不同NaCl浓 度条件下亚麻籽胶对肌原纤维蛋白凝胶作用力及乳化特性的影响

冯美琴1,刘雯燕2,孙 健2,*,徐幸莲2,周光宏2

(1.金陵科技学院动物科学与技术学院,江苏 南京 210038;2.南京农业大学食品科技学院,国家肉品质量安全控制工程技术研究中心,江苏 南京 210095)

摘 要:为改善低盐肉制品凝胶乳化品质的降低,明确亚麻籽胶(f l axseed gum,FG)添加对肉制品品质的影响,以肌原纤维蛋白(myofibrillar protein,MP)为研究对象,通过测定乳析指数、电位值、粒径、显微观察研究不同NaCl浓度条件下FG对MP乳液乳化稳定性的影响,而化学键的测定显示FG对MP凝胶化学作用力的影响。结果表明,形成MP凝胶及FG-MP凝胶体系的关键是二硫键和非二硫共价键的贡献;不同NaCl浓度对FG-MP乳液的乳析指数、ζ-电位、粒径的影响均不显著(P>0.05),而MP乳液随着NaCl浓度的提高,乳化稳定性、ζ-电位、粒径均显著变化(P<0.05)。特别是在低浓度NaCl条件下,FG的加入可以显著提高MP乳液的稳定性(P<0.05)。显微观察发现加入FG可以改善MP乳液液滴聚集的现象。因此,说明在低浓度NaCl条件下加入FG可以显著提高肌原纤维蛋白乳液的乳化稳定性,提高其抗盐能力,促进亚麻籽在肉制品中的应用。

关键词:亚麻籽胶;肌原纤维蛋白;化学作用力;乳化稳定性

肌原纤维蛋白(myofibrillar protein,MP)作为肌肉中的结构蛋白质群,除了影响肌肉的收缩及嫩度外,它也是参与乳化的主要物质,并且其受热形成的凝胶对乳化肉制品的质构、黏着性、保油保水性和出品率有直接的影响[1]。因此,MP在重组肉制品和糜类肉制品加工过程中起着重要作用[2]。另外,MP乳化凝胶作用受其理化性质的影响,例如肌肉类型、蛋白质浓度、温度、pH值和离子强度,同时受其他添加物的影响。其中,食盐是肉类加工过程中必需的辅料之一[3-4],它可以改善肉制品的保水保油能力,产品质构以及感官品质[5]。Whiting[6]研究发现在法兰克福香肠中降低NaCl含量可以增加脂肪和水在蒸煮过程中的损失。吴菊清[7]研究发现低盐条件会影响MP乳化物及乳化凝胶的水分分布,降低凝胶保水性。据报道[8]食盐的过多摄入会影响人类健康。因此在实际生产中,常常通过添加亚麻籽胶(f l axseed gum,FG)等亲水胶体改善低盐条件下造成的肉制品品质劣变。

FG是从亚麻籽中提取的一种阴离子多糖,具有良好的胶凝、发泡、乳化、保水和流变特性。Chen Haihua等[9]研究FG与肉蛋白间相互作用,发现添加FG能够显著提高蛋白质的热变性温度,并且增加保水性和硬度。孙健[10]研究发现添加FG的猪肉MP凝胶结构变得更加致密连续。Feng Meiqin等[11]研究发现MP的保水性随着FG的添加量的提高而增强。MP热诱导凝胶的功能特性(比如凝胶保水性)主要取决于化学作用力[12]。目前报道主要集中于单一理化条件下对MP的影响,本实验创新性地通过在不同NaCl浓度条件下加入FG研究其能否提高低浓度NaCl条件下的乳化凝胶特性。另外,以猪油为油相模拟简单的肉糜体系研究FG-MP的乳化作用也鲜见报道。

本实验在不同NaCl浓度条件下,研究FG-M凝胶的作用力(离子键、氢键、疏水相互作用、二硫键和非二硫键)和FG-MP凝胶的作用机理,同时以猪油为油相研究FG-MP乳液的乳析指数、脂肪微粒粒度分布、ζ-电位以及显微观察研究NaCl浓度对FG-MP乳化体系稳定性的影响,从而确定FG对MP乳化凝胶的作用机制,促进FG在肉制品中的应用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

宰后24 h(pH 5.6~5.8)的猪肉背最长肌,购于南京苏果超市;猪背膘熬制,用纱布过滤得到猪油,真空包装,置于-20 ℃保存。

FG(纯度99.8%,含有16.09%蛋白质、5.10%水和4.35%灰分) 新疆绿旗公司;氯化钠、氯化钾、氯化镁、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、Triton X-100、酒石酸钾钠、磷酸氢钾、磷酸二氢钾、氢氧化钠、牛血清白蛋白、三羟甲基氨基甲烷-盐酸、乙二胺四乙酸二钠、甲醇、十二烷基硫酸钠、尿素、碳酸钠、硫酸铜等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Ultra-Turrax T25 basic数显型高速分散机 德国IKA公司;AR64型高速冷冻离心机 美国Beckman-Coulter公司;M2e多功能酶标仪 美国MD公司;AUY120型天平 日本岛津公司;Worcestershire激光粒度分析仪、Nano ZS90电位仪 英国Malvern公司;DP12倒置显微镜日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 MP的提取

参照Han Minyi等[13]的方法并进行改进。称取100 g肉,用绞肉机搅碎后,加入400 mL pH值为7.0提取液(其中含20 mmol/L K2HPO4-KH2PO4、100 mmol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L乙二醇二乙醚二胺四乙酸)于1 000×g离心10 min后收集沉淀,重复2 次,期间用匀浆机处理30 s。然后向离心后的沉淀中加入400 mL提取液,再加入4 mL Triton X-100,充分混匀后1 500×g离心10 min,再向沉淀中加入400 mL 0.1 mol/L KCl溶液,1 500×g离心10 min收集沉淀,重复2 次。最后沉淀加入400 mL去离子水,1 500×g离心10 min收集沉淀,重复2 次。由以上操作得到无盐的MP,用双缩脲法测其蛋白质量浓度,密封置于4 ℃保存备用。上述过程均在4 ℃条件下进行。

将提取的蛋白分别溶于含有不同浓度的NaCl(0、0.2、0.4、0.6 mol/L)的磷酸盐缓冲液(0.05 mol/L K2HPO4-KH2PO4,pH 6.5)中,根据实验要求配制相应浓度的MP溶液,置于4 ℃保存备用。

1.3.2 FG-MP凝胶的制备

将FG与猪肉MP用匀浆机混合均匀,使MP最终质量浓度为40 mg/mL,加入质量分数0.4% FG。将配好的样品放入水浴锅,以约1 ℃/min的速率从20 ℃升温到70 ℃,保温30 min。冷却后测定相关指标。

1.3.3 FG-MP复合凝胶体系分子间相互作用力测定

参照兰冬梅[14]的方法,称取凝胶样品3 g,加S1(0.6 mol/L NaCl,30 mL),用5 000 r/min匀浆2 min,然后放置1 h,10 000×g离心25 min后上清液保存。离心后的沉淀加S2(0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素,30 mL),重复上述步骤,将沉淀继续加S3(0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素,30 mL),重复上述步骤,向沉淀加S4(0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素+0.5 mol/L β-巯基乙醇,30 mL),重复上述步骤,最后所得的沉淀加2 mL 1 mol/L NaOH溶液保存。并且所得的所有上清液分别加入相同体积的20%三氯乙酸溶液,5 500×g离心15 min,取其沉淀,向沉淀中加入2 mL 1 mol/L NaOH溶液保存,然后用Lowry法测定蛋白质的含量。上述过程均在4 ℃条件下进行。其中,S1蛋白含量代表离子键,S2蛋白含量代表氢键,S3蛋白含量代表疏水相互作用,S4蛋白含量代表二硫键,S4离心后沉淀的蛋白含量代表非二硫共价键。

1.3.4 乳化液的制备

FG添加量是依据前期研究结果[15]所得,研究发现添加质量分数0.4% FG条件下,乳液能够保持相对稳定,并且在低离子强度(0、0.2 mol/L NaCl)条件下没有发生乳析现象。

将质量分数0.4% FG溶解于0、0.2、0.4、0.6 mol/L不同浓度NaCl的MP溶液中,使MP最终质量浓度为10 mg/mL。再分别将含有FG和不含FG的MP溶液中加入10%猪油,8 000×g匀浆制成乳状液。上述过程均在40 ℃条件下进行。准备的乳化液要在24 h之内使用。

1.3.5 乳化稳定性的测定

将待测样品置于玻璃试管(1.0 cm×15 cm)中,在常温条件下静置3 h及30 d记录乳析界面高度的变化。乳析指数按下式计算:

式中:Hs为清液的高度/cm;Ht为乳化液的初始高度/cm。

1.3.6 ζ-电位的测定

采用马尔文粒径仪测定颗粒的ζ-电位。所有样品用双蒸水稀释10 倍通过在一个良好的电场中。测量颗粒的运动速度与方向从而测定电位大小。采用Smoluchowski模型计算流动值的电位。

1.3.7 脂肪微粒粒度分布测定

参考Ahmed等[16]的方法并进行修改。其中,颗粒折射率为1.520,分散剂为水,分散折射率为1.330,颗粒吸收率为0.001,分析模式为通用球形,进样器名为Hydro 2000 MU(A),噪音为30 s。采用Mastersizer 3000型激光粒度分析仪进行测定,得到脂肪微粒粒度分布图谱。数据结果用平均粒径D4,3表示。

1.3.8 光学显微镜

乳液的微结构研究使用光学显微镜观察。将乳液滴到载玻片上并用盖玻片覆盖。使用显微镜数字照相机(OlympusDP12,Tokyo,Japan)连接到软件(Olympus DP12,Tokyo,日本)安装在计算机上。

1.4 数据统计分析

每个实验重复3 次,采用SAS 9.2统计软件计算。采用Duncan’s multiple range test程序分析平均值和差异,并在显著性水平P值小于0.05时进行单因素方差分析和t检验,评估样本组之间的差异。

2 结果与分析

2.1 不同NaCl浓度条件下FG对MP凝胶体系分子间相互作用力的影响

图1 不同NaCl浓度条件下FG对MP凝胶体系分子间相互作用力的影响
Fig. 1 Effects of different NaCl concentrations and FG on the chemical interactions of MP gel

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

如图1所示,MP凝胶中疏水相互作用、二硫键以及非二硫共价键所占的比例较大,而离子键和氢键所占比例较小。兰冬梅[14]在研究罗非鱼肌肉蛋白凝胶过程中也发现了类似的结果。随着NaCl浓度的提高,可以看出二硫键和非二硫共价键的含量是随之升高的(P<0.05)。并且当NaCl浓度达到0.6 mol/L时,在不含FG的MP凝胶中二硫键含量是最高的。关于疏水相互作用,不含FG的MP凝胶出现了先升高后降低的现象,在0.2 mol/L NaCl条件下达到最大。而在实验范围内,离子键和氢键的含量无显著变化(P>0.05)。另外,相对于对照组,FG-MP凝胶的作用力随着NaCl浓度的变化相对平稳。

研究FG和MP间的化学作用力可以对FG在肉制品的应用具有更好的指导作用。随着MP凝胶的形成,MP分子开始变性并有序聚集,形成三维网状结构,而最终体系中蛋白分子的相互作用力会达到一种新的平衡状态[17-18]。其中,蛋白分子间的相互作用力主要包括离子键、氢键、二硫键、疏水相互作用、非二硫共价键等[19]。在凝胶形成的前期,离子键和氢键开始断裂,蛋白变性,疏

水基团和活性巯基开始外露[20]。在热处理过程中,疏水基团和活性巯基逐渐从分子内部暴露,体系产生疏水相互作用,造成肌球蛋白分子聚集[21]。而此时活性巯基发生氧化或—SH/S—S交换反应[22],形成二硫键。与此同时,非二硫共价键也开始形成[23],最终形成凝胶的网络结构。随着NaCl浓度的提高,二硫键和非二硫共价键的含量随之升高(P<0.05),这主要与MP的盐溶性有关。从图1可以看出,MP凝胶中疏水相互作用、二硫键以及非二硫共价键所占的比例较大,而离子键和氢键所占比例较小。这说明形成凝胶体系的关键是二硫键和非二硫共价键的贡献。而离子键与氢键不是维持MP凝胶及FG-MP凝胶稳定构象的主要化学作用力。据报道,这可能是由于在凝胶形成过程中,离子键和氢键参与肌球蛋白分子尾部的缠绕,而不参与头部的聚集[24]

2.2 不同NaCl浓度条件下FG对MP乳液乳析指数的影响

图2 不同NaCl浓度条件下FG对MP乳液3 h(A)和30 d(B)乳析指数的影响
Fig. 2 Effects of different NaCl concentrations in the absence and presence of FG on the creaming index of emulsions with MP at 3 h (A) and 30 d (B)

不同字母表示相同处理组在不同NaCl浓度条件下差异显著(P<0.05);*.相同NaCl浓度条件下组间差异显著(P<0.05)。图3、4同。

乳析指数可以从宏观角度表征乳液的乳化稳定性,乳析指数越低,说明乳化液越稳定。从图2可以看出,MP乳液受NaCl浓度的影响显著(P<0.05),并且随着NaCl浓度的提高,乳析指数显著降低,乳液更加稳定。如图2A所示,NaCl浓度为0、0.4、0.6 mol/L时,乳析指数为56%、18.67%、16.67%。这可能是由于盐离子增大了MP的溶解度,使MP更好地包裹在油滴表面,从而提高了乳化稳定性[25]。贾娜等[26]也报道了相似的现象,研究发现MP-混合食用胶乳液在低盐条件下,随着盐浓度的提高,乳化稳定性也随着增加。值得注意的是,FG-MP乳液不受NaCl浓度的影响,并且在贮存期间没有发生乳析现象(P>0.05),一直保持稳定状态。FG添加到MP乳液后,具有乳化作用的FG包裹在油滴表面或者部分FG包裹在MP膜的表面,使油滴更加稳定。并且据Wang Meng等[27]研究报道,FG还可以增强流动相的黏度,降低油分子的运动,防止其碰撞造成乳液的絮凝。另外,对比图2A、B可以发现,当乳液放置30 d后,MP乳液在0.4 mol/L和0.6 mol/L NaCl条件下乳析指数明显升高,即乳化稳定性明显降低。如0.2 mol/L NaCl条件下,乳液的乳析指数从48%升高至54.7%,而0.4 mol/L NaCl条件下,乳液的乳析指数从18.67%升高至43.7%。这说明高浓度NaCl条件下,MP乳液受贮藏时间影响较大。这可能是由于高浓度NaCl条件下,静电斥力的减小使得乳化颗粒更容易聚集形成大颗粒,从而发生乳析现象。

2.3 不同NaCl浓度条件下FG对MP乳液ζ-电位的影响

图3 不同NaCl浓度条件下FG对MP乳液ζ-电位的影响
Fig. 3 Effects of different NaCl concentrations in the absence and presence of FG on the zeta potential of emulsions with MP

含有10%猪油的乳化液在不同NaCl浓度条件下电位的变化,如图3所示。在实验范围内,所有乳化液都处于负电荷状态。FG-MP乳液比MP乳液电位的绝对值更大,这可能与FG是阴离子多糖有关[28]。而MP乳液的电位值比FG-MP乳液受NaCl浓度的影响更大,这与图1中乳析指数的结果相一致。并且对于MP乳化液,随着NaCl浓度的提高,电位的绝对值逐渐减少(P<0.05),在0.6 mol/L NaCl达到最小值。而对于FG-MP乳液,其电位的绝对值随着NaCl浓度的提高略有升高(P>0.05)。表面电位是用于评价乳化稳定性的重要参数。电位的绝对值越大则说明油滴之间的静电斥力越大,防止油滴聚集成大颗粒,有助于乳化液的稳定性。结果表明,Na+浓度不对FG-MP乳液的稳定性起着重要的作用(P>0.05)。这可能是由于FG包裹在MP表面,使其受NaCl浓度的影响较小。Abdolmaleki等[29]报道了类似的结果,研究发现NaCl浓度对黄蓍胶乳液稳定性没有显著影响。而在MP乳化液中,MP受NaCl浓度影响较大(P<0.05)。据悉,羧基在蛋白质分子外围非常活跃,创造一种阴离子环境[30]。随着盐加入到乳液中,Na+与羧基基团结合,从而导致负电荷减少。

2.4 不同NaCl浓度条件下FG对MP乳液粒径的影响

图4 不同NaCl浓度条件下FG对MP乳液粒径D4,3的影响
Fig. 4 Effects of different NaCl concentrations in the absence and presence of FG on the particle size (D4,3) of emulsions with MP

如图4所示,含有FG的乳液微粒粒径均高于不含FG的乳液微粒粒径。并且含有FG的乳液微粒的粒径随NaCl浓度的增高略有降低,但是变化不显著(P>0.05),可能与多糖受NaCl影响较小有关[29]。而不含FG的MP乳液的粒径受NaCl浓度的影响显著(P<0.05)。随着NaCl浓度的增加,D4,3呈现了先减小后增大的趋势,在0.4 mol/L NaCl条件下,颗粒粒径达到最小值。其趋势与前人研究结果相似[31]。这可能是因为MP的溶解度随着NaCl浓度的提高而增大,使得更多的MP包裹在油滴表面,导致油滴粒径的降低。但是当NaCl浓度提高到一定值,静电斥力的降低使得油滴靠近,从而形成更大的粒径。

2.5 MP乳液及FG-MP乳液的显微观察结果

图5 MP乳液和FG-MP乳液在不同浓度NaCl条件下的微观图
Fig. 5 Light micrographs of emulsions containing MP and FG

A~D.分别为MP乳液在0、0.2、0.4 mol/L及0.6 mol/L NaCl条件下微观图;a~d.分别为FG-MP乳液在0、0.2、0.4 mol/L及0.6 mol/L NaCl条件下微观图。

由图5可以看出,猪脂肪颗粒被分散成球状油滴分散在连续相中,并且颗粒大小与图4结果基本一致。不含FG的MP乳液随着NaCl浓度的增加,颗粒大小呈现了先减小后增大的趋势,在0.4 mol/L NaCl条件下,颗粒粒径达到最小值。含有FG的乳液微粒的粒径随NaCl浓度的增高,变化不明显。并且发现,虽然不含FG的乳液粒径小于含有FG的乳液粒径,但是出现了相互聚集的趋势。这可能与电位有关,静电斥力减少,使得颗粒相互靠近,出现了聚集的现象。

3 结 论

本实验通过凝胶作用力的测定发现维持MP凝胶及FG-MP凝胶稳定构象的关键是二硫键和非二硫共价键的贡献。另外,通过测定乳液的相关指标发现虽然MP乳液随着NaCl浓度的提高,乳化稳定性得到明显提高,但是在高浓度NaCl条件下容易受到贮藏时间的影响。而FG-MP乳液在所有NaCl浓度范围内均没有发生乳析现象,尤其是低浓度NaCl条件下FG-MP乳液的稳定性显著高于MP乳液。相对于对照组,添加FG的MP乳液的电位值和粒径大小受NaCl浓度变化不显著,说明FG可以抵抗NaCl浓度的变化对电位及粒径的影响。显微观察发现FG的加入可以改善MP乳液出现的液滴聚集的现象。这说明添加FG可以显著提高MP乳液的乳化稳定性,并且能够大大提高其抗盐能力。因此,可以在实际生产应用中通过添加FG,改良肉制品品质,减少食盐摄入量,达到促进人体健康的目的,为低盐肉制品的开发提供了一定的理论依据。

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Effect of Flaxseed Gum on the Gelling Forces and Emulsifying Properties of Myofibrillar Protein at Different NaCl Concentrations

FENG Meiqin1, LIU Wenyan2, SUN Jian2,*, XU Xinglian2, ZHOU Guanghong2
(1. College of Animal Science and Technology, Jinling Institute of Technology, Nanjing 210038, China;2. National Center of Meat Quality and Safety Control, College of Food Science and Technology,Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Abstract:To improve the gelling and emulsifying properties of low-salt meat products, this study determined the effect of fl axseed gum (FG) on the stability of emulsions containing myofibrillar protein (MP) and the chemical forces involved in MP gelation. The emulsion stability was evaluated by measuring creaming index, zeta potential value, particle size and microscopic observation. Results showed that the formation of MP gel and FG-MP gel system was attributed to disulfide bonds and non-disulfide covalent bonds. The effects of different NaCl concentrations on creaming index, potential value,and particle size of FG-MP emulsion were not statistically significant (P > 0.05). Creaming index, zeta potential value,and particle size varied significantly with increasing NaCl concentration (P < 0.05). In particular, the addition of fl axseed gum could significantly improve the stability of MP stabilized emulsions at low salinity levels (P < 0.05). Microscopic observation revealed that the addition of FG could reduce the aggregation of MP emulsion droplets. Thus, under low salt conditions, fl axseed gum could significantly improve the stability and salt tolerance of MP stabilized emulsions, which could promote the application of fl axseed gum in meat products.

Keywords:fl axseed gum; myofibrillar protein; chemical force; emulsion stability

FENG Meiqin, LIU Wenyan, SUN Jian, et al. Effect of flaxseed gum on the gelling forces and emulsifying properties of myofibrillar protein at different NaCl concentrations[J]. Food Science, 2018, 39(22): 26-31. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201822005. http://www.spkx.net.cn

引文格式:冯美琴, 刘雯燕, 孙健, 等. 不同NaCl浓度条件下亚麻籽胶对肌原纤维蛋白凝胶作用力及乳化特性的影响[J]. 食品科学,2018, 39(22): 26-31. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201822005. http://www.spkx.net.cn

文章编号:1002-6630(2018)22-0026-06

文献标志码:A

中图分类号:TS251.1

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201822005

*通信作者简介:孙健(1973—),男,副教授,博士,研究方向为畜产品加工与质量控制。E-mail:sunjian01@njau.edu.cn

第一作者简介:冯美琴(1975—),女,副教授,博士,研究方向为食品微生物与生物技术。E-mail:fengmeiqin@jit.edu.cn

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(KYSP201701);金陵科技学院博士基金项目(JIT-B-201301)

基金项目:国家自然科学基金面上项目(31771986);国家自然科学基金青年科学基金项目(31401516);

收稿日期:2018-06-11