特基拉芽孢杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶的异源表达及高密度发酵

范雪萍1,冯志彬1,*,房美芳1,张 娟2,陈国忠1,李丽娜1

(1.鲁东大学生命科学学院,山东 烟台 264025;2.鲁东大学农学院,山东 烟台 264025)

摘 要:L-天冬氨酸α-脱羧酶(L-aspartate α-decarboxylase,PanD)能选择性脱去L-天冬氨酸的α-羧基生成β-丙氨酸,具有重要的工业应用价值。以特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)PanD37的基因组为模板,扩增PanD表达基因panD,构建表达质粒pET32a(+)-panD,转入Escherichia coli BL21(DE3)成功实现异源表达。利用摇床和发酵罐优化培养条件实现高密度发酵,确定最佳培养条件为:37 ℃培养8 h,加入终浓度0.5 mmol/L的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)降温至26 ℃诱导,采用葡萄糖为碳源并控制初始质量浓度为5 g/L,发酵过程中采用pH-stat方式补料。在此基础上利用5 L发酵罐进行发酵产酶,酶活力最高可达1 109.8 U/mL,OD600nm达到106.3。全细胞催化100 g/L L-天冬氨酸,反应10 h物质的量转化率为99.2%。构建的重组菌经发酵优化后具有较高的细胞浓度和PanD活力,为生物法β-丙氨酸的工业化生产与应用提供理论支持。

关键词:特基拉芽孢杆菌;大肠杆菌;L-天冬氨酸α-脱羧酶;异源表达;β-丙氨酸

β-丙氨酸是一种重要的精细化工品和药物中间体,广泛用于合成肌肽、泛酸钙、巴柳氮、帕米磷酸钠及聚β-氨基丙酸等生化产品[1-4]。化学合成法是目前β-丙氨酸的主要生产方法,存在成本高、工艺条件苛刻、副产物较多及环境不友好等缺点,生物转化法生产工艺被认为是最有前景的替代方法。生物转化法是以L-天冬氨酸为生产原料,利用微生物胞内L-天冬氨酸α-脱羧酶(L-aspartate α-decarboxylase,PanD)催化L-天冬氨酸脱α位羧基生产β-丙氨酸[5]。因此生物生产法的研究重点是寻找到一个合适的PanD并进行高效的异源表达。

研究发现PanD仅存在于微生物和植物中,是泛酸合成途径中的关键酶[6-10]。目前报道的PanD主要来源于大肠杆菌[11](Escherichia coli)、结核分枝杆菌[12](Mycobacterium tuberculosis)、沙门菌[13](Salmonella typhimurium)、谷氨酸棒杆菌[14](Corynebacterium glutamicum)及幽门螺杆菌[15](Helicobacter pylori)等菌属。目前研究较多的是E. coli,在结构解析、自剪切机理及酶学性质方面取得不少成果,已证实PanD为丙酮酰基依赖型的脱羧酶,需要在翻译后通过电子重排促使肽链断裂,形成丙酮酰基活性中心[5]。亦有关于E. coli PanD(PanDE.c)工程表达的研究报道[16-18],但大多数酶活力低下,且重组PanDE.c在宿主E. coli内多以未激活的酶原形式存在,必须在PanZ或PanM蛋白的作用下才能在常温下进行剪切形成丙酮酰基[19]。Nicole等[20]克隆了C. glutamicum PanD(PanDC.g)和PanDE.c的合成基因并在E. coli中表达,PanDC.g活力约为PanDE.c活力的15.5 倍,且无需PanZ或PanM蛋白完成自剪切过程形成丙酮酰基。因此,近年来国内外学者关于PanD的研究更多的锁定在C. glutamicum上。赵连真等[21]克隆PanDC.g在E. coli BL21(DE3)中表达,酶活力高达9 4.1 6 U/m L,是目前为止报道的最高水平。Shen Yan等[22]对重组PanDC.g酶学性质进行充分研究,并以此为基础应用于β-丙氨酸催化合成,36 h可产生12.85 g/L的β-丙氨酸,转化率为97.2%,相较于PanDE.c有不少程度提高。Song等[23]利用E. coli W3110胞内异源扩增PanDC.g,同时强化表达天冬氨酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶,构建从葡萄糖开始的β-丙氨酸全合成途径,经39 h发酵β-丙氨酸产量达到32.3 g/L,葡萄糖转化率13.5%,为应用PanD合成β-丙氨酸开启了一条新思路。以上研究表明PanDC.g在生产β-丙氨酸方面取得较大的进步,但仍然存在酶活力不够高、产物浓度低、转化率低及生产周期长的缺点,和化学法相比仍无明显的成本优势,距离工业应用尚有一段距离。

邓思颖等[24]外源表达枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、C. glutamicum及E. coli的PanD,通过酶学性质比对发现芽孢杆菌属PanD具有更好的热稳定性和酶学特性,具有更强的工业应用潜力。本实验室前期筛选到1 株高活性PanD的特基拉芽孢杆菌(B. tequilensis)[25],在简单优化培养基的情况下酶活力可达44.57 U/mL,展现出良好的应用前景。以此菌panD基因为模板,构建了基因工程菌,可溶性表达PanD。同时为提高PanD的表达量,对其培养条件进行优化,进行高密度发酵,提高菌体密度的同时保持单位细胞合成目标蛋白的生产能力,以实现PanD活力的大幅度提高,为β-丙氨酸的工业化生产与应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大肠杆菌E. coli BL21(DE3)用于转化宿主,B. tequilensis PanD37提供panD基因,以上菌种均由应用微生物研究室保藏;质粒pET32a(+)购买于Novagen公司。

Ex Taq DNA聚合酶、dNTP、核酸限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ和T4 DNA连接酶 大连宝生物公司;细菌基因组提取试剂盒、细菌质粒提取试剂盒、DNA凝胶纯化试剂盒 上海生工生物有限公司;β-丙氨酸、氨苄青霉素 阿拉丁试剂(上海)有限公司;AccQ·Fluor试剂 美国Waters公司;豆粕水解液山东阳成生物科技公司;其他试剂均为分析纯 国药集团化学试剂有限公司。

LB培养基:酵母浸粉 5 g/L,蛋白胨 10 g/L,NaCl 15 g/L,pH 7.0;发酵培养基:甘油20 g/L,酵母浸粉5 g/L,蛋白胨5 g/L,豆粕水解液20 g/L,K2HPO413 g/L,MgSO4·7H2O 1 g/L,丁二酸1.5 g/L,(NH4)2SO45 g/L,微量元素母液5 mL/L,pH 7.0;微量元素母液:FeSO4·7H2O 10 g/L,ZnSO4·7H2O 2 g/L,CuSO4·5H2O 2 g/L,CaCl22 g/L,H3BO30.3 g/L,Na6Mo7O240.1 g/L,1 mol/L HCl溶液溶解并储于棕色试剂瓶中;补料培养基:甘油500 g/L,豆粕水解液40 g/L, MgSO4·7H2O 2 g/L,pH 7.0。灭菌条件皆为:121 ℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

SPX-150B-Z生化培养箱 广东省医疗器械厂;PCR仪美国Bio-Rad公司;ZWY-111G恒温振荡摇床 上海智城分析仪器制造有限公司;LDZX-75KB高压灭菌锅 上海申安医疗器械厂;TGL-16B高速离心机上海安亭科学仪器厂;BGZ-5自控发酵罐 上海保兴生物设备公司;高效液相色谱仪(high performance liquid chromatography,HPLC)(色谱柱为Waters AccQ-TagTM柱(150 mm×3.9 mm,4.0 μm)) 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 基因克隆与重组菌构建

根据B. tequilensis全基因组(LGRW01000001)中PanD的基因序列信息设计含有限制性内切酶BamHⅠ酶切位点(粗体表示)的上游引物F-PanD:5’-AAGGAT CCGAAGGAGATATACCATGTATCG-3’;含有EcoRⅠ酶切位点(粗体表示)的下游引物R-PanD:5’-TTCTC GAGCTACAAAATTGTACGGGCGGGTTC-3’。通过细菌基因组DNA提取试剂盒提取得到B. tequilensis PanD37基因组DNA,并以该基因组DNA为模板进行PCR扩增,PCR反应体系包括10×Ex Taq buffer(Mg2+Plus)4 μL,dNTPs mixture 4.5 μL,TaKaRa Ex Taq 0.3 μL,模板1.0 μL,上下游引物各1.0 μL,用dd H2O补足至50 μL。PCR参数为:94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,30 个循环后,72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶检测,并用DNA凝胶回收试剂盒纯化目标DNA片段。用BamHⅠ和EcoRⅠ分别酶切载体pET32a(+)及panD片段,然后用DNA连接酶将panD片段与载体连接并转化E. coli BL21(DE3)感受态细胞,挑选阳性克隆并提取质粒pET32a(+)-panD(图1),进行质粒PCR验证和DNA序列测序。

图1 重组质粒pET32a()-panD的构建
Fig. 1 Construction of recombinant plasmid pET32a (+)-panD

1.3.2 重组PanD的表达与SDS-PAGE分析

将重组菌接种于含100 mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中,37 ℃、200 r/min培养过夜。以1%接种量转接到含有100 mg/L氨苄青霉素的新鲜LB培养基中,37 ℃、200 r/min培养至菌液OD600nm约为0.5~0.8后加入1 mmol/L IPTG诱导,于30 ℃继续培养约16 h。4 ℃、8 000 r/min离心10 min,收集菌体,无菌水洗涤2 次,重悬于pH 7.0、50 mmol/L的磷酸盐缓冲液中,冰浴下超声破碎,12 000 r/min离心10 min,取上清酶液,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析。

1.3.3 培养条件

1.3.3.1 摇瓶培养

挑取1 环新鲜斜面菌种接入含50 mL LB培养基的500 mL三角瓶中,加氨苄青霉素至终质量浓度为100 μg/mL,37 ℃、200 r/min条件下培养6 h,作为种子液。按5%接种量将种子液接入含50 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中,37 ℃、220 r/min振荡培养4 h,降温至30 ℃并加入1 mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)继续诱导表达16 h。

1.3.3.2 发酵罐培养

挑取1 环新鲜斜面菌种接入含50 mL LB培养基的500 mL三角瓶中,加氨苄青霉素至终质量浓度为100 μg/mL,37 ℃、200 r/min条件下培养6 h,作为种子液。按5%接种量将种子液接入含3 L发酵培养基的5 L自控发酵罐中,初始转速200 r/min,初始通气流量为2 L/min,随着菌体OD600nm值增加调节转速与通气流量,以维持溶氧值在20%以上,用25%氨水调节pH值稳定在7.0,37 ℃培养8 h加入诱导剂降温至26 ℃进行蛋白表达,至酶活力不再增加时结束发酵。

1.3.4 发酵条件优化

1.3.4.1 诱导条件优化

改变IPTG浓度(0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mmol/L)、诱导时机(2、4、6、8、10 h)、诱导温度(22、26、30、34、37 ℃),诱导时间(4、8、12、16、20 h)在摇床上进行单因素发酵试验并检测酶活力及OD600nm。以IPTG浓度、诱导时机、诱导温度、诱导时间为变量,以PanD活力为指标,进行L9(34)正交试验,确定最佳诱导条件。

1.3.4.2 碳源优化

在确定诱导条件的情况下,以20 g/L的比例,分别添加葡萄糖及甘油作为碳源,在摇床上进行发酵实验并检测酶活力、乙酸及OD600nm

1.3.4.3 补料方式优化

采用优化后的诱导条件和最佳碳源,在5 L发酵罐上进行补料-分批发酵,待碳源耗尽后分别采用间歇流加、DO-stat、pH-stat方式流加补料培养基,发酵结束后取样检测酶活力、乙酸及OD600nm。全部测定数据均重复3次取平均值。

1.3.5 全细胞催化合成β-丙氨酸

配制100 g/L L-天冬氨酸溶液2 L,NaOH调节pH 7.0,加入湿菌体80 g(发酵结束后8 000 r/min、4 ℃离心10 min收集菌体),过程中自动流加2 mol/L HCl溶液控制pH值为7.0,温度40 ℃,在5 L自控发酵罐上转化10 h。

1.3.6 分析检测

生长量测定:将菌液适当稀释,在600 nm波长处测量其光密度,即OD600nm

酶活力测定[20]:酶反应体系:pH 7.0、50 mmol/L磷酸盐缓冲液2.0 mL、发酵液0.1 mL、L-天冬氨酸(200 g/L)0.4 mL,用NaOH调节pH值使L-天冬氨酸溶解,反应1 h,按体积比1∶1加入10%三氯乙酸溶液,4 ℃放置终止反应,AccQ·Tag法[16]测酶活力,即使用Waters公司的AccQ·Fluor试剂盒柱前衍生HPLC检测β-丙氨酸含量。酶活力定义:在pH 7.0、温度37 ℃的条件下,每l h转化生成1 μmol β-丙氨酸所需的酶量为1 个酶活力单位U。

L-天冬氨酸测定:使用Waters公司的AccQ·Fluor试剂盒柱前衍生HPLC检测L-天冬氨酸含量。

乙酸测定:按文献[26]方法。

1.4 数据统计与分析

实验设3次重复,结果以“表示,数据采用SAS 9.0软件进行统计分析,应用Origin 8.0软件绘制曲线图。

2 结果与分析

2.1 panD基因的克隆与重组菌构建

图2 panD基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图
Fig. 2 Electrophoresis of panD gene PCR product

以B. tequilensis PanD37基因组DNA为模板,根据特基拉芽孢杆菌全基因组(LGRW01000001)中panD基因序列设计引物,进行PCR扩增,扩增后琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2所示。经PCR扩增可得到400 bp左右条带,无非特异性扩增,与预期大小相符。使用DNA凝胶回收试剂盒纯化目标DNA片段。目的基因和pET32a(+)经双酶切,连接后得到重组质粒,然后全部转化到E. coli BL21(DE3)宿主菌,获得重组菌E. coli BL21(DE3)pET32a(+)-panD。随机挑取平板上的单个菌落,LB液体培养基(含100 μg/mL氨苄青霉素抗性)过夜富集培养。提取重组质粒,做质粒PCR验证,琼脂糖电泳检测,panD基因序列大小约为400 bp,与预期基因相符。取该重组质粒送样测序,测序结果表明,重组大肠杆菌构建成功,panD片段大小384 bp,提交NCBI数据库获得GenBank号:KY123117。

2.2 重组酶的表达与SDS-PAGE分析

图3 重组菌E. coli BL21(DE3)pET32a()-panD表达产物的
SDS-PAGE分析
Fig. 3 SDS-PAGE analysis of protein expression in recombinant E. coli BL21(DE3) pET32a(+)-panD

取重组菌的胞内蛋白粗提液(发酵液离心获菌体,超声破碎后,取上清液)进行SDS-PAGE分析,由图3可知,经IPTG诱导,重组大肠杆菌有目的蛋白的表达,目的蛋白大小约为12 kDa,略小于预期13.9 kDa,说明表达蛋白已完成自剪切形成丙酮酰基活性形式和β-亚基,β-亚基分子质量较小(小于2 kDa),电泳检测不到。同时测得重组菌E. coli BL21(DE3)pET32a(+)-panD的表达酶活力为78.3 U/mL,证明panD基因在E. coli BL21(DE3)成功异源表达。

2.3 诱导条件优化

2.3.1 单因素试验优化诱导条件

表1 不同诱导条件下重组菌株摇瓶产酶的酶活力及菌体浓度变化
Table 1 Enzymatic activity of PanD and cell growth in shake fl asks of recombinant E. coli under different induction conditions

在重组菌构建成功的基础上,优化诱导条件提高PanD的表达量,结果发现IPTG浓度、诱导时机及诱导温度对酶的合成有显著影响。由表1可知,IPTG对菌体的生长有抑制作用,但外源蛋白的表达水平随着诱导剂浓度的增加而不断升高,当IPTG浓度达到0.5 mmol/L时酶活力达到最高值169.7 U/mL;若继续提高浓度,对细胞生长产生毒性,蛋白表达水平会受到影响。分别在不同培养时间加入0.5 mmol/L的IPTG,同时降温至30 ℃诱导培养,发现过早诱导加重菌体代谢负担,不利于菌体生长,最终由于菌体生长量不足导致表达酶活力不高;诱导太晚,则菌体代谢开始降低,不利于外源蛋白的表达,在6~8 h诱导,此时菌体生长处于对数生长中期,代谢旺盛,外源蛋白也易于诱导表达。诱导后培养温度对外源蛋白表达也非常重要,温度过低,菌体生长缓慢,外源蛋白合成速率降低,表达酶活力不高;温度过高,菌体生长速率过快,重组蛋白因错误折叠形成包涵体,最终酶活力也不高。培养至8 h时,加入0.5 mmol/L的IPTG在不同温度下诱导酶的表达,结果显示温度在22~37 ℃变化时酶活力先上升后下降,并在温度为26 ℃时达到最高189.9 U/mL,可见适度的低温对外源蛋白的可溶性表达是有利的。试验最后发现诱导时间也是影响酶表达的重要因素,诱导时间越长酶活力越高,16 h酶活力达到最高后继续延长诱导时间酶活力反而下降。

2.3.2 诱导条件正交试验优化

结合单因素试验结果,以IPTG浓度、诱导时机、诱导温度、诱导时间为因素,设计四因素三水平正交试验,结果如表2所示,极差R值大小顺序为:RA>RC>RB>RD,说明IPTG浓度对PanD活力影响最大,其次是诱导温度、诱导时机和诱导时间。k值分析结果显示,4 个因素的最优组合为A2B2C2D3,即IPTG浓度0.5 mmol/L、诱导时机8 h、诱导温度26 ℃、诱导时间18 h。依据此组合进行发酵验证,最终酶活力为191.3 U/mL,高于正交试验中所有的组合,说明该组合确实为最佳诱导条件。

表2 诱导条件的正交试验优化方案及结果
Table 2 Orthogonal array design with experimental results of PanD activity for the optimization of induction conditions

2.4 碳源优化

表3 碳源对重组菌产PanD的影响
Table 3 Effects of carbon sources on the growth of recombinant E. coli and the yield of PanD

基因工程菌发酵过程中,培养基的组成既要有利于工程菌生长,又要保证外源蛋白有效表达。分别以20 g/L的葡萄糖、甘油作为碳源,在摇瓶中发酵产酶。由表3可知,相较于甘油,葡萄糖发酵过程中生成的乙酸远高于甘油培养基,抑制了外源蛋白的表达,但菌体生长量却显著提升,更有利于高密度发酵,如能控制乙酸的生成,缓解对蛋白表达的抑制作用,葡萄糖仍是比较合适的高密度发酵碳源。控制总糖20 g/L,分别设葡萄糖初始质量浓度为5、10、15 g/L,余糖均等分为15 份,自培养1 h开始补入,每小时补入1 次,在15 h补完,设对照组(总糖一次性加入),在摇床上振荡培养,结果(表4)显示降低初始糖质量浓度基本不影响菌体生长,但酶活力随初始糖质量浓度降低而显著增加,当初始糖质量低至5 g/L时,酶活力为235.1 U/mL,是对照组的1.7 倍,且乙酸质量浓度被控制在较低水平,保证菌体生长量的同时克服了葡萄糖作碳源酶活力不高的缺点。

表4 初始糖质量浓度对重组菌产PanD的影响
Table 4 Effects of initial glucose concentration on the growth of recombinant E. coli and the yield of PanD

2.5 补料方式优化

表5 补料方式对重组菌产PanD的影响
Table 5 Effects of feeding modes on the growth of recombinant E. coli and the yield of PanD

为进一步降低发酵过程中葡萄糖对外源蛋白表达的抑制作用,提高菌体生长量和酶活力,在5 L发酵罐上进行补料分批发酵,葡萄糖初始质量浓度设为5 g/L,当葡萄糖耗尽后分别采用间歇流加、DO-stat、pH-stat 3 种方式流加补料培养基,结果如表5所示,由于连续补充营养和发酵罐上环境条件的精准控制,3种方式的发酵结果均较摇瓶发酵有明显提高,OD600nm和酶活力成倍数增加,乙酸生成量亦得到显著控制,发酵结束时均低于1 g/L,其中尤以pH-stat方式补料发酵效果最好,酶活力提高至1 050.2 U/mL。

2.6 优化条件下重组菌高密度发酵

采用优化的发酵参数在5 L自控发酵罐上进行补料分批发酵。37 ℃培养8 h后降温至26 ℃,加入0.5 mmol/L的IPTG诱导产酶,间隔2 h取样测定OD600nm、酶活力及乙酸含量,结果如图4所示,重组菌接入发酵培养基后约2 h进入对数生长期,迅速生长导致氧气消耗加剧,应及时调节转速及通气量保证溶氧供给,在8 h降温并添加诱导剂后,菌体经短暂调适后继续保持增长,同时PanD在诱导剂作用下开启表达开关,并以较高的效率稳步合成,在22 h时,OD600nm与酶活力均达到最高,分别为106.3和1 109.8 U/mL,较摇瓶发酵酶活力达到峰值的时间有所提前,继续培养二者出现不同程度的衰减,应及时终止发酵。发酵过程中采用pH-stat流加补料有效控制葡萄糖质量浓度始终在5 g/L(数据未显示)以下,减少了乙酸的生成,22 h时乙酸质量浓度仅为0.39 g/L,最大程度地保证了外源蛋白的高效表达。

图4 最优条件下重组菌发酵生产PanD的过程曲线
Fig. 4 Time courses of recombinant E. coli fermentation under the optimum conditions

2.7 全细胞催化合成β-丙氨酸

图5 全细胞催化合成β-丙氨酸
Fig. 5 Time course of β-alanine production with whole-cell broth

2 L转化体系中加入200 g L-天冬氨酸,NaOH调节pH 7.0,升温至40 ℃加入80 g湿菌体,转化过程中L-天冬氨酸脱羧基释放CO2导致pH值上升,流加2 mol/L盐酸控制pH 7.0,反应10 h,结果如图5所示,β-丙氨酸5 h前线性增加,尤其反应开始的1 h内比合成速率达到19.5 g/(L·h),7 h后酶活力逐渐衰减,合成速率下降,最终产量为66.4 g/L,物质的量转化率为99.2%。

3 结 论

β-丙氨酸作为一种重要的医药和化工中间体,市场潜力巨大,针对目前化工合成法的缺点,微生物酶法生产β-丙氨酸显示了良好的应用前景和替代方案,受限于现有研究菌株低活性的PanD,难以满足低成本制造,尚难具备工业价值[27-28]。目前关于PanD的研究多集中于E. coli和C. glutamicum来源,且PanDC.g是截至目前PanD工程表达酶活力最高的菌株,鲜有关于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)PanD的研究成果,仅出现B. tequilensis与B. subtilis产PanD的零星报道[24-25],所产PanD均具有较好的热稳定性和酶学特性,但未见高活性B. subtilis PanD(PanDB.s)及应用方面的的研究成果。本研究以前期分离到的一株具有较高PanD生产能力的B. tequilensis基因组为模板克隆到panD,构建表达载体pET32a(+)-panD,将质粒转化入E.coli BL21(DE3),成功实现PanD在大肠杆菌中的异源表达。为提高重组菌的发酵水平,首先对该菌的诱导条件进行优化,确定了诱导剂的加量、最佳诱导时机及诱导温度,酶活力得到有效提升。选择重组菌发酵常用的两种碳源葡萄糖和甘油进行优化实验,发现葡萄糖有利于长菌,甘油有利于产酶,同时检测发酵液中乙酸含量发现葡萄糖更易于积累乙酸抑制酶的表达,和其他重组菌发酵的报道是一致的[29-30]。通过降低葡萄糖初始质量浓度有效降低了乙酸生成量,在保证菌体生长量的同时获得较高的表达水平,基于高密度发酵和生产成本考虑选择葡萄糖作为发酵碳源。为进一步提高酶活力,采用3 种补料方式在发酵罐上进行补料分批发酵,发现pH-stat方式补料在满足菌体营养的同时,有效避免了乙酸的生成,减轻对酶表达的抑制。采用优化条件在发酵罐上进行验证实验,由于采用了优化的诱导条件和有利于重组菌生长的葡萄糖作为碳源并进行pH-stat方式补料,控制葡萄糖质量浓度刚好满足菌体生长和产酶需要,降低了乙酸生成量,发酵22 h,OD600nm已达到106.3,成功实现高密度培养,菌体量远高于以往研究[16-23],得益于菌体高密度生长酶活力亦达到1 109.8 U/mL,是目前报道的最高水平。采用全细胞催化100 g/L底物L-天冬氨酸仅需10 h,物质的量转化率达99.2%,在酶法生产β-丙氨酸方面具有很大的可行性和应用前景。

参考文献:

[1] DECKER E A, LIVSAY S A, ZHOU S. A re-evaluation of the antioxidant activity of purif i ed carnosine[J]. Biochemistry (Moscow),2000, 65(7): 766-770.

[2] KHAN M U, BASEER M A, KUMAR S R, et al. Synthesis and characterization of metabolites and potential impurities of balsalazide disodium, an anti-inf l ammatory drug[J]. Synthetic Communications,2010, 40(15): 2241-2253. DOI:10.1080/00397910903221068.

[3] STEUNENBERG P, KONST P M, SCOTT E L, et al. Polymerisation of beta-alanine through catalytic ester-amide exchange[J]. European Polymer Journal, 2013, 49(7): 1773-1781.

[4] LIANG L Y, ZHENG Y G, SHEN Y C. Optimization of betaalanine production from beta-amino propionitrile by resting cells of Rhodococcus sp G20 in a bubble column reactor using response surface methodology[J]. Process Biochemistry, 2008, 43(7): 758-764.DOI:10.1016/j.procbio.2008.03.002.

[5] VANPOELJE P D, SNELL E E. Pyruvoyl-dependent enzymes[J].Annual Review of Biochemistry, 1990, 59(1): 29-59. DOI:10.1146/annurev.bi.59.070190.000333.

[6] FOUAD W M, RATHINASABAPATHI B. Expression of bacterial L-aspartate-α-decarboxylase in tobacco increases β-alanine and pantothenate levels and improves thermotolerance[J]. Plant Molecular Biology, 2006, 60(4): 495-505. DOI:10.1007/s11103-005-4844-9.

[7] RAMJEE M K, GENSCHEL U, ABELL C, et al. Escherichia coli L-aspartate-α-decarboxylase: preprotein processing and observation of reaction intermediates by electrospray mass spectrometry[J].Biochemical Journal, 1997, 323(3): 661-669. DOI:10.1042/bj3230661.

[8] COXON K M, CHAKAUYA E, OTTENHOF H H, et al. Pantothenate biosynthesis in higher plants[J]. Biochemcal Society Transactions,2005, 33(4): 743-746. DOI:10.1042/BST0330743.

[9] ALBERT A, DHANARAJ V, GENSCHEL U. Crystal structure of aspartate decarboxylase at 2.2 A resolution provides evidence for an ester in protein self-processing[J]. Nature Structural Biology, 1998,5(4): 289-293.

[10] SHARMA R, FLOREA M, NAU W M, et al. Validation of drug-like inhibitors against Mycobacterium tuberculosis L-aspartate α-decarboxylase using nuclear magnetic resonance (1H NMR)[J].PLoS ONE, 2012, 7(9): e45947. DOI:10.1371/journal.pone.0045947.

[11] WILLIAMSON J M, BROWN G M. Purification and properties of L-aspartate-alpha-decarboxylase, an enzyme that catalyzes the formation of beta-alanine in Escherichia coli[J]. The Journal of Biological Chemistry, 1979, 254(16): 8074-8082.

[12] GOPALAN G, CHOPRA S, RANGANATHAN A, et al.Crystal structure of uncleaved L-aspartate-α-decarboxylase from Mycobacterium tuberculosis[J]. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 2006, 65(4): 796-802. DOI:10.1002/prot.21126.

[13] ORTEGA M V, CARDENAS A, UBIERA D. Pand, a new chromosomal locus of Salmonella typhimurium for the biosynthesis of beta-alanine[J]. Molecular and General Genetics, 1975, 140(2): 159-164. DOI:10.1007/BF00329783.

[14] CUI W, SHI Z, FANG Y, et al. Significance of Arg3, Arg54, and Tyr58 of L-aspartate α-decarboxylase from Corynebacterium glutamicum in the process of self-cleavage[J]. Biotechnology Letters,2014, 36(1): 121-126. DOI:10.1007/s10529-013-1337-9.

[15] LEE B I, SUH S W. Crystal structure of the schiff base intermediate prior to decarboxylation in the catalytic cycle of aspartate alphadecarboxylase[J]. Journal of Molecular Biology, 2004, 340(1): 1-7.DOI:10.1016/j.jmb.2004.04.049.

[16] 高丽娟. L-天冬氨酸α-脱羧酶生产β-丙氨酸的研究[D]. 杭州: 浙江工业大学, 2007: 2-10.

[17] 洪敏, 赵春田, 张正波, 等. L-天冬氨酸α-脱羧酶工程菌株的构建及其培养条件研究[J]. 浙江工业大学学报, 2011, 39(3): 252-256.DOI:10.3969/j.issn.1006-4303.2011.03.004.

[18] CHOPRA S, PAI H, RANGANATHAN A. Expression, purif i cation,and biochemical characterization of Mycobacterium tuberculosis aspartate decarboxylase, Pand[J]. Protein Expression and Purif i cation,2002, 25(3): 533-540. DOI:10.1016/S1046-5928(02)00039-6.

[19] NOZAKI S, WEBB M E, NIKI H. An activator for pyruvoy L-dependent L-aspartate-α-decarboxylase is conserved in a small group of the γ-proteobacteria including Escherichia coli[J]. Microbiology Open, 2012, 1(3): 298-310. DOI:10.1002/mbo3.34.

[20] DUSCH N, PUHLER A, KALINOWSKI J. Expression of the Corynebacterium glutamicum panD gene encoding L-aspartate-αdecarboxylase leads to pantothenate overproduction in Escherichia coli[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1999, 65(4): 1530-1539. DOI:10.1109/5.118982.

[21] 赵连真, 张梁, 石贵阳. 谷氨酸棒杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶在大肠杆菌中的表达及酶转化生产β-丙氨酸[J]. 微生物学通报, 2013, 40(12):2161-2170.

[22] SHEN Y, ZHAO L, LI Y, et al. Synthesis of β-alanine from L-aspartate using L-aspartate-α-decarboxylase from Corynebacterium glutamicum[J]. Biotechnology Letters, 2014, 36(8): 1681-1686.DOI:10.1007/s10529-014-1527-0.

[23] SONG C W, LEE J, KO Y S, et al. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of 3-aminopropionic acid[J].Metabolic Engineering, 2015, 30(7): 121-129. DOI:10.1016/j.ymben.

[24] 邓思颖, 张君丽, 蔡真, 等. 枯草芽胞杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶的酶学性质[J]. 生物工程学报, 2015, 31(8): 1184-1193. DOI:10.13345/j.cjb.140109.

[25] 冯志彬, 张娟, 陈国忠, 等. 产L-天冬氨酸α-脱羧酶细菌的分离、鉴定及发酵条件优化[J]. 微生物学报, 2016, 56(1): 44-55.DOI:10.13343/j.cnki.wsxb.20150169.

[26] 章越, 沈亚领, 夏小霞, 等. 可溶性TRAIL蛋白的高密度培养及补料策略研究[J]. 生物工程学报, 2004, 20(3): 408-412. DOI:10.3321/j.issn:1000-3061.

[27] LEE B I, SUH S W. Crystal structure of the schiff base intermediate prior to decarboxylation in the catalytic cycle of aspartate alphadecarboxylase[J]. Journal of Molecular Biology, 2004, 340(1): 1-7.DOI:10.1016/j.jmb.2004.04.049.

[28] KONST P M, FRANSSEN M C R, SCOTT E L, et al. A study on the applicability of L-aspartate-α-decarboxylase in the biobased production of nitrogen containing chemicals[J]. Green Chemistry, 2009, 11(10):1646-1652. DOI:10.1039/b902731a.

[29] 郑志永, 姚善泾. 应用溶氧反馈控制高密度培养重组大肠杆菌过程中乙酸的产生[J]. 高校化学工程学报, 2006, 20(2): 233-238.DOI:10.3321/j.issn:1003-9015.2006.02.015.

[30] 陈冠宇, 袁建锋, 吴绵斌. 以甘油为碳源分批补料高密度发酵产环氧化物水解酶[J]. 高校化学工程学报, 2014, 28(3): 600-605.DOI:10.3969/j.issn.1003-9015.2014.03.026.

Heterologous Expression of the Bacillus tequilensis L-Aspartate α-Decarboxylase in Escherichia coli and Its High Cell Density Fermentation

FAN Xueping1, FENG Zhibin1,*, FANG Meifang1, ZHANG Juan2, CHEN Guozhong1, LI Lina1
(1. School of Life Sciences, Ludong University, Yantai 264025, China;2. School of Agriculture, Ludong University, Yantai 264025, China)

Abstract:L-Aspartate α-decarboxylase is an important industrial enzyme which can stereo-selectively transform L-aspartate acid into β-alanine. In the present study, we cloned and expressed the L-aspartate α-decarboxylase gene (panD) from Bacillus tequilensis to construct an L-aspartate α-decarboxylase-producing Escherichia coli strain and optimized the culture conditions for high cell density fermentation. Using the genome of B. tequilensis PanD37 as template, the panD gene was amplified, and the recombinant plasmid pET32a(+)-panD was constructed and transformed into E. coli BL21(DE3) for expression. For high cell density growth and eff i cient L-aspartate α-decarboxylase expression, the optimum fermentation conditions in shake fl asks were determined as follows: a pH-stat fed-batch culture was performed using glucose as the carbon source at an initial concentration of 5 g/L; after 8 h of culture at 37 ℃, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) was added to a fi nal concentration of 0.5 mmol/L as an inducer and the temperature was reduced to 26 ℃. Maximum L-aspartate α-decarboxylase activity of 1 109.8 U/mL and OD600nmvalue of 106.3 were obtained when the fermentation was carried out in a 5 L fermentor. Whole-cell catalysis of 100 g/L L-aspartate gave a molar conversion rate of 99.2% after 10 h of reaction. This work can provides a promising basis for further application of L-aspartate α-decarboxylase in industrial β-alanine production.

Keywords:Bacillus tequilensis; Escherichia coli; L-aspartate α-decarboxylase; heterelogous expression; β-alanine

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802023

中图分类号:Q935

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2018)02-0144-07

引文格式:范雪萍, 冯志彬, 房美芳, 等. 特基拉芽孢杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶的异源表达及高密度发酵[J]. 食品科学, 2018, 39(2):144-150.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802023. http://www.spkx.net.cn

FAN Xueping, FENG Zhibin, FANG Meifang, et al. Heterologous expression of the Bacillus tequilensis L-aspartate α-decarboxylase in Escherichia coli and its high cell density fermentation[J]. Food Science, 2018, 39(2): 144-150. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802023. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2017-02-24

基金项目:山东省农业重大应用技术创新项目(鲁财指2014-38)

第一作者简介:范雪萍(1995—),女,学士,研究方向为生物工程。E-mail:xuepingFan95@163.com

*通信作者简介:冯志彬(1977—),男,讲师,硕士,研究方向为微生物发酵与酶催化。E-mail:zhibinfeng@126.com