表1 AMA和鬼笔毒肽毒素测定的质谱参数
Table 1 Mass spectrometric parameters for analysis of amatoxins and phallotoxins
注：*.定量离子对。
肖绍震1，林 锋2，傅武胜2,3,4,5,*，魏道智1,*
（1.福建农林大学生命科学学院，福建 福州 350002；2.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；3.福建省人兽共患病研究重点实验室，福建省疾病预防控制中心，福建 福州 350001；4.福建医科大学药学院，福建 福州 350108；5.福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002）
摘 要：建立同时检测血浆和尿液中鹅膏毒肽和鬼笔毒肽的超高效液相色谱-串联质谱方法。采用模仿人食用有毒野生菌的模式给药实验豚鼠，毒素经过胃肠道首过效应后，利用该方法检测两类毒素在豚鼠血浆和尿液中代谢规律。对实验豚鼠灌胃给药，α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽、二羟鬼笔毒肽的剂量分别为1.0、0.486、0.079、0.120 mg/kg（以体质量计），并对给药后不同时间点采集的血液样品和2 h后的尿液样品进行鹅膏毒肽和鬼笔毒肽含量的检测。结果表明，所建方法血浆和尿液中鹅膏肽类毒素的检出限分别为1.0 µg/L和0.3 µg/L；在质量浓度为2～100 µg/L范围内进行3 个水平的加标实验，回收率均在76.8%～109.0%之间，相对标准偏差为1.30%～12.00%（n=6）；血浆中α-鹅膏毒肽和β-鹅膏毒肽均在给药2 h后血药质量浓度达到峰值，分别为14.6、7.24 μg/L，在第24小时处于检出限附近或者未检出；所有时间点的血浆均未检出鬼笔毒肽。在给药后第2小时的尿液中检出全部4 种（α-AMA、β-AMA、PHD和PCD）蘑菇毒素，质量浓度在45.9～1 905 µg/L之间。
关键词：鹅膏毒肽；鬼笔毒肽；超高效液相色谱-串联质谱；血浆；尿液
鹅膏毒肽（amatoxins，AMA）和鬼笔毒肽均属于双环多肽类化合物，存在于鹅膏菌属（Amanita）、盔孢伞属（Galerina）、环柄菇属（Lepiota）的一些野生菌中，其半数致死量分别为0.3～0.7、1.5～3.0 mg/kg（以体质量计）[1]，前者毒性明显大于后者。蘑菇食物中毒一直以来是世界上许多国家重点关注的食品安全问题之一，多年来蘑菇中毒也一直是我国食物中毒事故导致死亡的主要原因[2-3]。我国仅在2004—2014年，因毒菇导致的食物中毒就达576起，占食源性中毒起数的12.2%，导致的死亡人数高达全国食物中毒总致死人数的35.6%，致死率平均高达21.2%（786/3 701）。毒菇中毒事故中约90%由于误食含AMA和鬼笔毒肽的野生菌所引起[4]。蘑菇毒素不仅使野生菌产品的质量安全受到一定影响，更严重影响到人类食用野生菌的生命安全。
目前血浆和尿液等生物样品中鹅膏肽类毒素的检测方法主要有毛细管电泳法[5-6]、放射免疫法[7-8]、酶联免疫吸附测定[9-10]、高效液相色谱及其质谱法[11-18]等，其中液相色谱-串联质谱法能实现毒素的高通量精确分析而成为目前最主要的方法[19-20]。已有的方法多用于测定α-AMA和β-AMA 2 种毒素，存在检测通量不够高、假阳性、灵敏度低和基质效应严重等问题[21-23]。大多数方法采用乙腈等有机溶剂进行血浆的前处理，这可能导致某些毒素与血浆蛋白共沉淀，从而导致测定的回收率偏低（低于50%），此外结果的重复性也较差[23]。单一α-AMA纯品在动物体内的代谢变化已经有较多的研究，如对犬、猪、SD大鼠和小鼠等实验动物多采用静脉注射或腹腔注射给药方式[24-28]，但这忽略了毒素经口摄入后对胃肠道的首过效应。目前鲜见采取模仿人类食用野生菌的方式，以含多种毒素的野生毒蘑菇给药豚鼠的报道。采用向豚鼠经口给药可有效地反映出AMA和鬼笔毒肽经胃肠道时的吸收与代谢情况。本研究通过对生物样品中毒素提取和净化条件的研究，明显降低了基质干扰和毒素共沉淀造成回收率低的问题，建立测定生物样品6 种鹅膏肽类毒素的超高效液相色谱-串联质谱方法，并对方法进行系统验证；并通过毒蘑菇提取液经口给药方式，对豚鼠体内4 种AMA和鬼笔毒肽毒素的代谢规律进行研究。
健康豚鼠（普通级）6 只，体质量（275±25）g购自闽侯县吴氏实验动物贸易公司。
羧基三羟鬼笔毒肽（phallisacin，PSC）（纯度99%）、裂皮鹅膏干粉（含α-AMA 4.14 mg/kg、β-AMA 2.01 mg/kg、羧基二羟鬼笔毒肽（phallacidin，PCD）0.327 mg/kg、二羟鬼笔毒肽（phalloidin，PHD）0.496 mg/kg） 福州勤鹏生物科技公司；5 种蘑菇毒素标准品（纯度≥90%） 美国ENZO公司；肝素钠（克拉玛尔） 上海谱振生物科技有限公司；乙腈、甲醇、乙酸铵均为国产色谱纯；实验用水为超纯水。
ACQUITY型超高效液相色谱仪、BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm） 美国Waters公司；API 5000串联四极杆质谱仪 美国AB Sciex公司；AllegraX-15R高速离心机 美国Beckman公司；G-560 E型旋涡混合器 美国Scientific Industries公司；KQ-500B型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；CP 225D电子天平（准确至0.01 mg） 德国Sartorius公司；N-EVAPTM 111型氮吹仪 美国Organomation Associates公司；HLB固相柱（60 mg/3 mL） 福州勤鹏生物科技公司；0.22 μm微孔滤膜（有机系） 北京开源国创科技有限公司。
1.3.1 标准溶液的配制和标准曲线的制备
分别准确称取6 种蘑菇毒素标准品于6 支10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制质量浓度为10.0 mg/L的标准储备液，于-20 ℃避光保存；分别准确移取1.00 mL该标准储备液，用甲醇稀释并配制质量浓度为1.00 mg/L的混合标准使用液；移取适量混合标准使用液，用甲醇配制质量浓度为0.100 mg/L。
移取适量混合标准使用液，小心氮气吹干后，准确移取200 μL经前处理过的空白血浆基质液配制成质量浓度为10.0、40.0、60.0、80.0、100 µg/L的混合基质标准液。准确移取200 μL经前处理过的空白尿液基质液配制成质量浓度为2.00、10.0、15.0、20.0、25.0 µg/L的混合基质标准液。
1.3.2 超高效液相色谱-串联质谱检测
超高效液相色谱条件：B E H C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱温40 ℃；进样体积10 μL；流动相A为5 mmol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈；梯度洗脱程序：0～2.5 min，15% B；2.5～4 min，15%～35% B；4～6 min，35%～99% B；6～8 min，99%～15% B；8.0～8.1 min，99%～15% B；8.1～10 min，15% B。
质谱条件：电喷雾离子源，正离子模式；喷雾电压5 500 V；雾化气压力55 psi（空气）；气帘气压力30 psi（氮气）；碰撞气压力40 psi（氮气）；入口电压10 V；出口电压5 V；离子源温度650 ℃；多反应监测模式，监测离子对及质谱参数见表1。
表1 AMA和鬼笔毒肽毒素测定的质谱参数
Table 1 Mass spectrometric parameters for analysis of amatoxins and phallotoxins
注：*.定量离子对。
1.3.3 裂皮鹅膏提取液的制备
分别准确称取2 份已混匀的裂皮鹅膏干粉0.500 g（精确至0.001 g）至2 个50 mL离心管中，准确加入8 mL超纯水，超声提取15 min，10 000 r/min离心10 min，上清液分别转移至2 个对应的15 mL离心管中。再次加入7 mL超纯水，重复提取。分别合并提取液至对应的15 mL离心管中。合并2 份提取液至50 mL离心管中，涡旋混匀备用。
1.3.4 豚鼠给药与血液样品采样
健康豚鼠6 只，饲养适应3 d后，称质量并编号，给药前禁食16 h，给予自由饮水。裂皮鹅膏提取液以0.650 mL/100 g（以体质量计）灌胃剂量进行经口灌胃给药，准确记录给药时间。给药豚鼠分别于给药后5、15、30 min和1、1.5、2、 4、6、10、24 h等时间点由眼眶静脉采血0.5 mL，立即用含1%肝素钠的离心管收集，3 500 r/min离心15 min，分离血浆，-20 ℃保存备用。
1.3.5 血浆样品中毒素的提取、净化和浓缩
取0.50 mL全血于1.5 mL塑料管中，静置30 min后，3 500 r/min离心15 min。准确移取100 μL上层血浆于另一支1.5 mL塑料管中，加入1 mL超纯水稀释，涡旋提取1 min。将提取液转入事先用2 mL乙腈、水淋洗平衡好的固相萃取柱，依次用2 mL水和1 mL甲醇-水（15∶85，V/V）淋洗柱子，弃去淋洗液；固相萃取柱真空抽干1 min后用2 mL乙腈-甲醇（8∶2，V/V）溶液洗脱，用2 mL塑料离心管收集全部洗脱液。
将洗脱液于40 ℃氮气吹至干后，再准确加入200 μL甲醇-水（3∶7，V/V）溶解并涡旋15 s，然后10 000 r/min离心5 min，移取上清液至200 μL衬管中，备用。
1.3.6 尿液样品中毒素的提取、净化和浓缩
取2 mL尿液于2 mL塑料离心管中，4 ℃、10 000 r/min离心10 min。准确移取1.0 mL上清液于预先平衡好的固相萃取柱（60 mg/3 mL）中，其余步骤依照1.3.4节操作，仅洗脱时改用1 mL乙腈-甲醇（8∶2，V/V）溶液洗脱，再氮吹、浓缩、过0.22 μm微孔滤膜后用得到的溶液供超高效液相色谱-串联质谱测定。
6 种蘑菇毒肽分子中均含有羟基、胺基和羰基等易于电离产生正离子的官能团，因此毒素在正负2 种模式下都可以测定。在甲醇-甲酸溶液流动相体系下，6 种化合物的[M+H]+母离子信号响应均高于[M+Na]+母离子。但在血浆和尿液基质加标溶液测定中发现，甲醇-甲酸溶液作为流动相时，存在基质干扰，且色谱峰分离度不佳。研究发现改用乙腈-5 mmol/L乙酸铵溶液后，基质干扰减弱，且6 种毒素分离度符合要求，且峰形较好。反向色谱柱常用来分析非挥发性污染物和天然存在的极性化合物（如亲水的多肽和季铵盐）。由于α-AMA（m/z 919.5＞86.0）和β-AMA（m/z 920.5＞86.0）碳含量较高及分子质量仅相差1 Da，α-AMA含有42%～43%的13C同位素，因此这2 种AMA必须要在总离子流色谱图上分开，以避免对定量时造成影响[23]。比较Waters公司同一尺寸规格（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），仅填料不同的3 支色谱柱RP18、BEH C18、BEH C8对目标物的分离效果。3 种色谱柱均可分离6 种目标物，在总离子流色谱图上实现了完全分离。但BEH C18柱分离尿液中PHD毒素与杂质的能力优于其他色谱柱，且目标毒素响应较高，峰形对称尖锐，因此选择BEH C18柱用于后续的研究，如图1所示。
图1 加标基质中6 种蘑菇毒素、给药豚鼠血浆和尿液样品中蘑菇毒素的总离子流色谱图
Fig. 1 Total ion current chromatograms of mushroom toxins spiked in guinea pig plasma and urine (A and B) and mushroom toxins in plasma and urine of orally administered guinea pigs (C and D)
A.加标基质血浆；B.加标基质尿液；C.给药豚鼠血浆；D.给药豚鼠尿液；1. β-AMA；2. α-AMA；3. PSC；4. γ-AMA；5. PCD；6. PHD。
图2 4 种提取溶剂对血浆中毒素提取率的影响
Fig. 2 Effect of four extraction solvents on the extraction efficiency of toxins from plasma
鹅膏肽类毒素易溶于水，且不与血浆蛋白结合，毒素主要分布在血浆中。为此分别考察水、磷酸-水（4∶96，V/V）、乙腈和甲醇4 种溶剂对毒素的提取效果。如图2所示，本实验利用超纯水稀释、提取，6 种毒素的平均回收率均在87.0%～110.8%之间。实验发现采用相关文献[29-30]的有机溶剂（乙腈或甲醇）沉淀法时，血浆中的纤维蛋白也会被沉淀，这可能导致部分鹅膏肽类毒素被纤维蛋白所包裹，形成共沉淀物，从而导致β-AMA、γ-AMA、PCD和PSC回收率略低，4 种毒素的平均回收率均在62.4%～79.3%之间。参考文献[23]用磷酸-水（4∶96，V/V）稀释提取时，水溶液酸性较大（pH 0.94），可能导致部分β-AMA和PSC在固相萃取净化过程中不被保留或无法被洗脱，因此毒素回收率较低，β-AMA回收率甚至低于20%。
图3 洗脱体积对加标样品中6 种毒素回收率的影响
Fig. 3 Effect of elution volume on the recovery of six toxins from spiked samples
A.血浆；B.尿液。
由于血浆基质中富含血浆蛋白，因此血浆样品经超纯水稀释提取或者有机溶剂提取后需要经过固相萃取净化，可减轻基质效应和保护色谱柱及质谱作用。因此考察HLB柱净化时淋洗体积和洗脱体积对毒素回收率及峰形的影响，结果见图3。当采用2 mL超纯水和1 mL甲醇-水（15∶85，V/V）淋洗时，在血浆基质中，对比2、3、4 mL的洗脱体积，发现洗脱液为2 mL时，洗脱效果最佳。6 种毒素平均回收率均在86.1%～98.1%之间。在尿液基质中，对比1、2、3 mL的洗脱体积，发现洗脱液为1 mL时，洗脱效果最佳。毒素平均回收率均在93.0%～116.3%之间，峰形较好，无基质干扰。可能是洗脱液体积增加后导致杂质被更多从HLB固相萃取柱上洗脱出来，导致基质抑制效应增加，回收率有所下降。
图4 血浆和尿液基质中6 种毒素的基质效应考察
Fig. 4 Matrix effects of six toxins in plasma and urine matrices
选取HLB柱净化后的血浆和尿液提取液作为空白基质，与6 种毒素进行混合、测定，并与直接用溶剂稀释的毒素响应进行比较。如图4所示，几乎没有抑制作用，或者极低，虽然由于基体成分的影响使得检出限升高数倍，但是6 种毒素经本方法净化后测定在血浆基质中平均基质效应在86.3%～105.1%之间，在尿液血浆基质中平均基质效应在90.9%～102.0%之间（基质效应评价采用100×（基质中目标物峰面积/纯溶剂中目标峰面积）；比值大于100%表示基质增强效应，比值小于100%表示基质抑制效应）充分说明本方法净化效果很好，保证了灵敏度和降低了污染。Helfer等[31]采用在线提取方式和涡流色谱模式测定尿液中β-AMA基质抑制效应高达40%。对于血浆和尿液基质加标后不进行固相萃取净化处理，结果发现，2 种基质条件下的目标物色谱峰峰形很差，色谱峰出现分叉现象，尿液基质中的PHD毒素存在空白基质干扰问题。同时，目标物的检出限上升为固相萃取处理的3～8 倍。同时在样品测定中发现，不同志愿者的血浆样或尿样经相同的净化后，对同一毒素产生的基质效应基本相同。
2.5.1 检出限测定结果
在优化实验条件下，分别以不小于3 倍及10 倍信噪比确定方法的检出限和定量限。取0.1 mL血浆，按照优化后的条件测定，如表2所示。血浆中6 种鹅膏肽类毒素的检出限和定量限分别为1.0 µg/L和3.0 µg/L。取1.0 mL尿液用于测定时，鹅膏肽类毒素的检出限和定量限分别为0.3 µg/L和1.0 µg/L。方法的检出限与文献[21]基本一致，能充分满足血浆、尿液等中毒样品毒素含量较低的检测要求。
表2 血浆和尿液中6 种鹅膏肽毒素的检出限、定量限、线性范围和精密度结果
Table 2 LODs, LOQs, linear ranges and precision (RSD) for toxins in plasma and urine extracts
2.5.2 线性范围测定结果
如表2所示，采用基质匹配法制备标准曲线，血浆基质中毒素含量在10～100 µg/L范围内，其线性关系良好，6 种毒素的相关系数在0.993 5～0.999 1之间。尿液基质中毒素含量在2～25 µg/L范围时线性关系也良好，相关系数大于0.99。
2.5.3 准确度和精密度测定结果
表3 血浆中蘑菇毒素的加标回收率和相对标准偏差（n= 6）
Table 3 Recoveries and RSDs of mushroom toxins spiked in plasma (n= 6)
表4 尿液中毒素的加标回收率和相对标准偏差（n=6）
Table 4 Recoveries and RSDs of mushroom toxins spiked in urine (n= 6)
用健康志愿者的血浆和尿液作为空白基质，分别添加3 个水平的6 种鹅膏肽类毒素标准液，每个水平平行实验6 次，按照所建立的方法前处理、测定，并计算加标回收率和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），同时进行日间精密度和日内精密度的测定，结果见表3、4。血浆中6 种鹅膏肽类毒素进行10、40、80 µg/L加标时，加标回收率在76.8%～106.0%之间，RSD为1.30%～12.00%；尿样中6 种鹅膏肽类毒素加标质量浓度为2、10、25 µg/L时，加标回收率在89.8%～109.0%之间，RSD为1.94%～10.40%。日间精密度和日内精密度的RSD均小于10%（表2）。本实验加标质量浓度仅是文献[10]方法所用加标质量浓度（1～80 mg/L）的1/1 000，RSD也比该文献报道（1%～22%）更理想。说明样品应经过HLB柱净化，明显降低基质干扰。
图5 豚鼠血浆中AMA质量浓度-时间曲线图（n=6）
Fig. 5 Concentration versus time curves for amatoxins in guinea pig plasma (n = 6)
用上述方法对给药豚鼠的血浆样品进行前处理并上机检测，外标法定量，所有给药豚鼠的血浆样品中α-AMA所有血浆质量浓度范围在小于检出限到14.6 μg/L之间，β-AMA质量浓度范围在小于检出限到7.24 μg/L之间，鬼笔毒肽未被检出。从图5可以看出，α-AMA和β-AMA均在给药2 h后血药质量浓度达到峰值。α-AMA血药质量浓度和β-AMA血药质量浓度峰值分别为14.6、7.24 μg/L。研究发现毒素在第2～4小时之间下降趋势明显，4 h时α-AMA和β-AMA的质量浓度分别为4.49、1.97 μg/L。此后下降趋势平缓，第24小时α-AMA含量开始下降至检出限附近，β-AMA则未检出，这说明α-AMA和β-AMA在血浆内含量很低且代谢消除迅速。2 h时的尿液中检出了给药时的全部4 种毒素，α-AMA、β-AMA、PHD和PCD质量浓度分别为1 905、627、60.9 μg/L和45.9 μg/L，检测结论与文献[6]报道一致，即动物体内对AMA的吸收率较低，而鬼笔毒肽基本不被吸收。
本实验利用超高效液相色谱-串联质谱建立血浆和尿液中6 种鹅膏肽类毒素的检测方法。采用样品稀释后再提取、固相萃取净化，降低了基质抑制效应，同时避免了有机溶剂提取造成回收率低的问题。血浆基质中毒素线性范围含量在10～100 µg/L之间，检出限和定量限分别为1.0 µg/L和3.0 µg/L；尿液基质中毒素线性范围含量在2～25 µg/L之间，检出限和定量限分别为0.3、1.0 μg/L，回收率均在76.8%～109.0%之间，RSD为1.30%～12.00%（n=6），满足生物样品定量的相关要求。
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Determination of Amatoxins and Phallotoxins in Plasma and Urine by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
XIAO Shaozhen1, LIN Feng2, FU Wusheng2,3,4,5,*, WEI Daozhi1,*
(1. College of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China;2. College of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China;3. Fujian Provincial Key Laboratory of Zoonosis Research, Fujian Center for Disease Control and Prevention, Fuzhou 350001, China;4. College of Pharmacy, Fujian Medical University, Fuzhou 350108, China;5. College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)
Abstract:An ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method was successfully developed for the simultaneous determination of amatoxins (AMA) and phallotoxins in plasma and urine.Guinea pigs were orally administered with α-AMA, β-AMA, phallacidin (PCD) and phalloidin (PHD) at single doses of 1.0, 0.486, 0.079 and 0.120 mg/kg·bw respectively. Plasma and urine samples at different time points were collected and analyzed by the developed method to study the metabolism patterns of these toxins in laboratory animals. The results showed that the limits of detection (LODs) were 0.3 and 1.0 μg/L for urine and plasma, respectively. The average recoveries at three spiked levels of 2-100 μg/L varied from 76.8% to 109.0% with relative standard deviations (RSDs) of 1.30%-12.00% (n =6). α-Amanitin and β-amanitin rapidly reached the maximum levels of 14.6 and 7.24 μg/L in plasma, respectively at 2 h after administration. At 24 h, the amanitins were near the LODs or were undetectable. However, the phallotoxins were below the LODs in plasma at all time points investigated. All four toxins were detected at concentrations of 45.9-1 905 μg/L in urine at 2 h after administration.
Keywords:amatoxin; phallotoxin; ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; plasma; urine
XIAO Shaozhen, LIN Feng, FU Wusheng, et al. Determination of amatoxins and phallotoxins in plasma and urine by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Food Science, 2018, 39(22): 312-318. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201822047. http://www.spkx.net.cn
引文格式：肖绍震, 林锋, 傅武胜, 等. 血浆和尿液中6 种鹅膏毒肽和鬼笔毒肽的超高效液相色谱-串联质谱法测定[J]. 食品科学,2018, 39(22): 312-318. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201822047. http://www.spkx.net.cn
文章编号：1002-6630（2018）22-0312-07
文献标志码：A
中图分类号：TS201.6
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201822047
魏道智（1960—），男，教授，博士，研究方向为药用植物资源与资源化学。E-mail：weidz888@sohu.com
傅武胜（1971—），男，主任技师，博士，研究方向为污染物化学与风险评估。E-mail：fwsfqm@126.com
*通信作者简介：
第一作者简介：肖绍震（1991—），男，硕士研究生，研究方向为植物生物化学与分子生物学。E-mail：854809625@qq.com
基金项目：福建省科技计划项目（2018Y0007）
收稿日期：2018-02-11