00%。对于茴香精油组(B1~B4),培养2 d时,B1和B2处理效果较好,但培养3 d时,4 组西兰花切面均全部褐变;对于牛至精油组(C1~C4),培养2 d时,4 组精油抑制褐变效果均较好,培养3 d时,4 组西兰花切面亦全部褐变。因此,从抑制西兰花切面褐变角度而言,肉桂精油更适合用于鲜切西兰花的保鲜。综合花球黄化率和切面褐变率可得,肉桂精油比牛至精油、茴香精油更适合在鲜切西兰花保鲜上使用。

3 讨 论

本实验研究了不同精油对于链格孢菌A B 0 1的抑制效果。6 种植物精油对AB01的MFC以肉桂精油最低(0.15 μL/mL),其次是茴香和牛至精油(0.6 μL/mL),丁香和百里香精油较高,香茅精油最高,为1.2 μL/mL。

对于丁香和百里香精油的实验结果,杨婷等[15]研究发现百里香酚和丁香酚对链格孢菌的抑制效果有限;解淑慧等[16]发现丁香精油可以抑制柑橘采后柑橘链格孢(Alternaria citri)和指状青霉(Penicillium digitatum)的生长。研究发现,在串珠镰刀菌(Fusarium verticillioides)[14],细极链格孢(Alternaria tenuissima)、灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)、粉红单端孢霉(Trichothecium roseum)4 种菌中,百里香对细极链格孢的抑制效果最差(半抑制浓度43.6 μL/L)[17],与本实验研究结果相似,说明百里香精油和丁香精油虽然具有抑菌效果,但对链格孢菌的抑制效果有限。纪淑娟等[18]研究发现0.5 μL/mL的香茅精油可以有效抑制链格孢菌菌丝生长,与本研究结果(1.2 μL/mL)不同,可能与精油纯度和菌种来源有关。

对于肉桂和牛至精油的实验结果,李亚茹等[19]研究发现肉桂和茴香精油对链格孢菌的MIC分别为0.08、1.20 μg/mL;两种精油都显著优于卡那霉素对链格孢菌的抑制效果(MIC 800 μg/mL)。蒋妮等[20]研究发现0.50 mg/mL的肉桂精油对链格孢菌菌丝的抑制率为100%,对孢子萌发率的抑制率高于90%。Kiran等[21]发现肉桂精油的MIC是0.40 μL/mL,高于本实验结果(0.15 μL/mL),本实验发现0.30 μL/mL的肉桂精油可以完全抑制AB01的生长,因此进一步实验得到肉桂精油对AB01的MIC的差异可能与精油纯度、菌种来源有关。Zabka等[14]研究发现牛至和百里香精油对链格孢菌的MIC分别为0.092 μL/mL和0.146 μL/mL,可见牛至精油的抑菌效果优于百里香精油。Castro等[22]研究植物精油对于火龙果源链格孢菌的抑菌效果,肉桂(MIC 250 μg/mL)优于丁香精油(MIC 500 μg/mL)和香茅精油(MIC 1 000 μg/mL),与本研究结果相同。因此,肉桂精油和牛至精油不仅对链格孢菌具有良好的抑制效果,对灰葡萄孢菌[23-24]、镰刀菌[25]、青霉菌[26]和曲霉属真菌[27]等的抑制效果也均良好,说明肉桂精油和牛至精油具有广谱抑菌作用。

同时,肉桂精油比牛至精油表现出更强的抑菌效果,与其挥发效果有关,Frankova等[28]研究发现肉桂精油对苹果源链格孢菌的抑菌效果最强(MIC 32 μL/mL),香茅精油最差(MIC 256 μL/mL),与本研究结果一致。但是热风协同植物精油进行实验时发现牛至精油表现出更强的抑菌效果(MIC 2 μL/mL)。说明常温下肉桂精油比牛至精油更易挥发,表现出更强的抑菌效果。同时经肉桂精油处理的西兰花花球黄化率和切面褐变率也是最低的,证实了AB01能够加速鲜切西兰花的腐败变质,肉桂精油可以通过抑制AB01的生长繁殖进而延缓西兰花的品质下降。

因此,本实验从鲜切西兰花自然感病部位分离出的AB01真菌菌株表现出致病性,通过ITS序列分析和进化树绘制比对发现病原菌为链格孢菌,NCBI登录号为MF040794,与刁小琴[2]、刘毅[3]等分离鉴定出的病原菌同属不同种,说明不同地区的西兰花其病原菌不同,具有一定研究价值。在已知对链格孢菌属有较强抑制作用的6 种精油中,AB01对肉桂精油最敏感,MIC和MFC分别为0.05 μL/mL和0.15 μL/mL,其次是牛至精油和茴香精油。活体抑菌实验中0.15 μL/mL的肉桂精油喷施处理能降低接种AB01菌株西兰花的花球黄花率和切面褐变率;因此,认为肉桂精油是一种适用于鲜切西兰花的天然保鲜剂。天然保鲜剂越来越被广泛应用于鲜切果蔬保鲜,将肉桂精油应用于鲜切西兰花上,不仅生产操作方便,而且保鲜剂天然安全,具有一定应用价值。

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Isolation and Identif i cation of Pathogens from Fresh-Cut Broccoli during Storage and Their Inhibition by Plant Essential Oils

HUANG Wenbu, MA Wandi, WEN Hao, ZENG Qian, HE Jingliu, QIN Wen*
(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

Abstract:This study was intended to isolate, purify, and identify the pathogens that can cause etiolation and browning in fresh-cut broccoli during storage and to screen plant essential oils for their effectiveness in controlling these pathogenic isolates. A pathogenic fungal strain (AB01) was obtained. According to the phylogenetic tree constructed based on the internal transcribed spacer (ITS) region in it, AB01 was identified as Alternaria alternata. The inhibitory effects of six plant essential oils including cinnamon, fennel, bovine, clove, thyme and citronella oils against AB01 were tested both in vitro and in vivo in order to select the optimum oil species and concentration. The results showed that cinnamon essential oil possessed the best antimicrobial effect with a minimum inhibitory concentration (MIC) of 0.05 μL/mL and minimum fungicidal concentration (MFC) of 0.15 μL/mL, followed by fennel and oregano oils. Cinnamon essential oil at 0.15 μL/mL could effectively reduce both etiolation and browning in fresh-cut broccoli.

Keywords:Alternaria alternata; fresh-cut broccoli; essential oils; antimicrobial effect

HUANG Wenbu, MA Wandi, WEN Hao, et al. Isolation and identification of pathogens from fresh-cut broccoli during storage and their inhibition by plant essential oils[J]. Food Science, 2018, 39(19): 241-246. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201819037. http://www.spkx.net.cn

黄文部, 马菀笛, 文豪, 等. 鲜切西兰花贮藏期病原菌分离鉴定及植物精油对其抑制效果[J]. 食品科学, 2018, 39(19):241-246. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201819037. http://www.spkx.net.cn

引文格式:

文章编号:1002-6630(2018)19-0241-06

文献标志码:A

中图分类号:TS255.36

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201819037

*通信作者简介:秦文(1967—),女,教授,博士,研究方向为果蔬加工及贮藏。E-mail:420942276@qq.com

第一作者简介:黄文部(1992—),男,硕士研究生,研究方向为果蔬加工及贮藏。E-mail:806207736@qq.com

收稿日期:2017-07-18