白丝北里孢菌L-谷氨酸氧化酶的异源表达及酶学性质分析

陈 稳,李由然,顾正华,丁重阳,张 梁,石贵阳*

(江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,生物工程学院,江苏 无锡 214122)

摘 要:为实现从L-谷氨酸到α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid,α-KG)的高效生物转化,将来源于白丝北里孢菌(Kitasatospora setae KM-6054)的L-谷氨酸氧化酶(L-glutamate oxidase,LGOX)在大肠杆菌(Escherichia coli)中实现异源表达,并研究其酶学特性。根据LGOX的氨基酸序列和大肠杆菌系统偏好性合成LGOX全基因序列,并通过pET28a(+)/DE3系统在大肠杆菌中实现了功能表达。诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)终浓度为0.1 mmol/L,20 ℃诱导18 h,重组大肠杆菌粗酶液酶活力可达49.10 U/mL。亲和层析获得酶比活力为45.98 U/mg纯酶,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳条带显示蛋白分子质量大小约为70 kDa。酶学性质研究表明:其最适反应温度和pH值分别为40 ℃和6.0;Km值为1.23 mmol/L,Vmax值为76.24 μmol/(min·mg),L-谷氨酸为该酶的最适底物。本研究确定了LGOX在E. coli BL21中的异源表达及酶学特性,为生物转化合成α-KG提供了新的参考途径。

关键词:白丝北里孢菌;L-谷氨酸氧化酶;α-酮戊二酸;异源表达;酶学性质

α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid,α-KG)作为三羧酸循环和氨基酸代谢中重要的二元氨基酸,在氨基酸形成和氮代谢中起关键作用。它也广泛用于各种医药和食品领域,如用作化学合成药物的前体物质[1]、膳食补充剂[2]、注射室化合物和创伤恢复性化合物等[3]。α-KG和三醇(丙三醇、1,2,4-丁三醇、1,2,6-已三醇)中的任意一个发生热缩聚反应形成聚三醇-α-酮戊二酸化合物可能在生物医学中有潜在的应用[4]。微生物体内主要在三羧酸循环途径中形成α-KG,外源碳源物质进入细胞后,经糖酵解形成丙酮酸,再由丙酮酸转化成α-KG,α-KG又在酮戊二酸脱氢酶系作用下代谢成琥珀酸辅酶A,进入下一碳代谢节点;此外,α-KG可经转氨基作用形成L-谷氨酸进入氮代谢,在某些微生物中L-谷氨酸也可被氧化形成α-KG,但绝大多数微生物群体内或体外都不积累α-KG。目前,工业上生产α-KG主要有化学合成法、微生物发酵法和生物转化法。其中化学合成法生产过程中有毒化合物和有毒溶剂会对环境产生巨大危害,不符合绿色生物制造的发展趋势[5];微生物发酵法(细菌和酵母)由于合成路线长,伴随多个电子传递和能量传递过程,受调控复杂,收率低,很难达到工业化的生产要求[6-8];而生物转化法通过酶转化和细胞转化合成目的产物[9-10],相较于前两种方式生产条件更为简单、温和,且生产过程中基本无副产物的积累,便于后续分离提取,是最具应用前景的生产方式。

L-谷氨酸氧化酶(L-glutamate oxidase,LGOX)可催化L-谷氨酸生成α-KG,它是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸(f l avin adenine dinucleotide,FAD)为辅酶的黄素酶,但因其本身含有一个非共价结合的FAD,因此又能在不加外源性辅助因子FAD条件下完成催化反应[11-12]。LGOX对催化反应底物有着很强的底物专一性,且催化效率高,反应条件温和,因此利用LGOX生物转化生产α-KG引起了广大研究者的兴趣[13]。同时,LGOX也可被用于临床实验检测γ-谷氨酰基转移酶、谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性[14],及用于测定肌酐、血氨等含量[15]。生物传感器中也经常使用LGOX测定L-谷氨酸含量[16]

1983年,Kamei等[17]从Streptomyces violascens中发现LGOX,并确定了其催化反应后所生成产物,将其归纳为黄素酶类。目前,现有LGOX的报道都来自链霉菌属:Kusakabe等[18]率先从Streptomyces sp. X-119-6中发现较强底物专一性的LGOX,但粗酶液酶活力仅为0.056 U/mg;为进一步提高LGOX的表达量,Arima等[11]将Streptomyces sp. X-119-6来源的LGOX基因在大肠杆菌(Escherichia coli)JM109中实现重组表达并分析其蛋白结构,获得2.42 U/mg的粗酶液,酶比活力比原始菌中提高了43.2 倍,但热稳定性迅速降低,该重组酶在pH 7.4、30 ℃温浴0.5 h仅剩50%酶活力;2013年,卢婵等[19]又将该来源的基因连接至pET28a表达载体上,实现了在E. coli BL21中的重组表达,并发现该重组酶在50 ℃保温10 min,酶活力迅速降为原来的15%,说明该酶的稳定性较差。为寻找一株热稳定性良好、可实现工业应用的菌株,Niu等[10]将来自Streptomyces ghanaensis ATCC14672的LGOX基因在E. coli BL21中表达,经HisTrapTMFF亲和层析柱纯化后其酶比活力达到9.54 U/mg,热稳定性研究显示该重组酶在50 ℃温浴1 h后,其酶活力亦迅速降为原来的30%。综上LGOX酶学特性分析发现,来源于链霉菌的LGOX普遍存在酶学性质不稳定或表达量低等问题,难以满足利用该酶工业化生产α-KG的条件。

白丝北里孢菌(Kitasatospora setae)是一类放线菌,是1982年由Omura等[20]发现的一个新属,其生理特征、遗传特性及蛋白结构与链霉菌有诸多不同,其主要特征是菌体细胞壁同时含有L,L-二氨基庚二酸和meso-二氨基庚二酸两个组分,并含有甘氨酸和半乳糖,可产生多种抗生素[21],而对该菌株产酶及其基因来源酶类的异源表达鲜有报道。本研究将来源于K. setae的LGOX,根据E. coli系统合成该基因,经重组转化到E. coli BL21中过量表达LGOX,经亲和层析纯化后,研究重组酶的酶学性质发现该酶具有突出的热稳定性,具备应用于α-KG生物转化的潜力。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

E. coli JM109为本实验中质粒构建和保藏菌株,E. coli BL21(DE3)为过表达目的基因的宿主菌,质粒pET-28a(+)为含有T7强启动子的异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导型表达质粒,上述菌株与质粒均由本实验室保藏。

DNA片段纯化、胶回收和质粒提取试剂盒 北京博大泰克生物基因技术有限责任公司;TA克隆载体、T4 DNA连接酶、Pyrobest DNA聚合酶、限制性内切酶等工具酶 宝生物工程(大连)有限公司;标准分子质量蛋白 美国Thermo Scientific公司;蛋白胨、酵母粉 英国Oxiod公司;十二烷基硫酸钠、卡那霉素(kanamycin,Kan)、琼脂糖、IPTG、牛血清蛋白美国Sigma公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

PCR仪、Chemi Doc XRS+凝胶成像仪 美国Bio-Rad公司;AB204-N分析天平 梅特勒-托利多有限公司;CF16RXⅡ型冷冻离心机、CT15RE型台式微量高速离心机 日本Hitachi公司;AF100雪花制冰机 意大利Scotsman公司;pHS-3TC型pH计 德国赛多利斯股份公司;MLS-3750型全自动高压灭菌锅 日本Sanyo公司;UV-2100型紫外-可见分光光度计 美国Unico公司;VC750型超声波细胞破碎仪 美国Sonics公司;DYY-6B凝胶水平电泳仪 北京市六一仪器厂;AKTA蛋白纯化系统 美国GE Healthcare公司;HYL-C多功能组合式摇床 太仓市强乐实验设备厂;SF-CJ-2超净工作台 上海三发科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 LGOX密码子优化合成

参照NCBI中来源于K. setae菌属的LGOX的氨基酸序列(Accession编号:BAJ32332),根据E. coli系统密码子偏好性及使用频率,在不改变氨基酸序列的前提下减少序列中可能存在的稳定的二级结构区域,防止终止子使转录提前终止,同时在序列的5’端和3’端分别加上NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位点,利用利用密码子优化软件GeneOptimizer对LGOX基因进行优化,交由苏州金唯智生物科技有限公司合成LGOX基因,连接至pUC57-T载体上,命名为pUC57T-LGOX。

1.3.2 LGOX表达载体的构建

用NdeⅠ和EcoRⅠ分别双酶切pUC57T-LGOX质粒、pET-28a(+)质粒。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,并回收1 830 bp的目的片段,与双酶切后的pET-28a(+)质粒载体经T4连接酶过夜连接,连接产物转化至E. coli BL21感受态细胞,涂布Kan平板37 ℃过夜培养后,挑取单克隆转化子经PCR和酶切验证获得重组表达载体pET28a-LGOX,同时将含有上述重组载体的重组菌命名为E. coli BL21/pET28a-LGOX。

1.3.3 重组LGOX在E. coli中的诱导表达

将含有重组表达载体pET28a-LGOX的重组菌接入LB培养基中过夜活化后,转接3%的接种量至TB培养基中37 ℃培养,至OD600nm约为1.2时,分别加入不同浓度的IPTG,于不同温度诱导培养不同时间,探讨了诱导剂IPTG终浓度(0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.2、1.5、2 mmol/L)、诱导时间(3、6、9、12、15、18、21 h)和诱导温度(20、25、30、37 ℃)对重组LGOX表达影响。

1.3.4 重组蛋白的纯化

12 000 r/min离心2 min收集经发酵诱导培养后的细胞,用20 mmol/L pH 7.4的磷酸缓冲液洗涤菌体2 次,最后用磷酸盐缓冲液重悬菌体,超声破碎6 min(工作1 s,间歇2 s),冷冻离心收集上清液。采用HisTrapTMFF亲和层析柱纯化重组蛋白,用A液(20 mmol/L磷酸盐缓冲液,500 mmol/L NaCl,100 mmol/L咪唑,pH 7.4)洗去非特异性结合的杂蛋白,用B液(20 mmol/L磷酸盐缓冲液,500 mmol/L NaCl,500 mmol/L咪唑,pH 7.4)洗下目的蛋白,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测蛋白纯度。

1.3.5 LGOX活力测定[22]

反应体系中包括12 mmol/L L-谷氨酸、0.2 mmol/L 4-氨基安替比林、1 mmol/L N,N-二甲基苯胺、2 U/mL辣根过氧化物酶,总反应体系为3 mL(pH 7.0)。加入100 μL稀释后的酶液,于37 ℃反应10 min后,立即测定其在550 nm波长处的吸光度。1 个酶活力单位的定义为:37 ℃条件下反应1 min生成1 μmol过氧化氢所需的酶量。

式中:A550nm为550 nm波长处的吸光度;14.3为每毫摩尔醌亚胺混合物的消光值;3.1为总反应液体积/mL;0.1为酶液体积/mL;10为反应时间/min;C为稀释倍数。

1.3.6 LGOX纯酶酶学性质分析

1.3.6.1 最适反应温度和温度稳定性

将等量的纯酶于4、20、25、30、37、40、45、50、55、60、70、80 ℃条件下测定酶活力,以反应所测的最高酶活力为100%,计算其他不同温度下的相对酶活力,探讨温度对LGOX活力影响。

将等量酶液分别于4、10、20、30、40、50、60、70、80 ℃条件下恒温放置1 h后,测定酶活力,以反应所测的最高酶活力为100%,考察LGOX在不同温度的热稳定性。

1.3.6.2 最适反应pH值及pH值稳定性

将等量的酶置于0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5),0.1 mol/L磷酸钠盐缓冲液(pH 6.0、6.5、7.0、7.5),0.1 mol/L硼酸盐缓冲液(pH 8.0、8.5、9.0)中,于37 ℃反应测定酶活力,以所测的最高酶活力为100%,计算其他pH值条件下的相对酶活力,考察该酶在不同pH值条件下的酶活力影响。

将等量的纯酶分别于pH 3.0~9.0、4 ℃放置12 h后,测定酶活力,以所测最高酶活力为100%,考察不同pH值条件下LGOX的pH值稳定性。

1.3.6.3 底物特异性

用不同氨基酸溶液替代L-谷氨酸,测定LGOX活力,以L-谷氨酸为底物测定的活性定义为100%,获得其他不同底物的相对活性。

1.3.6.4 外源金属离子对LGOX活力影响

向反应体系中加入2 mmol/L的不同金属离子(Ni、K、Ba2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Ca2+、Mn2+、Co),测定LGOX活力,以不加金属离子测定的酶活力为100%,获得相应的添加金属离子后的相对酶活力。

1.3.6.5 动力学参数测定

在最适反应温度与pH值条件下,测定不同L-谷氨酸底物浓度(0.5~15 mmol/L)条件下的反应速率,计算其Km与Vmax值。

1.3.7 酶液中蛋白含量的测定

蛋白含量测定采用Bradford法[23]

2 结果与分析

2.1 K. setae来源的LGOX氨基酸序列分析及密码子优化

将K. setae来源的LGOX的610个氨基酸序列,提交至NCBI数据库中(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行序列比对,MEGA 5软件绘制进化树(图1)发现该酶的氨基酸序列与来源于链霉菌同类酶的同源性较低,约为40%,进化树表明两者具有同一根,不同节点,都属放线菌科,两类LGOX进化枝长相差较大,可能是因为随着时间的进化,保守区域变化不大,非保守区的部分氨基酸序列发生了不定向进化,引起蛋白结构区域部分变化,而影响酶的部分催化特性[24]

图1 链霉菌与北里孢菌来源的LGOX氨基酸序列进化树
Fig. 1 Phylogenetic tree based on amino acid sequence of LGOX from streptomycete and Kitasatospora

在网站http://www.kazusa.or.jp/codon/上查询大肠杆菌主要具有UAG、UGA、CUA、CGA、CGG、AUA、AGA、AGG等稀有密码子,优化后密码子几乎全是大肠杆菌所偏好的,LGOX基因序列比对(图2)发现合成基因序列中GC含量从原始菌的45.3%提高到53.6%,两者具有77.76%的同源性,其中替换了407 个碱基和371 个密码子,密码子替换比例达60.8%。合成的序列连接至pUC57-T载体上,获得含目的基因的重组质粒pUC57T-LGOX。

将克隆载体pUC57T-LGOX经NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切后,割胶回收1 830 bp的LGOX基因片段与经相同酶切的pET28a(+)表达载体连接并转化至E. coli BL21(DE3),转化子质粒经NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切,获得5 331 bp及1 830 bp两条DNA条带,与DNA序列分析结果一致,获得重组载体pET28a-LGOX,及重组菌E. coli BL21(DE3)/pET28a-LGOX,验证结果如图3所示。

图2 LGOX基因序列比对图
Fig. 2 Sequence alignment between original and synthetic LGOX gene

2.2 重组表达载体的构建

图3 重组质粒pET28a-LGOX双酶切
Fig. 3 Identif i cation of recombinant plasmid pET28a-LGOX by double enzyme digestion and PCR

2.3 重组LGOX的表达

重组菌诱导发酵,超声破碎,经SDS-PAGE蛋白条带检测(图4),在2、4泳道中70 kDa附近有一明显目的条带,而对照组1、3泳道中则无明显蛋白条带,说明重组菌在大肠杆菌实现部分可溶性表达;本研究中胞外蛋白浓度较低,SDS-PAGE检测5、6泳道未显示明显条带。

图4 重组LGOX在E. coli BL21(DE3)中过表达后的SDS-PAGE验证
Fig. 4 SDS-PAGE analysis of overexpression of recombinant LGOX in E. coli BL21 (DE3)

2.4 诱导表达条件的优化

图5 IPTG浓度(A)、诱导时间(B)和诱导温度(C)对重组LGOX的影响
Fig. 5 Effect of IPTG concentration (A), induction time (B) and temperature (C) on recombinant LGOX activity

按照前述方法中所述发酵重组菌E. coli BL21(DE3)/pET28a-LGOX,加入不同终浓度的IPTG,20 ℃诱导培养15 h后测定酶活力,结果如图5A所示。在IPTG终浓度为0.1 mmol/L时诱导效果最佳。此外,在不添加IPTG诱导时,也能表达出一定的酶活力,这一本底表达的存在表明实验条件下,阻遏蛋白不能完全抑制T7聚合酶的表达。故确定0.1 mmol/L IPTG为最佳诱导剂浓度,以此条件为基础,改变诱导时间,结果如图5B所示,随着诱导时间的延长,单位酶活力也相应增加,当诱导18 h时,酶活力基本达到稳定,故综合考虑,诱导时间为18 h时最佳。接着,以此条件为基础,改变诱导温度为20、25、30、37 ℃,结果如图5C所示,随着温度升高,酶活力逐渐降低。据相关报道重组E. coli能高表达重组蛋白的诱导温度为15~42 ℃,降低温度有利于重组酶的表达同时减少包涵体的产生[25-26],本实验结果也间接证实了这一结论,当诱导温度为20 ℃时,酶活力最佳。故最终确定诱导条件为0.1 mmol/L IPTG、诱导时间18 h、诱导温度20 ℃,获得酶活力为(49.10±2.26)U/mL粗酶液,比活力为19.56 U/mg。

2.5 重组LGOX的纯化

图6 重组LGOX分 离纯化过程SDS-PAGE分析
Fig. 6 SDS-PAGE analysis in the puri fi cation process of recombinant LGOX

由于本实验所采用的pET28a(+)为含有T7强启动子的IPTG诱导型表达载体,且本身自带有组氨酸标签,可采用HisTrapTMFF亲和层析柱纯化重组蛋白,达到快速、便捷、高效的目的[27]。如图6所示,粗酶液经HisTrapTMFF亲和层析柱纯化后得到单一的目的蛋白条带,纯化后的酶比活力达到45.98 U/mg,是纯化前的2.35 倍。

2.6 LGOX纯酶酶学性质分析

2.6.1 温度及pH值对重组LGOX影响

图7 温度(A)和pH值(B)对重组LGOX活力影响
Fig. 7 Effect of temperature (A) and pH (B) on the activity of recombinant LGOX

从图7A可以看出,该酶的最适温度为40 ℃,最适温度范围在30~50 ℃之间,其能维持90%以上酶活力,当温度达60 ℃时,具有60%的活力,说明该酶的作用温度较为广泛,能满足工业化酶转化生产α-KG要求。80 ℃反应时,该酶活力几乎完全丧失。此外,将该酶分别在4、10、20、30、40、50、60、70、80 ℃保温1 h后测定酶活力,发现该酶在70 ℃及以下温度保温1 h后,还能维持其50%以上的酶活力,80 ℃保温1 h后,酶活力基本丧失。

由图7B可知,pH值为6.0时,酶活力最高,为该酶的最适反应pH值,最适pH值范围为5~6,当pH值高于6.0时,酶活力降低较为显著,pH值为9.0时,酶活力基本完全丧失。同时,将该酶分别在pH值为3、4、5、6、7、8、9条件下,4 ℃放置12 h后,测定酶活力,发现该酶在pH值为5~6.5时,该酶活力基本稳定,能维持将近80%以上的酶活力,当pH值高于7.0时,酶活力迅速较为50%以下,而pH值为9.0时,酶活力基本丧失。

2.6.2 底物特异性

表1 重组LGOX底物特异性分析
Table 1 Substrate specif i city of recombinant LGOX

由表1可知,LGOX的最适底物为L-谷氨酸,还对L-谷氨酰胺和L-组氨酸有微弱作用外,对其他氨基酸无作用,这与Kamei等[17]的研究结果类似。较强的底物专一性,显示了该酶一定的应用前景。

2.6.3 金属离子对LGOX活力影响

由图8可知,在酶活力测定反应体系中加入2 mmol/L的不同外源金属离子时,K、Ba2+、Mn2+均对该酶起了一定的促进作用,其中尤以Mn2+促进效果最为明显,与不加外源离子的对照组相比,酶活力提高了10%以上,同时,Ni、Cu2+、Zn2+、Ca2+、Co、Mg2+对LGOX有不同程度的抑制效果,其中,又以Zn2+最为突出,几乎能完全抑制其酶活力。

图8 金属离子对重组LGOX活力影响
Fig. 8 Effect of different metal ions on the activity of recombinant LGOX

2.6.4 动力学参数的测定结果

按照酶活力标准测定方法,在最适温度40 ℃和最适pH 6.0条件下,测定不同底物浓度(0.5、1、3、6、9、12、15 mmol/L)的酶活力,计算出反应速率,得到该重组LGOX的Km值为1.23 mmol/L,最大反应速率Vmax为76.24 μmol/(min·mg)。

3 讨 论

表2 不同来源LGOX的特征
Table 2 Characters of the LGOX from different sources

注:1. E. coli BL21(加纳链霉菌)表示将来源于加纳链霉菌的LGOX在大肠杆菌BL21中表达;2. E. coli BL21(白丝北里孢菌)表示将来源白丝北里孢菌的LGOX在大肠杆菌BL21中表达。

α-KG在食品、医药等领域存在巨大的应用价值,一方面,α-KG与精氨酸等氨基酸复配,能帮助运动员快速补充能量,另一方面,α-KG能减轻肾病患者肾脏负担[1],此外,α-KG还在鱼类营养及肠道代谢中存在巨大应用价值[28],而目前工业上生产α-KG存在各种弊端,因此,利用LGOX高效生物转化生产食品添加剂α-KG是一极具应用情景选择。表2显示,目前大部分的LGOX研究均来源于链霉菌属,Arima等[29]将Streptomyces sp. X-119-6来源的LGOX基因在E. coli JM109中实现重组表达,该重组酶在pH 7.4、30 ℃温浴0.5 h仅剩50%酶活力;Niu等[10]将来自Streptomyces ghanaensis ATCC14672的LGOX基因在E. coli BL21中表达,重组酶45 ℃温浴1 h酶活力不到50%,酶活力下降明显,稳定性较差。直接由野生菌分泌的LGOX表达量低,且分离纯化较为困难,不适宜大规模制备。为寻找出一种稳定性能良好、作用条件温和的LGOX,同时获得一株能高效表达该酶的重组菌株,发现来源于北里孢属的LGOX表达量高,热稳定性能良好,70 ℃放置1 h还有50%的酶活力,最适反应温度及pH值较为温和,适用于工业化转化L-谷氨酸生产α-KG。

根据来源于北里孢的LGOX的氨基酸序列,合成了上述来源的LGOX基因,并将其克隆至pET28a表达载体,转化至E. coli BL21中,获得高效表达。并通过对诱导条件的探索,发现在诱导产酶时,影响外源基因的表达除了载体和宿主外,诱导剂浓度、诱导时间和诱导温度等都会在不同程度上影响重组菌的表达。研究结果发现低浓度诱导剂IPTG(浓度0.1 mmol/L)即可诱导重组菌的表达,浓度过高,由于其本身的毒性作用,会抑制菌体生长而影响活性蛋白的表达;在不添加IPTG诱导时,也能表达出一定的酶活,说明这一本底表达的存在表明实验条件下,阻遏蛋白不能完全抑制T7聚合酶的表达。在一定的诱导时间内,随着诱导时间的延长,其酶活力也逐渐上升,当诱导时间为18 h时,达到最佳诱导效果;温度对诱导蛋白的表达影响效果显著,当温度在1~42 ℃时,温度升高,菌体生长过快,导致蛋白合成过快,没有足够时间进行正确折叠,而形成不溶解的包涵体,导致酶活力急剧下降[25]

酶学性质研究发现该重组酶底物特异性强,除对L-谷氨酸有强烈作用外,仅对L-组氨酸和L-谷氨酰胺有微弱作用;热稳定性能良好,70 ℃温浴1 h,还能维持50%以上的活力,而目前已有报道的LGOX,热稳定性普遍偏低,其中以Kusakabe等[18]所报道的LGOX热稳定性最佳,在0.1 mol/L pH 5.5缓冲剂中75 ℃以下维持15 min还具100%酶活力,但其表达量低,无法满足工业化生产制备要求;本研究中的重组LGOX在pH 5~6.5时,能维持80%以上的活力,说明该重组酶耐酸性较强,符合工业化生产制备的要求,为工业化生产α-KG提供参考依据;同时,本研究还发现外源添加一定浓度的Mn2+能促进LGOX活力,可为工业上酶转化生产α-KG提供一定的参考。

对来源K. setaed的LGOX异源表达及酶学性质分析,发现该酶作用条件温和,且稳定性能良好,为今后通过生物转化L-谷氨酸生产α-KG研究提供了理论支持。

4 结 论

研究来源于K. setaed的LGOX在大肠杆菌中异源表达及催化特性,发现在诱导剂IPTG终浓度为0.1 mmol/L时,20 ℃诱导18 h,重组大肠杆菌粗酶液酶活力最佳为49.10 U/mL,其催化特性结果显示该重组酶在温度为40 ℃和pH 6.0时,酶活力最佳,此外,该酶在70 ℃及以下温度保温1 h后,能维持其50%以上的酶活力,热稳定性良好,在pH 5~6.5时,能维持将近80%以上的酶活力,底物专一性强,外源加入Mn2+能促进重组LGOX活力,可为工业生产α-KG提供借鉴。

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Heterologous Expression and Characterization of Recombinant L-Glutamate Oxidase from Kitasatospora setae

CHEN Wen, LI Youran, GU Zhenghua, DING Zhongyang, ZHANG Liang, SHI Guiyang*
(National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology,School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Abstract:In order to achieve eff i cient bioconversion of L-glutamic acid to alpha ketoglutaric acid (α-KG), the L-glutamate oxidase (LGOX) gene from Kitasatospora setae KM-6054 was expressed in Escherichia coli BL21. According to the known LGOX sequence from K. setae and the codon bias of E. coli, the optimized LGOX gene sequence was synthesized and cloned into the pET28a (+) vector, which was then transferred into E. coli BL21(DE3) to obtain a recombinant LGOX.And enzymatic properties of the recombinant LGOX were also investigated. Results showed that the recombinant LGOX activity could reach 49.10 U/mL after induction at an IPTG concentration of 0.1 mmol/L at 20 ℃ for 18 h. Subsequently, the recombinant LGOX was purif i ed by aff i nity column chromatography to a specif i c activity of 45.98 U/mg and its molecular weight was about 70 kDa as determined by SDS-PAGE analysis. The enzymatic properties showed that the optimal reaction temperature and pH value were 40 ℃ and 6.0, respectively. The Michaelis-Menten constant Kmwas 1.23 mmol/L, and the maximum reaction rate Vmaxwas 76.24 μmol/(min·mg). L-Glutamic acid was the optimal substrate for the LGOX. The heterologous expression and characterization of recombinant L-glutamate oxidase in this study can provide a new way for biosynthesis of α-KG.

Keywords:Kitasatospora setae; L-glutamate oxidase; α-ketoglutaric acid; heterologous expression; enzymatic properties

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802010

中图分类号:Q814

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2018)02-0058-08

引文格式:陈稳, 李由然, 顾正华, 等. 白丝北里孢菌L-谷氨酸氧化酶的异源表达及酶学性质分析[J]. 食品科学, 2018, 39(2): 58-65.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802010. http://www.spkx.net.cn

CHEN Wen, LI Youran, GU Zhenghua, et al. Heterologous expression and characterization of recombinant L-glutamate oxidase from Kitasatospora setae[J]. Food Science, 2018, 39(2): 58-65. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802010. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2017-01-05

基金项目:国家自然科学基金青年科学基金项目(31401674);“十三五”国家重点研发计划重点专项(2016YFD0401404)

第一作者简介:陈稳(1992—),男,硕士,研究方向为工业微生物学与酶工程。E-mail:chenwenjnu@126.com

*通信作者简介:石贵阳(1963—),男,教授,博士,研究方向为发酵工程。E-mail:gyshi@jiangnan.edu.cn