表示，采用SPSS 19.0软件进行数据分析，数据统计方法采用ANOVA进行LSD差异分析，P＜0.05表示差异显著。使用Origin 8.5软件作图。高温肉制品（如酱牛肉等）是指加热介质温度高于100 ℃（通常为115～121 ℃）、中心温度高于115 ℃并恒定适当时间的肉制品，具有营养卫生、食用方便、携带方便等特点，深受消费者喜爱[1]。加热是肉制品加工过程中最重要的工艺之一，而热加工过程中肌肉蛋白质分子间化学作用力和结构的变化对肉制品的最终品质起着重要影响[2]。李蕙蕙[3]研究发现，在鸡肉火腿肠加工过程中，随加热温度的升高，鸡胸肉盐溶蛋白溶液的疏水相互作用先剧烈上升后稳步回落，加热到80 ℃时，盐溶蛋白中210、96.5 kDa及小分子质量蛋白的电泳带全部消失。邓丽等[4]研究了鲍鱼热加工过程中蛋白间作用力及其质构特性，结果发现随温度升高，蛋白二级结构发生明显变化，各化学作用力与蛋白凝胶质构特性具有高度相关性。刘海梅等[5]研究发现，在鲢鱼鱼糜凝胶形成过程中，采用40 ℃和90 ℃两段加热，鲢鱼肌球蛋白的α-螺旋结构部分转变成β-转角和无规卷曲结构，以无规卷曲结构为主，其中α-螺旋和无规卷曲结构是维持鲢鱼鱼糜凝胶网络结构的主要蛋白质构象。张莉莉[6]的研究发现，随着处理温度（100～121 ℃）的升高，鱼糜凝胶中蛋白质二级结构无规卷曲被破坏，离子键和疏水相互作用剧烈下降，而氢键和二硫键整体呈上升的趋势。
国内外对肉制品在热加工过程中蛋白质间化学作用力和结构变化的研究多集中在火腿肠、鱼糜等方面，并且通常在100 ℃以下，而对牛肉高温肉制品的研究较少。本实验以不同高温处理的牛背最长肌为研究对象，采用化学法并结合傅里叶变换红外光谱、紫外光谱、内源荧光光谱以及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE），研究高温处理对蛋白质间化学作用力和结构的影响，以期为进一步分析高温处理过程中牛肉蛋白质变化的机理提供参考。
选取来自河南伊赛牛肉股份有限公司宰杀的18 月龄夏洛莱牛公牛6 头，屠宰前禁食、禁水12 h。每头牛经击晕、宰杀、放血、去头蹄内脏、剥皮、劈半、冲洗后，胴体吊挂排酸3 d，选取牛背最长肌作为样品。
氯化钠、尿素、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、溴化钾、溴酚蓝、异丙醇、乙酸、磷酸（均为分析纯） 天津市德恩化学试剂有限公司；丙烯酰胺、四甲基乙二胺（tetramethylenediamine，TEMED）、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、β-巯基乙醇、SDS 美国Sigma公司。
FJ-200高速分散均质机 上海标本模型厂；H1650高速离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；DYCZ-24DN垂直电泳槽、DYY-6C型稳压稳流型电泳仪北京市六一仪器厂；Gel-Doc-XR+凝胶成像仪 美国Bio-Rad公司；TYAIB型高压蒸汽灭菌锅 宁波久兴医疗器械有限公司；VERTEX70型傅里叶变换红外光谱仪德国Bruker公司；UV2600紫外-可见分光光度计 日本Shimadzu公司；Cary eclipse型荧光分光光度计 美国Aglient公司。
1.3.1 牛肉样品的预处理及高温处理
生鲜牛背最长肌顺着肉样纹理将其肉眼可见的表面脂肪、夹层脂肪剔除干净，并修整切割成大小均匀的方形肉块（5 cm×5 cm×1 cm），用蒸煮袋真空密封包装，随后放入高压蒸汽灭菌锅中进行高温处理。参考张莉莉[6]的方法，高温处理条件为：高压蒸汽灭菌锅压力0.12 MPa，当温度达到（110±1）、（115±1）℃和（121±1）℃后分别保持3、6、9、12、15 min，高温处理后的牛肉样品静置冷却后放在4 ℃冰箱冷藏室待测。
1.3.2 肌原纤维蛋白的提取
参照Xiong Youling L.等[7]的方法并作适当修改，准确称取5.000 0 g处理过的肉样，以未处理（0 min）的样品为对照，加入10 倍体积分离缓冲液A（0.1 mol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸、0.5 mmol/L二硫苏糖醇、10 mmol/L K2HPO4，pH 7.0），10 000 r/min均质1 min后80 目纱布过滤，滤液10 000 r/min冷冻离心10 min，取沉淀，重复3 次。沉淀再加入4 倍体积分离缓冲液B（0.1 mol/L NaCl、1 mmol/L NaN3，pH 6.25），10 000 r/min冷冻离心10 min，弃上清液取沉淀，重复3 次，沉淀即为肌原纤维蛋白。
1.3.3 化学作用力的测定
参考Gómez-Guillén等[8]的方法，准确称取1 g处理后的肉样，以未处理（0 min）的样品为对照，分别加入10 mL 0.05 mol/L NaCl（SA）、0.6 mol/L NaCl（SB）、0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素（SC）、0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素（SD）、0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素+1.5 mol/L β-巯基乙醇（SE），10 000 r/min均质1 min后于4 ℃条件下静置2 h，然后10 000 r/min冷冻离心10 min，取上清液。采用Lowry法测定上清液中蛋白质的含量。离子键的含量以溶解于SB与SA的蛋白质含量之差表示；氢键的含量以溶解于SC与SB的蛋白质含量之差表示；疏水相互作用的含量以溶解于SD与SC的蛋白质含量之差表示；二硫键的含量以溶解于SE与SD的蛋白质含量之差表示。离子键的相对含量以离子键的含量与所有化学作用力的含量之和的比来计算，氢键、疏水相互作用、二硫键相对含量的计算方法与之相同。
1.3.4 肌原纤维蛋白傅里叶变换红外光谱分析
准确称取1 mg不同温度处理的肌原纤维蛋白，以未处理（0 min）的样品为对照，加入100 mg KBr研磨压片，采用傅里叶变换红外光谱仪对样品在400～4 000 cm-1范围内进行全波数扫描，仪器分辨率为5 cm-1，扫描信号累加64 次。
1.3.5 肌原纤维蛋白紫外吸收光谱分析
不同温度处理的肌原纤维蛋白用10 mmol/L pH 7的磷酸盐缓冲液配制成1 mg/mL的蛋白溶液，以10 mmol/L pH 7的磷酸盐缓冲液作为空白，以未处理（0 min）的样品为对照，进行紫外光谱扫描，扫描速率10 nm/s，扫描波长范围200～600 nm。
1.3.6 肌原纤维蛋白内源荧光光谱分析
不同高温处理下的肌原纤维蛋白用10 mmol/L pH 7的磷酸盐缓冲液配制成1 mg/mL的蛋白溶液，以10 mmol/L pH 7的磷酸盐缓冲液作为空白，以未处理（0 min）的样品为对照，采用荧光分光光度计进行荧光光谱扫描，激发波长为295 nm，发射波长300～400 nm，扫描范围300～500 nm，激发和发射狭缝宽度均为5 nm。
1.3.7 肌原纤维蛋白SDS-PAGE分析
采用Laemmli[9]的电泳体系，参考姜启兴[10]的方法并做适当修改，样品质量浓度1 mg/mL，分离胶质量分数为12%，浓缩胶质量分数为5%。
每次实验做3 次平行，结果用表示，采用SPSS 19.0软件进行数据分析，数据统计方法采用ANOVA进行LSD差异分析，P＜0.05表示差异显著。使用Origin 8.5软件作图。
由表1可见，离子键相对含量在加热初期与生鲜样品（0 min）相比显著下降（P＜0.05），并随着加热时间的延长呈不断下降的趋势，但在加热后期变化不显著（P＞0.05）。在110、115 ℃和121 ℃加热15 min后离子键相对含量分别下降了71.3%、88.4%和92.2%。氢键相对含量随着加热时间延长呈急剧下降的趋势，但在加热中期（6～9 min）变化不显著（P＞0.05）。121 ℃加热3 min后，氢键相对含量比110、115 ℃下降幅度高，达到57.8%；说明加热温度越高，氢键出现断裂的时间点越早。结果表明随着温度升高，离子键、氢键发生了断裂，相对含量减少。离子键和氢键是相对于疏水相互作用和二硫键较弱的键合力，在加热初期就能被破坏，而在加热后期无明显变化[11]。
表1 不同处理温度和时间对牛背最长肌蛋白质间化学作用力的影响
Table1 Effects of temperature and heating time on chemical forces of beef longissimus dorsi muscle proteins
注：同列相同温度上标小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
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疏水相互作用相对含量在110、115 ℃时随加热时间的延长呈急剧上升的趋势（P＜0.05），加热15 min后分别增加了82.9%和92.1%，而在121 ℃时呈先升高后下降的趋势。加热过程促进了蛋白疏水性基团的暴露，促使疏水相互作用增强，而随着热处理温度的升高或时间的延长，蛋白质的空间结构改变，使更多的疏水性氨基酸残基暴露出来，增加了蛋白质表面疏水性，同时生成了复杂的结构，进而降低了疏水相互作用[12]。二硫键相对含量随加热时间的延长呈先升高后下降的趋势（P＜0.05），且高于离子键和氢键，110、115 ℃条件下均在9 min时达到最大值（17.51%、18.46%），而在121 ℃加热12 min时才达到最大值（28.18%）。在高温处理过程中，随温度的升高或时间的延长，大量巯基暴露出来发生氧化，蛋白质之间产生交联作用，促进了二硫键的形成[13]。
同一加热时间（9 min），分析不同加热温度下牛肉蛋白质间化学作用力的变化，可以看出随着处理温度的升高，离子键和氢键相对含量不断下降，而疏水相互作用和二硫键相对含量呈上升的趋势，并在110 ℃和115 ℃时差异不明显。而这与张莉莉[6]研究高温（100～120 ℃）处理对鱼糜凝胶蛋白质间相互作用力影响的结果一致。
一般3 400～3 440 cm-1附近为酰胺A带，反映了N—H的伸缩振动；1 664 cm-1处的特征吸收峰归属于酰胺I带C＝O的伸缩振动；酰胺II带的特征频率在1 534 cm-1处，反映了C—N的伸缩或N—H的弯曲振动；1 244 cm-1处的酰胺III带是由C—H的伸缩或N—H的弯曲振动产生的[14]。
图1 不同处理温度和时间的牛肉肌原纤维蛋白傅里叶变换红外光谱图
Fig.1 Fourier transform infrared spectra of myofibrillar protein at different temperatures and heating times
由图1可知，与对照相比，经110、115 ℃和121 ℃高温处理后，牛肉肌原纤维蛋白的酰胺A带从3 285 cm-1处右移至3 280 cm-1附近，可能是酰胺A带的N—H伸缩振动与氢键形成缔合体，从而向低波数位移，表明氢键发生了变化，此结果与化学法测定氢键含量的结果一致[3]。与对照组相比，高温处理后1 664 cm-1处反映α-螺旋的特征吸收峰向右偏移至1 650 cm-1附近，并随加热时间的延长继续向右轻微偏移，说明加热后牛肉肌原纤维蛋白的α-螺旋转变为无规卷曲结构[15-16]。在1 534 cm-1附近，随着加热时间的延长，酰胺II带的特征吸收峰峰形逐渐变宽，表明发生了N—H弯曲和C—N的伸缩振动。随加热时间的延长，1 244 cm-1处的酰胺III带无明显变化。同一加热时间不同温度下，随着温度的升高，酰胺A带、酰胺I带、酰胺II带和酰胺III带均向右偏移，1 664 cm-1和1 534 cm-1附近的吸收峰峰形变宽，说明肌原纤维蛋白氨基酸残基总吸光度发生了变化，蛋白质的二级结构改变。这与邓丽等[4]研究热加工过程中鲍鱼腹足肌原纤维蛋白红外光谱变化的结果一致。
图2 不同处理温度和时间的牛肉肌原纤维蛋白紫外吸收光谱图
Fig.2 Ultraviolet-visible spectra of myofibrillar protein at different temperatures and heating times
由于色氨酸和酪氨酸残基侧链基团对紫外光具有吸收作用，因此可采用紫外吸收光谱研究蛋白质三级结构的变化[17]。从图2中可以看出，高温处理后，表征色氨酸和酪氨酸残基侧链基团的275 nm波长处特征吸收峰发生了明显的蓝移，并伴随着紫外吸收强度的增强而增强。表明高温处理使色氨酸和酪氨酸残基暴露于蛋白质表面，其所处的微环境由非极性向极性转变[18]。与对照组相比，110、115 ℃和121 ℃加热使牛肉肌原纤维蛋白紫外最大吸收峰波长（λmax）由波长275 nm蓝移至259 nm处，但随着加热时间的延长，牛肉肌原纤维蛋白λmax无明显偏移，这与黄友如等[19]研究高温处理对脱脂豆粕中大豆分离蛋白结构影响的结果一致。这可能是由于加热一定时间后，牛肉肌原纤维蛋白趋于完全变性，蛋白构象逐渐趋向稳定以适应新环境。在110、115 ℃加热条件下，随着加热时间的延长，紫外吸收强度先升高后下降，并分别在9 min和12 min时达到最大值，表明肌原纤维蛋白展开，越来越多的芳香族氨基酸残基暴露于蛋白质表面。紫外吸收强度的下降可能与高温处理后期生色氨基酸基团发生氧化、含量减少有关[20]。温度升至121 ℃时，紫外吸收强度随加热时间的延长先下降后升高并趋于稳定，表明肌原纤维蛋白二级结构中α-螺旋受到了较大程度的破坏，傅里叶变换红外光谱分析也证实了这一点。相同加热时间下，随着加热温度的升高，牛肉肌原纤维蛋白λmax无明显偏移，紫外吸收强度随温度升高而降低，峰型变窄，可能是因为蛋白经高温处理形成聚集体，导致暴露在外部的生色氨基酸基团重新隐藏在内部，造成紫外吸收强度降低[21-22]。
高温处理会造成蛋白质发生变性，引起蛋白构象的改变，从而使得芳香族氨基酸残基的位置和微环境发生变化；而芳香族氨基酸残基可吸收紫外入射光发射荧光，因此可利用内源荧光光谱来研究蛋白质构象的变化[23]。从图3中可以看出，高温处理使得牛肉肌原纤维蛋白λmax明显红移，荧光强度不同程度的增强。在110 ℃下，牛肉肌原纤维蛋白λmax从波长332 nm红移至349 nm附近，随加热时间的延长继续红移至波长355 nm处；荧光强度随加热时间的延长先增大后减小，在9 min时达到最大。这表明高温处理使肌原纤维蛋白变性，色氨酸侧链基团逐渐从内部疏水区向溶剂暴露，其所处的微环境极性增加，荧光强度增强[24]。温度升至115 ℃时，牛肉肌原纤维蛋白λmax进一步红移至波长351 nm附近，而随着加热时间的延长，牛肉肌原纤维蛋白λmax并没有发生明显的偏移；荧光强度变化趋势与110 ℃相似，随加热时间的延长先增大后减小，并在12 min时达到最大。121 ℃下，λmax红移至波长352 nm附近，并随加热时间延长轻微蓝移至波长349 nm处直至稳定，这可能是因为121 ℃加热后期色氨酸侧链基团中酚氧原子孤对电子与芳环之间的激发态电荷转移作用受到部分抑制，从而移向更为疏水的环境中。郭丽萍[25]的研究发现，随处理温度升高猪肉肌原纤维蛋白荧光光谱出现微小的蓝移现象，与本研究结果一致。随加热时间的延长，荧光强度先减小后增大，并在6 min时降至最低，可能是因为蛋白色氨酸侧链基团在加热过程中会出现短暂的收缩，随后逐渐舒展暴露，直至构象稳定[26-27]。同一加热时间下，随着加热温度升高，牛肉肌原纤维蛋白λmax在波长350 nm附近无明显偏移，与紫外吸收光谱变化趋势相似；荧光强度随温度升高而逐渐减弱，这与Lefevre等[28]发现大西洋鲑肌原纤维蛋白分子在加热过程中，随着加热温度的升高，内源荧光强度逐渐降低的结果一致。
图3 不同处理温度和时间的牛肉肌原纤维蛋白内源荧光光谱图
Fig.3 Intrinsic fluorescence spectra of myofibrillar protein at different temperatures and heating times
图4 不同处理温度和时间的牛背最长肌肌原纤维蛋白SDS-PAGE图
Fig.4 SDS-PAGE of myofibrillar proteins from beef longissimus dorsi muscle at different temperatures and heating times
从图4中可以看出，随着处理温度的升高和加热时间的延长，牛背最长肌中肌原纤维蛋白发生了明显的降解聚集，形成了小分子质量的蛋白片段，从而导致了许多电泳条带的消失以及新条带的生成。与对照组相比，高温处理后牛背最长肌肌原纤维蛋白的电泳条带在200～66.4 kDa和44.3～29.0 kDa范围内均出现了明显的模糊变淡甚至消失现象。200 kDa处的肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MHC）条带随着加热时间的延长逐渐变淡，在110 ℃加热9 min之前无明显变化，在115 ℃加热6 min时突然消失，而在121 ℃加热条件下则完全消失。Runglerdkriangkrai等[29]的研究发现，鱼丸在116 ℃加热3 min时，MHC条带明显变浅，加热至6 min时则几乎完全消失，与本研究结果基本一致。而44.3 kDa处的肌动蛋白在加热初期发生轻微降解后，随着加热时间的延长无明显变化，表明肌动蛋白的热稳定性明显高于肌球蛋白。Tornberg[30]的研究发现，在鸡肉加热过程中，肌动蛋白电泳条带比肌球蛋白消失更慢，与本研究结果一致。110 ℃加热9 min时出现了27 kDa的新条带，可能是由于大分子蛋白在高温下降解或者凝聚产生的。随着处理温度的升高和时间的延长，MHC条带上部的颜色加深，可能是高温使肌原纤维蛋白发生了过度聚合变性，产生了聚集现象，形成聚集体。
在高温处理过程中，牛肉蛋白质离子键和氢键发生了断裂，并随着温度的升高和加热时间的延长呈不断下降的趋势（P＜0.05）。由于离子键和氢键是相对于疏水相互作用和二硫键较弱的键合力，在加热初期就能被破坏，而在加热后期则无明显变化（P＞0.05）。同时，蛋白疏水性基团的暴露使得疏水相互作用增强，并且暴露出大量巯基发生氧化，蛋白质之间产生交联作用，进而促进了二硫键的形成。牛肉肌原纤维蛋白质二级结构在高温处理过程中发生重排，N—H和C—N伸缩振动以及N—H弯曲振动较为明显。紫外吸收光谱和内源荧光光谱的分析结果表明，高温处理对牛肉肌原纤维蛋白质的三级结构产生了影响，越来越多的芳香族氨基酸残基暴露于分子表面，蛋白质疏水区域发生了局部改变。肌原纤维蛋白发生了明显的降解聚集，并形成了大量小分子质量的蛋白片段。
肌原纤维蛋白在牛肉加工过程中起很重要的作用，肌原纤维蛋白在加热后形成凝胶，其形成不仅与制品质构有关，而且对产品赋形及水分的保留起重要作用。随着处理温度的升高和加热时间的延长，牛肉肌原纤维蛋白质结构发生了不同程度的变化。因此，实际加工过程中，要把保证产品商业无菌和提高品质有机结合，本研究条件下以121 ℃保持6～9 min为宜。
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Effect of High Temperature Treatment on Chemical Forces of Beef Proteins and Structure of Myofibrillar Protein