加工肉制品由于具有营养美味、食用方便等特点深受消费者喜爱，其富含蛋白质和微量元素。但是，加工肉制品同样含有大量的饱和脂肪酸和胆固醇。以乳化肠为例，其含有高达30%的动物脂肪。过多的脂肪摄入会导致各种疾病的发生，例如肥胖、高血压、心血管疾病和冠心病等[1]。因此，降低脂肪含量是当前肉制品加工行业急需解决的问题之一。在肉制品加工过程中，水分占据了举足轻重的地位，水分子的存在形式和分布状态决定了乳化肠的保水性、出品率及货架期等。乳化肠中加入脂肪的作用就是提高其多汁性和保水性，使其蒸煮之后不会过分收缩，从而具有光滑、细腻的口感[2]。目前国内外研究普遍采用脂肪替代的手段来降低脂肪含量，而消费者追求肉制品营养天然的需求则对打破常规脂肪替代法来实现降脂提出了要求[3-4]。然而，不采用脂肪替代，单一调整脂肪和水的比例来降低产品中的脂肪含量会导致最终产品保水性差，出水出油现象严重，影响消费者对产品的接受程度。
超高压技术（high pressure processing，HPP）是一种新型非热杀菌技术，其因具有杀菌、灭酶、延长货架期及改善产品质构等特点而被广泛应用在多个研究领域[5]。相关文献报道超高压技术可以降低肉制品中的盐含量[6-10]。但是关于利用超高压技术改善低脂乳化肠的保水性和凝胶结构的研究还比较少。
本研究通过测定不同压强（0.1、100、200、300 MPa）处理后低脂乳化肠的保水性、低场核磁和微观结构，以研究超高压技术能否改善低脂乳化肠保水性以及超高压技术对蛋白凝胶结构的影响和凝胶结构与水分分布的关系。
实验原料选用优质猪背最长肌及猪背膘，辅料如食盐、糖、三聚磷酸钠、白胡椒粉等均购于南京市农贸市场；其他试剂均为国产分析纯。
SIM-F124制冰机 日本三洋公司；TE412-L电子天平 德国赛多利斯公司；UMC-5C斩拌机 德国Stephan公司；S-IL-100-850-9-W高压设备 英国Stansted公司；TA-XT Plus物性测试仪 英国Stable Micro Systems公司；DC-800真空包装机 美国希悦尔公司；TW20通用水浴槽 德国Julabo公司；PQ001型核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）成像分析仪上海纽迈电子科技有限公司；S-3000N扫描电子显微镜日本Hitachi公司。
1.3.1 样品处理
将背最长肌用筛孔直径为0.8 cm的绞肉机绞碎后真空包装，分别于100、200、300 MPa处理9 min，0.1 MPa（大气压强）处理为对照组，温度保持在10 ℃。
1.3.2 肉糜制作
参照Lin Kuowei等[11]的方法，并稍加改动。以瘦肉50.0 g、肥膘20.0 g计，其他添加物配比为冰水30.0 g、食盐1.5 g、糖0.5 g、三聚磷酸钠0.2 g、白胡椒粉0.3 g。先将肥膘用直径0.8 cm筛孔的绞肉机绞碎，然后将处理组及对照组瘦肉分别放入斩拌机，1 500 r/min斩拌30 s，斩拌过程中加入食盐、三聚磷酸钠和1/3体积冰水，停3 min；再1 500 r/min斩拌30 s，斩拌过程中加入其他辅料、猪背膘和1/3体积冰水，停3 min；最后3 000 r/min斩拌60 s，斩拌过程中加入1/3体积冰水，使中心温度低于10 ℃。
1.3.3 乳化肠制作
将25.0 g肉糜放入50 mL离心管中，80 ℃水浴加热20 min，之后4 ℃冷藏。
1.3.4 保水性的测定
参照Kang Zhuangli等[12]的方法，并稍加改动。称取25.0 g生肉糜至50 mL离心管中，500×g离心15 min以去除肉糜中的气泡。之后将离心管放入80 ℃水浴中加热20 min。取出后将离心管倒置放于干燥皿（提前称质量m1）中，在室温下放置50 min后，称取干燥皿的质量m2。保水性按式（1）计算。
1.3.5 NMR横向弛豫时间（T2）的测定
将乳化肠置于室温（25 ℃）平衡30 min后，直接切取2.0 g（勿切碎）放入直径15 mm的核磁管中进行测试。采用低场NMR弛豫CPMG序列测试，具体条件参照文献[13]：温度32 ℃，磁场强度0.5 T，共振频率22 MHz，开始采样时间的控制参数为80 μs，重复采样16 次，半回波时间250 μs，重复间隔时间6 s，得到回波13 000 个。获得的数据采用MultiExp Inv Analysis软件进行反演[14]，得到T2。反演数学模型如式（2）所示。
式中：A（t）为衰减到时间t/ms时的振幅；A0i为第i个组分平衡时的振幅；T2i为第i个组分的自旋-自旋弛豫时间/ms。
1.3.6 微观结构观察
参照Feng Xianchao[15]和Bian Guangliang[16]等的方法，并稍加改动。使用扫描电子显微镜进行样品微观结构的观察，制样方法为：将乳化肠切块（约3 cm3）后放入质量分数2.5%戊二醛溶液中固定24 h，之后切成1 cm3小块，经过漂洗（0.1 mol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.2）、固定（质量分数1%四氧化锇）、漂洗、脱水（乙醇）、冷冻干燥、喷金，用扫描电子显微镜拍照。
利用Image J软件对扫描电子显微镜图片进行二维化处理，一般在凝胶网络结构体系中形成的孔径小于1 μm，而图形统计分析时的单位为pixel，因此根据图片中的比例尺和软件统计分析单位（pixel）按比例换算，得出对应直径小于1 μm孔穴中对应于统计单位pixel的面积，从而进行统计分析。
所有实验重复4 次，应用SPSS 20.0软件进行分析，先进行一般描述性统计，再进行方差分析（用Duncan’s新复极差法进行多重比较），以P＜0.05表示差异显著。用Rstudio 3.5.0软件中FactoMiner分析包进行主成分分析[17]，并使用Factoextr分析包进行主成分分析结果的可视化处理。
图1 不同压强对低脂乳化肠保水性的影响
Fig.1 Changes in water-holding capacity of low-fat emulsion sausages subjected to HPP treatments
如图1所示，乳化肠的保水性随着压力的变化呈显著差异（P＜0.05）。和对照组相比，经过高压处理的低脂乳化肠保水性随着压强的升高而显著增大；当作用压强增加到200 MPa时，乳化肠的保水性提高至最高值96.51%；但是当作用压强超过200 MPa达到300 MPa时，乳化肠的保水性反而下降，与对照组差异不显著，达到90.18%。实验数据显示200 MPa的作用压强是改善低脂乳化肠保水性的最大压强。
本研究结果与马亚萍等[18]的结果基本一致，其发现添加了卡拉胶的鸡胸肉肉糜经高压处理后，其蒸煮损失率及水分损失率随着压强升高而减小，在200～400 MPa处理时达最低值后，又随着压强升高逐渐增加。Yang Huijuan等[19]的研究同样发现经过200 MPa高压处理2 min，乳化肠的保水性和多汁性得到显著的改善。这可能是因为高压处理可以提高肌原纤维蛋白的溶解性，在后续的加热过程中，有更多的肌原纤维蛋白疏水基团暴露出来，发生疏水交联，形成更加稳定的三维网络结构，从而提高了乳化肠最终的保水性[20]。但是当作用压强超过200 MPa时，乳化肠的保水性下降，其原因可能是在300 MPa处理时，高压作用导致肌球蛋白分子聚集，其结构过度变性，进而在加热过程中抑制了凝胶网络结构的形成，使其保水性下降[21]。
图2 低脂乳化肠的低场NMR横向弛豫时间T2
Fig.2 T2relaxation times of water states in low-fat emulsion sausages
肌原纤维蛋白凝胶中的水分主要包括自由水、不易流动水和结合水3 种形态[22]。自由水代表凝胶中能够自由流动、存在于凝胶表面的水，通常是指热诱导凝胶过程中流失的水分；不易流动水是束缚于肌原纤维蛋白凝胶网络结构中的水分，约占总水分的80%；结合水是指与大分子紧密结合的一部分水分子[23]。横向弛豫时间T2可以反映样品中水分子的自由度，其弛豫时间的变化可以用于表征经不同压强预处理乳化肠中水分分布的情况，即水分分布状态和自由移动程度；弛豫峰面积比例可以反映各种状态水分的相对含量，其变化情况可以表征经不同压强预处理的乳化肠中3 种分布状态水分含量变化情况[24-25]。由图2可知，低脂乳化肠T2呈现3 个峰，其对应的横向弛豫时间分别为：0～3（结合水，T2b）、50～100（不易流动水，T21）、300～600 ms（自由水，T22）。
表1 不同压强对低脂乳化肠横向弛豫时间T2的影响
Table1 Effect of HPP on T2relaxation time of water from low-fat emulsion sausages
注：同列肩标小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）；下同。
压强/MPa T2b/ms T21/ms T22/ms 0.1 1.63±0.31a72.27±1.59d411.83±52.01b100 1.43±0.09a78.23±1.15b453.44±70.65ab200 1.53±0.22a85.67±1.26a448.82±56.37ab300 1.59±0.04a74.80±1.05c554.20±104.54a
由表1可知，高压处理对低脂乳化肠的结合水T2b无显著影响。但是高压处理显著影响了乳化肠中不易流动水T21，随着高压作用力的增加而呈现先升高后降低的趋势。T21越小，说明蛋白凝胶三维网络结构对不易流动水的束缚能力越强；反之，T21越大，束缚能力越差。因此，高压处理会导致凝胶结构中不易流动水的束缚能力显著变差，尤其在200 MPa处理时，T21最大，为85.67 ms。杨慧娟等[26]在研究通过高压处理改善低脂低盐乳化肠的品质时发现了同样的现象。此外，低脂乳化肠中自由水T22受高压作用影响较小，呈不规则变化，这可能与自由水不受到外界束缚有关。
表2 不同压强对低脂乳化肠的横向弛豫峰面积比例的影响
Table2 Effect of HPP on peak area fraction of water from low-fat emulsion sausages
压强/MPa P2b/% P21/% P22/%0.1 3.48±0.26c85.82±0.34c10.71±0.36a100 4.20±0.38b88.48±0.41b7.32±0.57b200 4.60±0.12a91.42±0.44a3.99±0.41c300 4.64±0.06a85.08±1.00c10.28±0.99a
由表2可知，与对照组相比，不同高压处理显著影响了结合水和不易流动水的横向弛豫峰面积比例（P＜0.05）。随着压强的升高，乳化肠中结合水的峰面积比例（P2b）显著提高，说明在高压作用下肌原纤维蛋白基团会和水分子发生水合作用。不易流动水的峰面积比例（P21）在200 MPa处理时达到最大值，说明经该高压条件处理的乳化肠能够束缚最大量的不易流动水。自由水的峰面积比例（P22）在0.1～200 MPa范围内随着压强的增加显著下降（P＜0.05），从对照组的10.71%下降到200 MPa处理组的3.99%。由此可知，高压处理会显著影响水分分布情况，随着压强的增加，自由水相对含量降低，而结合水和不易流动水的相对含量升高，说明超高压处理能使乳化肠中的自由水向结合水和不易流动水转化。
图3 超高压作用对低脂乳化肠显微结构的影响（×2 000）
Fig.3 Changes in microstructure of low-fat emulsion sausages subjected to HPP treatments (× 2 000)
由图3可知，高压处理显著影响蛋白凝胶网络结构。对照组凝胶网络结构致密，但是其中存在水壑，将凝胶整体分割呈片状或区域化。经过高压处理后，凝胶网络结构变得多孔疏松，呈海绵状结构，存在大量的水穴。尤其是200 MPa处理组的凝胶网络结构中孔状海绵结构最多、最大，可以束缚大量的水分，因此200 MPa处理组低脂香肠具有最好的保水性。当处理压强增加到300 MPa时，凝胶网络结构重新变得致密、紧凑，孔状结构变小，数量减少，但是结构整体没有像对照组一样呈片状化。为了更好地对蛋白凝胶微观变化差异进行量化和客观分析，利用Image J软件对扫描电子显微镜图片进行二维化处理，测量凝胶结构中孔隙的大小和数量[27]。由表3可知，2 0 0 M P a处理组的孔径和数量分别是484.2 pixel2和399 个，显著大于对照组的孔径和数量（342.7 pixel2和177 个）。因此，高压处理可以改善蛋白凝胶中孔状海绵结构，使孔变大、增多，以便束缚更多的水分于其孔隙中，这一现象在200 MPa处理时尤为明显。陆海霞等[28]同样发现在合适的压强处理条件（300、400 MPa）下，肌原纤维蛋白凝胶可以形成均匀的网络结构，但当压强继续增大时，凝胶中出现了大的凝结块。其作用压强比本研究大，可能是由于他们的研究中肌原纤维蛋白凝胶未经加热处理，仅使用超高压成胶。
表3 不同压强对低脂乳化肠的网络结构孔径和数量的影响
Table3 Effect of HPP on particle size and number of cavities in microstructure of low-fat emulsion sausages
压强/MPa 孔径/（pixel2） 数量/个 总面积/（pixel2）0.1 342.7±15.1c177±13c60 801±6 946c100 405.5±18.3b256±18b103 722±7 443b200 484.2±17.3a399±51a193 313±23 171a300 289.7±12.6d245±15b71 151±7 034c
蛋白凝胶的微观结构直接影响其最终的理化特性，例如保水性和凝胶强度等。缺少对凝胶微观结构的量化分析将无法客观分析微观结构和理化特性的相关性。本研究通过测定水分孔隙大小和数量来间接反映凝胶的微观结构，为分析微观结构和理化特性的相关性提供了可能。同时，利用主成分分析软件评估保水性、弛豫特性和微观结构之间的相关性。图4、5是主成分分析的结果，第1主成分贡献率为66.96%，第1主成分和第2主成分的总贡献率为82.83%，说明保水性、弛豫特性和微观结构之间存在很强的相关性。从载荷图中可以发现：孔径、数量、总面积、保水性、P21、T21与第1主成分呈正相关，P22与其呈负相关；第2主成分中T22和P2b与其呈正相关。从散点图中发现，4 个处理组呈现离散状态，彼此之间没有重合。这说明超高压处理显著影响了最终乳化肠的保水性、水分分布状态和微观结构。而从第1主成分（微观结构和保水性）分析可知，4 个处理组主要分成3 类：200 MPa处理组、100 MPa处理组与0.1、300 MPa处理组。说明0.01 MPa处理组和300 MPa处理组的微观结构和保水性相似，而200 MPa处理组和100 MPa处理组的微观结构和保水性发生了明显变化。发生以上现象的原因可能是超高压处理使得低脂乳化肠凝胶结构中孔径和数量显著增加，从而提高了低脂乳化肠的保水性，但是孔隙结构的增加也导致凝胶结构对水分束缚能力的下降（T21增加）。超高压处理提高低脂乳化肠持水能力的最佳压力为200 MPa，其提高低脂乳化肠保水性的原因是：一方面，超高压能促使水分子和蛋白质基团发生聚合作用，让不易流动水填补到蛋白质氨基酸侧链周围而变成结合水，同时蛋白质大分子链在高压作用过程中发生构象变化，也会利于极性亲水基团暴露与水分子的结合，实验结果显示超高压处理可以显著提高凝胶体系中结合水的比例[29]；另一方面，超高压处理可以提高肌原纤维蛋白的溶解性，这样在后续的加热过程中，有更多的肌原纤维蛋白疏水基团暴露出来，进而发生疏水交联。此外，文献[30-31]也报道这可能是由于高压处理可以促进蛋白分子局部变性解聚，疏水残基周围形成网络结构，该结构有利于水分子的束缚。
图4 变量与主成分间的相关性（载荷图）
Fig.4 Correlation among variables and principal components (loading plot)
图5 不同压强处理样品主成分评分（散点图）
Fig.5 Principal component score scatter plot for HPP-treated samples at different pressures (scatter plot)
经超高压处理的乳化肠体系中水分子的分布状态发生显著变化。随着作用压强从0.1 MPa（大气压强）增加到300 MPa（尤其在200 MPa时），乳化肠凝胶体系中结合水与肌肉蛋白的结合程度增强，自由水向不易流动水和结合水转化，提高了乳化肠的保水性。主成分分析发现乳化肠保水性和凝胶微观结构显著相关，超高压处理显著影响乳化肠微观结构中孔径和数量以及水分分布。
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Effect of High Pressure Processing on the Water State and Microstructure of Low-Fat Emulsion Sausages