鸡蛋膜荧光传感器光谱信息表征及三聚氰胺检测方法的构建

张 沛,李 莹,王增利,王世平*

(中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083)

摘 要:为了实现奶制品中三聚氰胺的快速准确检测,基于溶液中三聚氰胺能使荧光素的荧光强度在一定浓度范围内线性增强的特点,利用天然食品分析物鸡蛋膜作为生物膜基质,建立一种固定荧光素到鸡蛋膜上的生物传感器并用于三聚氰胺检测的方法,优化传感器体系中的荧光素浓度及戊二醛质量分数。该鸡蛋膜传感器的线性工作范围为1~500 µg/L,检出限为0.47 µg/L。相比溶液中三聚氰胺的检测方法鸡蛋膜固相传感器检测方法特异性强,稳定性好,具有更高的选择性和低检出限。该种鸡蛋膜荧光传感器能成功应用于市售奶制品中三聚氰胺的检测。

关键词:鸡蛋膜;荧光素;三聚氰胺;传感器

三聚氰胺(1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺)是一种三嗪类含氮杂环有机化合物,其改性树脂被广泛应用于化工行业。但因其含氮量高曾被不法分子添加到食品、婴儿奶粉中人为改造粗蛋白含量[1],三聚氰胺的过量摄入可能造成膀胱和肾结石,严重威胁人类健康[2-3]。目前,三聚氰胺的检测方法主要有:高效液相色谱法[4-5]、液相色谱-质谱法[6-7]、气相色谱-质谱法[8]和毛细管电泳法[9]等,但上述检测方法存在仪器大型且昂贵、操作繁琐、耗时等缺点不适合常规检测。电化学法[10]、表面增强拉曼光谱法[11]、近红外光谱法[12]等近年来用于检测三聚氰胺的方法也具有复杂的化学合成过程,低灵敏度等缺点,因此如何开发一种快速、灵敏的检测方法备受关注。

鸡蛋膜是指位于蛋壳和蛋清之间的具有三维网状结构的双层蛋白膜,其纤维表面具有—NH2、—OH、—CHO、—SH等活性基团[13],比表面积大,为许多能和蛋白质形成价键或分子间力结合的物质提供丰富的活性位点,是一种良好的天然生物膜材料[14]。Choi等[15]最早利用酶固定化的鸡蛋膜,构建了检测硫代葡萄糖苷的荧光传感器。Liu Wenyuan等[16]利用鸡蛋膜合成铂纳米颗粒实现人血浆中葡萄糖的准确测定。但当前鸡蛋膜生物传感材料的研究主要集中于将酶和抗体等生物大分子进行固定[17],而对氨基酸、荧光团等生物小分子的研究较少。

基于溶液中三聚氰胺与荧光素的相互作用,本研究选择具有刚性平面结构的荧光素作为荧光探针,构建以鸡蛋膜为基底的荧光传感器,通过荧光强度线性变化测定三聚氰胺的含量,并对其进行定性结构分析和定量方法学考察,进一步应用于市售奶制品中三聚氰胺的检测,以期构建准确、实用的三聚氰胺荧光传感器快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡蛋(产地辽宁省朝阳市,产蛋鸡为鸡龄9个月的褐壳蛋鸡)、伊利纯牛奶、三元酸牛奶、蒙牛营养奶粉北京市购。

三聚氰胺标准品、荧光素(均为分析纯) 北京百灵威科技有限公司;NaOH、乙腈、正己烷、25%戊二醛等均为分析纯,实验用水取自Milli Q超纯水。

1.2 仪器与设备

F-7000荧光分光光度计 日本Hitachi公司;JSM-6360扫描电子显微镜 日本JEOL公司;Spectrum100红外光谱仪 美国Perkin Elmer公司;SHA-B恒温水浴摇床 北京恺欣世纪科技发展有限公司;DH-101电热鼓风干燥箱 金坛市荣华仪器制造有限公司;TGL18M台式高速冷冻离心机 盐城市凯特实验仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鸡蛋膜传感器材料的制作和保存

将鸡蛋破碎,取蛋壳并手工剥离鸡蛋膜,用4 ℃的超纯水反复清洗干净后将其裁剪成1 cm×1 cm的鸡蛋膜片,洗净后置于4 ℃的超纯水中浸泡保存。

1.3.2 溶液中荧光素与三聚氰胺作用体系荧光强度的确证

将1.0×10-4mol/L荧光素乙醇溶液与用0.1 mol/L的HCl/NaOH调节pH 7.0的缓冲液等体积混合后,基于三维荧光谱图测定其在Ex/Em为505 nm/525 nm处的荧光峰强度。随后,向该溶液中分别加入等体积不同质量浓度(1、10、20、50、100、500 ng/mL)三聚氰胺标准溶液,振荡、静置10 min后在同样条件下记录荧光图谱,通过比较加入前后的荧光强度,确证荧光增强作用的发生。

1.3.3 鸡蛋膜荧光传感法测定三聚氰胺体系的构建

1.3.3.1 荧光素的固定流程:

将鸡蛋膜取出后,浸泡在质量分数为10%的pH 7.0的戊二醛溶液中,磁力搅拌2 h后取出并清洗,然后将鸡蛋膜浸入等体积1.0×10-4mol/L的荧光素乙醇溶液、pH 7.0的缓冲液中,在25 ℃的恒温水浴摇床中振荡1 h后取出,冲洗干净后于烘箱中干燥,置于避光处备用。

1.3.3.2 固定化反应的扫描电子显微镜及红外光谱表征

分别准备固定化反应前后的1 cm×1 cm的鸡蛋膜片,自然晾干,将样品镀金后于JSM-6360扫描电子显微镜在8 kV加速电压下,放大倍数5 000采集样品图像并对其微观结构进行比较,确证固定化反应的发生。

分别将固定化反应前后的鸡蛋膜晾干,称取少量剪碎的样品与200 mg干燥KBr混合研磨,压片后置于红外光谱仪中进行全扫描,收集光谱图并从基团和价键方面进行分析。

1.3.4 鸡蛋膜荧光传感器测定三聚氰胺标准曲线的绘制

在优化的实验条件下,按照1.3.3.1节的方法制作荧光传感器,并分别将1、5、10、20、50、100、200、300、400、500 µg/L的三聚氰胺溶液10 µL均匀的涂于鸡蛋膜片的表面,反应10 min,测定各传感器反应前后在Ex/Em为505 nm/525 nm处的荧光峰值。计算荧光差值ΔF,结果取6 次测量的平均值,并绘制反应前后ΔF对三聚氰胺标准溶液质量浓度的曲线。

式中:F0、F分别为三聚氰胺加入前、后的荧光强度。

1.3.5 鸡蛋膜荧光传感器用于市售奶制品中三聚氰胺的测定

选取市售3 种奶制品并对其进行处理,分别移取1 mL牛奶样品于离心管中,加入5 mL HCl酸化的乙腈(pH 2.0),超声10 min,使蛋白质沉淀,以 8 000 r/min离心10 min,转移合并上清液,向上清液中加入20 mL正己烷,振荡、静置、弃上层,将下层清液减压蒸干、水溶,用0.45 µm微孔滤膜过滤得清液。取处理后的样品10 µL均匀的涂于鸡蛋膜片的表面,室温避光反应10 min,测定各传感器反应前后在Ex/Em为505 nm/525 nm处的荧光峰值并确定三聚氰胺含量。

2 结果与分析

2.1 溶液中荧光素与三聚氰胺荧光强度变化体系的分析

图1 荧光素在不同质量浓度三聚氰胺下的荧光光谱图
Fig. 1 Fluorescence emission spectra of fl uorescein with the addition of different concentrations of melamine

如图1所示,荧光素在Ex/Em为505 nm/525 nm处的荧光峰值在加入三聚氰胺溶液后明显增强,这可能是因为荧光素与三聚氰胺发生反应,氨基上的n电子激发转移到杂环上而产生激发态,氨基上的n电子的电子云几乎与荧光素芳环上的π轨道平行,共享了共轭π电子结构,同时扩大其共轭双键体系,从而增强荧光素的荧光强度。

通过溶液反应发现,在一定范围内,随着三聚氰胺质量浓度的升高,荧光强度不断增大,通过荧光差值的计算,可以实现对三聚氰胺的定量检测。溶液中两者作用体系的确立,为构建三聚氰胺的鸡蛋膜荧光传感系统提供建立基础。

2.2 鸡蛋膜传感器制备条件的优化研究

2.2.1 荧光素固定量的优化

将不同浓度的荧光素分别固定在鸡蛋膜上,各处理在Ex/Em为505 nm/525 nm处的荧光峰值变化如图2所示,随着荧光素浓度的升高荧光峰值逐渐增强,在1.0×10-4mol/L以上,荧光强度稳定或略有下降,这可能是因为鸡蛋膜上的活性位点在此浓度下基本达到饱和[18],导致荧光强度不再继续上升。荧光素浓度过高时,部分未被激发的基态分子能与激发态分子形成不发荧光的二聚物,且该二聚物能够吸收部分激发光,从而产生荧光内滤效应使荧光强度下降,因此导致过高的荧光素浓度对应低的荧光强度。故选取1.0×10-4mol/L荧光素进行固定化反应。

图2 荧光素浓度对传感器荧光峰值的影响
Fig. 2 Effect of fl uorescein concentration on the peak of the fl uorescence sensor

2.2.2 pH值的优化

图3 pH值对传感器荧光峰值的影响
Fig. 3 Effect of pH on the peak of the fl uorescence sensor

如图3所示,在HCl-NaOH缓冲液中,随着pH值的升高,荧光强度逐渐降低,pH 7时荧光强度最大。荧光素的荧光量子产率对酸极其敏感,在近中性和碱性介质中发强荧光[19-20],三聚氰胺在强酸条件下易失去氨基转化成三聚氰酸[21],对于生化检验的样品而言,酸性过强或碱性过强都会导致样品变性,因此选择pH 7的HCl-NaOH缓冲液最为合适。

2.2.3 戊二醛质量分数的优化

图4 戊二醛质量分数对传感器荧光峰值的影响
Fig. 4 Effect of glutaraldehyde concentration on the peak of the fl uorescence sensor

如图4所示,随着戊二醛质量分数的升高,荧光强度先急剧上升,在质量分数为10%时达到最大,之后随着戊二醛质量分数的升高荧光强度略有下降。戊二醛具有一定的毒性,质量分数过高容易造成生物分子的失活[22],质量分数过低时不能保证荧光素在鸡蛋膜上的固定量,因此选取质量分数为10%的戊二醛作为交联剂。

2.3 固定化反应的定性表征及分析

2.3.1 扫描电子显微镜表征及分析

图5 传感器交联化反应前(a)、后(b)的扫描电子显微镜图像
Fig. 5 SEM images of biosensor before (a) and after (b)cross-linking reaction

如图5所示,交联前的鸡蛋膜清晰可见层层交错的纤维网状结构[23],而交联后,鸡蛋膜表面纤维状结构则被戊二醛完全覆盖,图像对比直观证明了交联剂戊二醛将鸡蛋膜表面改造成为稳定、均匀的传感器膜,充分发挥鸡蛋膜作为反应基底的作用,使传感器在荧光测定中充分显示荧光素的性质。戊二醛还可作为保水剂,将水分锁定在膜片表面[24],使其重复性得到保障。

2.3.2 红外光谱表征及分析

图6 鸡蛋膜(a)、戊二醛交联鸡蛋膜(b)、固定化荧光素的鸡蛋膜(c)的红外光谱图
Fig. 6 FTIR spectra of eggshell membrane (a), glutaraldehyde crosslinked eggshell membrane (b), and fl uorescein-immobilized
glutaraldehyde crosslinked eggshell membrane (c)

对空白鸡蛋膜、戊二醛处理后的鸡蛋膜和固定荧光素的鸡蛋膜分别利用红外光谱进行分析,结果如图6所示。从图6a可以看出,空白鸡蛋膜的红外谱图主要有3 个特征吸收峰,分别为3 317 cm-1处的—O—H和N—H伸缩振动;3 069、2 935 cm-1和2 877 cm-1处的C—H基团的不对称伸缩振动;1 643 cm-1处的C=O伸缩振动,位于酰胺I 区;1 524 cm-1和1 235 cm-1处的C—N伸缩振动和N—H弯曲振动,分别位于酰胺II、III区;1 448、1 082 cm-1和620 cm-1处的C=C、C—O和C—S伸缩振动。与空白鸡蛋膜的特征吸收峰值相比,图6b的戊二醛交联后的鸡蛋膜在酰胺I、II和III区的峰位置分别蓝移了7、8 cm-1和2 cm-1,表明鸡蛋膜蛋白的氨基与戊二醛的醛基结合使氢键减弱[25-26]。固定荧光素后,红外谱图6c中出现1 158 cm-1和1 121 cm-1两个特征吸收峰,由C—O—C伸缩振动产生,表明荧光素的—OH与戊二醛的—CHO相交联。综上所述,红外光谱分析从化学结构上证明已成功利用戊二醛将荧光素固定到鸡蛋膜上。

2.4 鸡蛋膜荧光传感器检测三聚氰胺的方法学评价

2.4.1 标准曲线的绘制及分析

用鸡蛋膜荧光传感器测定不同质量浓度(1、5、10、20、50、100、200、300、400、500 µg/L)的三聚氰胺溶液的荧光差值Δ F(结果取6 次测量的平均值)与三聚氰胺质量浓度的线性拟合曲线。拟合曲线中有两个线性良好的质量浓度范围段,分别为1~100 µg/L三聚氰胺,拟合公式为:ΔF=1.792C+22.38(R2=0.996 8),100~500 µg/L三聚氰胺,拟合公式为:Δ F=0.8 2 3 C+11 2.7(R2=0.998 2),其中C为三聚氰胺的质量浓度。

参照IUPAC[27]所规定的公式(CDL=3Sb/a,其中3为置信水平,a为校正曲线斜率,Sb为空白样品平行检测10 次的标准偏差)得此鸡蛋膜荧光传感器的检出限为0.47 µg/L,对10、500 µg/L三聚氰胺标准溶液进行重复性实验,测得其相对标准偏差分别为0.28%和 1.05%,结果表明以鸡蛋膜为固相基质的三聚氰胺荧光传感器测定重复性良好,结果稳定可信。

2.4.2 共存物质对鸡蛋膜荧光传感器测定三聚氰胺的干扰实验

表1 共存物质的影响
Table 1 Inf l uence of coexisting substances

当三聚氰胺质量浓度为0.1 mg/L时,分别将10 µL奶制品中常见物质的最大允许倍数质量浓度的溶液(表1)均匀涂抹到鸡蛋膜片后进行检测,并计算测定共存物质的传感器在Ex/Em为505 nm/525 nm处的荧光差值ΔF与检测三聚氰胺得到的ΔF之间的相对误差,控制相对误差在±5%范围内。从表1可以看出,常见的阴离子(Cl-、PO43-、SO42-)和常见的碱金属离子、碱土金属离子(Na+、K+、Ca2+、Mg2+)几乎不会对三聚氰胺检测产生任何干扰。荧光氨基酸(色氨酸[28]、苯丙氨酸)、赖氨酸以及奶制品中的主要营养成分也不会对检测产生干扰,葡萄糖、乳糖等可能通过静电作用或分子间作用力与荧光素作用从而影响荧光强度,但实际样品中的两者含量远小于该最大允许倍数,且可通过适当预处理:如加入葡萄糖苷酶或乳糖酶等消除干扰[29-30]。综上所述说明该鸡蛋膜荧光传感器对三聚氰胺的检测具有较高的选择性,能够实现对常见奶制品中三聚氰胺的定量检测。

2.4.3 实际样品的检测效果验证以及加标回收分析

按照1.3.5节的方法处理样品,在优化的实验条件下用该传感器对3 种奶制品进行检测,结果均未检出三聚氰胺。如表2所示,分别向3 种样品中添加10 µg/L的三聚氰胺后做加标回收实验,结果表明各样品加标回收率均能控制在(100±5)%以内,说明此传感器能够对三聚氰胺进行有效测定。又由于鸡蛋膜荧光传感器具有特异性强、准确度高、操作简单、测量迅速、成本低廉等优点,因此经过适当的改造后该传感器可以在快速检测领域有更广泛的应用前景。

表2 鸡蛋膜传感器测定奶制品中三聚氰胺的加标回收率
Table 2 Recovery of melamine in spiked milk products by eggshell membrane biosensor

3 结 论

本实验构建了一种以鸡蛋膜为生物基底,固定上已用0.1 mol/L的HCl/NaOH溶液调节pH 7.0的质量分数为10%的戊二醛溶液,然后选择1.0×10-4mol/L荧光素作为荧光探针的固体荧光传感器,在最佳优化条件下,发现三聚氰胺的定量检测有两个线性良好的质量浓度范围段,分别为1~100 µg/L和100~500 µg/L,检出限可低至0.47 µg/L。共存物质的干扰实验中发现,奶制品中的常见物质几乎不会对检测产生任何干扰。此外将该鸡蛋膜传感器应用于市售奶制品中三聚氰胺的检测,均未检出三聚氰胺,加标结果显示回收率均能控制在(100±5)%以内,说明该方法能实现对三聚氰胺的快速、准确测定,方法对三聚氰胺的检测具有较高的选择性、特异性强、干扰小,该固相传感器的重复性良好。本研究利用廉价且易得的鸡蛋膜材料构建一种特异性检测三聚氰胺的传感器,为三聚氰胺的快速检测提供更广阔的思路,因鸡蛋膜表面丰富的活性基团及纤维网状结构,在鸡蛋膜的修饰改造并扩展其应用方面还需进一步深入研究。

参考文献:

[1] 唐晓纯, 李笑曼, 张冰妍. 关于食品欺诈的国内外比较研究进展[J]. 食品科学, 2015, 36(15): 221-227. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201515041.

[2] SERDIU T, SKRYSHEVSKY V A, PHANER-GOUTORBE M, et al.Monitoring of melamine contamination in fat watery milk by the photoluminescence analysis[J]. Talanta, 2010, 82(4): 1543-1547.DOI:10.1016/j.talanta.2010.07.046.

[3] 王世忠, 陆荣柱, 高坚瑞, 等. 三聚氰胺的毒性研究概况[J]. 国外医学: 卫生学分册, 2009(1): 14-18.

[4] GAO LH, JONSSON J Å. Determination of melamine in fresh milk with hollow fiber liquid phase microextraction based on ion-pair mechanism combined with high performance liquid chromatography[J]. Analytical Letters, 2012, 45(16): 2310-2323. DOI:10.1080/00032719.2012.688084.

[5] ZHONG Y B, ZHANG L J, ZHANG H C, et al. Immunoaffinity-based solid phase extraction for the determination of melamine in animalderived foods followed by LC[J]. Chromatographia, 2012, 73(11/12):1211-1215. DOI:10.1007/s10337-011-2012-8.

[6] 李爱军, 张代辉, 马书民, 等. 液相色谱-串联质谱法测定饲料中三聚氰胺残留[J]. 分析化学, 2008, 36(5): 699-701. DOI:10.3321/j.issn:0253-3820.2008.05.028.

[7] BRAEKEVELT E, LAU B P Y, FENG S, et al. Determination of melamine, ammeline, ammelide and cyanuric acid in infant formula purchased in Canada by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Food Additives, 2011, 28(6): 698-704. DOI:10.1080/00032719.2012.688084.

[8] 卢业举, 舒勇, 赵成仕. 气相色谱-串联质谱法测定食品中的三聚氰胺[J]. 色谱, 2008, 26(6): 749-751. DOI:10.3321/j.issn:1000-8713.2008.06.020.

[9] LIU J X, ZHONG Y B, LIU J, et al. An enzyme linked immunosorbent assay for the determination of cyromazine and melamine residues in animal muscle tissues[J]. Food Control, 2010, 21(11): 1482-1487.DOI:10.1016/j.foodcont.2010.04.018.

[10] ZHU H, ZHANG SX, LI M X, et al. Electrochemical sensor for melamine based on its copper complex[J]. Chemical Communications,2010, 46(13): 2259-2261. DOI:10.1039/b924355k.

[11] CHENG Y, DONG Y. Screening melamine contaminant in eggs with portable surface-enhanced Raman spectroscopy based on gold nanosubstrate[J]. Food Control, 2011, 22(5): 685-689. DOI:10.1016/j.foodcont.2010.09.020.

[12] BALABIN R M, SMIRNOV S V. Melamine detection by midand near-infrared (MIR/NIR) spectroscopy: a quick and sensitive method for dairy products analysis including liquid milk, infant formula,and milk powder[J]. Talanta, 2011, 85(1): 562-568. DOI:10.1016/j.talanta.2011.04.026.

[13] 白云霏. 鸡蛋膜与主要有害污染物质作用机制构建研究[D]. 北京:中国农业大学, 2014: 17-19.

[14] BALÁŽ M. Eggshell membrane biomaterial as a platform for applications in materials science[J]. Acta Biomaterialia, 2014, 10(9):3827-3843. DOI:10.1016/j.actbio.2014.03.020.

[15] CHOI M M F, PANG W H, XIAO D, et al. An optical gluecose biosensor with eggshell membrane as an enzyme immobilization platform[J]. Analyst, 2001, 126(9): 1558-1563. DOI:10.1039/b103205b.

[16] LIU W, WU H, LI B, et al. Immobilization of platinum nanoparticles and glucose oxidase on eggshell membrane for glucose detection[J].Analytical Methods, 2013, 5(19): 5154-5160. DOI:10.1039/c3ay40327k.

[17] LI B X, LAN D, ZHANG X J. Chemiluminescence flowthrough biosensor for glucose with eggshell membrane as enzyme immobilization platform[J]. Analytical Biochemistry, 2008, 374: 64-70. DOI:10.1016/j.ab.2007.10.036.

[18] SHAO C Y, YUAN B, WANG H Q, et al. Eggshell membrane as a multimodal solid state platform for generating fluorescent metal nanoclusters[J]. Journal of Materials Chemistry, 2011, 21: 2863-2866.DOI:10.1039/c0jm04071a.

[19] 葛凤燕, 闫喜龙, 潘惠英, 等. 荧光素类探针在生物分析中的研究进展[J]. 分析化学评述与进展, 2005, 33(8): 1199-1204. DOI:10.3321/j.issn:0253-3820.2005.08.038.

[20] 程定玺, 黄世江, 梁宇, 等. 荧光探针法快速测定牛奶中三聚氰胺[J].分析实验室, 2013, 32(1): 48-51. DOI:10.13595/j.cnki.issn1000-0720.2013.0013.

[21] LI L, LI B X, CHENG D, et al. Visual detection of melamine in raw milk using gold nanoparticles as colorimetric probe[J]. Food Chemistry,2010, 122(3): 895-900. DOI:10.1016/j.foodchem.2010.03.032.

[22] 牟星, 彭鹏, 孙琪, 等. 甲醇、戊二醛交联剂对丝素蛋白/明胶多孔支架的性能影响[J]. 功能材料, 2015, 46(3): 3023-3027.

[23] PAN X, LIU J, ZHANG D. Binding of phenanthrene to extracellular polymeric substances (EPS) from aerobic activated sludge: a fl uorescence study[J]. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2010,80(1): 103-106. DOI:10.1016/j.colsurfb.2010.05.002.

[24] CARRALERO S V, MENA M L, GONZALEZ-CORTES A, et al.Development of a tyrosinase biosensor based on gold nanoparticlesmodified glassy carbon electrode: application to the measurement of a bioelectrochemical polyphenols index in wines[J]. Analytica Chimica Acta, 2005, 5289(1): 1-8. DOI:10.1016/j.aca.2004.10.007.

[25] TIAN Z, WU K, LIU W, et al. Two-dimensional infrared spectroscopic study on the thermally induced structural changes of glutaraldehydecrosslinked collagen[J]. Spectrochimica Acta Part A Molecular &Biomolecular Spectroscopy, 2015, 140: 356-363. DOI:10.1016/j.saa.2015.01.003.

[26] XIE W, ZANG X. Immobilized lipase on core-shell structured Fe3O4-MCM-41 nanocomposites as a magnetically recyclable biocatalyst for interesterification of soybean oil and lard[J]. Food Chemistry, 2016,194(2): 160-166. DOI:10.1016/j.foodchem.2015.09.009.

[27] CHEN Z F, ZHAO Y S, BAI J, et al. Migration and transformation behavior of volatile phenol in the vadose zone[J]. Water Science &Technology A Journal of the International Association on Water Pollution Research, 2014, 70(4): 685-690. DOI:10.2166/wst.2014.279.

[28] CHEN W, WESTERHOFF P, LEENHEER J A, et al. Fluorescence excitation-emission matrix regional integration to quantify spectra for dissolved organic matter[J]. Environmental Science & Technology,2003, 37(24): 5701-5710. DOI:10.1021/es034354c.

[29] CAO X Y, SHEN F, ZHANG M W, et al. Highly sensitive detection of melamine based on fl uorescence resonance energy transfer between rhodamine B and gold nanoparticles[J]. Dyes and Pigments, 2014, 111:99-107. DOI:10.1016/j.dyepig.2014.06.001.

[30] WANG Z, ZHENG Q Y, CHEN Y. Detection of metal ions using a wavelength interrogation surface plasmon resonance sensor with calix[4]arene derivatives as sensing films[J]. Analytical Letters, 2007,34(15): 2609-2619. DOI:10.1081/AL-100108408.

Spectral Characterization of Fluorescent Sensor Immobilized with Eggshell Membrane and Method Development for Melamine Detection

ZHANG Pei, LI Ying, WANG Zengli, WANG Shiping*
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Abstract:This study aimed to develop a method for rapid and precise detection of melamine in milk products. Based on the phenomenon that the melamine can linearly increase the fl uorescence intensity of fl uorescein within a certain concentration range, we constructed an eggshell membrane biosensor with fluorescein immobilized on its surface to detect melamine.Fluorescein and glutaraldehyde concentration were optimized. The eggshell membrane sensor had a linear working range of 1-500 µg/L, and the limit of detection (LOD) for melamine was 0.47 µg/L. Compared to the methods used for the detection of melamine in aqueous solution, the eggshell membrane sensor was more specific and stable with higher selectivity and lower LOD. This sensor can be successfully applied to the detection of melamine in commercial milk products.

Keywords:egg membrane; fl uorescein; melamine; sensor

ZHANG Pei, LI Ying, WANG Zengli, et al. Spectral characterization of fluorescent sensor immobilized with eggshell membrane and method development for melamine detection[J]. Food Science, 2018, 39(22): 328-333. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201822049. http://www.spkx.net.cn

引文格式:张沛, 李莹, 王增利, 等. 鸡蛋膜荧光传感器光谱信息表征及三聚氰胺检测方法的构建[J]. 食品科学, 2018, 39(22):328-333. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201822049. http://www.spkx.net.cn

文章编号:1002-6630(2018)22-0328-06

文献标志码:A

中图分类号:TS207.3

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201822049

*通信作者简介:王世平(1959—),男,教授,硕士,主要从事食品安全、食品安全检验技术、农产品废弃物综合利用技术研究。E-mail:wang744447@sohu.com

第一作者简介:张沛(1993—),女,硕士研究生,主要从事食品安全检测技术、农产品废弃物综合利用技术研究。E-mail:807165322@qq.com

收稿日期:2017-08-21