橄榄（Canarium album（Lour.）Raeusch），又名青果、甘榄、黄榄等，是我国南方特有的果品之一，富含多糖、氨基酸、多酚、黄酮等营养保健成分，具有生津止渴、开脾胃、助消化、抗氧化、除口臭等营养和保健功效[1-2]，其鲜果及各种加工制品深受消费者喜爱。但采后橄榄果实由于呼吸作用持续进行及病原菌侵染，易引起果实失水皱缩、褐变、品质劣变甚至腐烂，严重影响其食用品质和商品价值，极大限制了鲜果的销售和推广[3-4]。目前，低温冷藏[5]、冷激-紫外[6]及微波辐照[7]等物理保鲜技术和甲基托布津、戴唑霉、多菌灵等化学保鲜剂[8]被广泛用于采后橄榄果实的防腐保鲜中，取得了一定的保鲜效果，但低温冷藏易发生冷害，冷激-紫外和微波辐照等成本较高且不易控制，而传统化学杀菌剂会带来诸多负面效应，如在果蔬病原菌产生抗药性，存在试剂残留、食品安全以及对环境污染等问题。因此，采取天然、安全、有效的保鲜措施以保持橄榄果实采后品质和延长贮藏期成为亟需解决的关键问题。当前，植物源保鲜剂被认为是一种可行和安全的替代方法，其在控制病原菌侵染引起的果蔬品质劣变、腐烂中得到了广泛的报道和关注[9-12]。
生姜（Zingiber officinale Roscoe）是我国卫生部公布的第一批药食两用植物，含有挥发油、姜辣素、二苯基庚烷等多种化学成分，具有强杀菌作用和抗氧化、抗衰老功效[13]。其中，姜油树脂是生姜的醇提物，其主要成分包括挥发性姜精油、姜辣素（姜酮、姜酚等）等，具有广谱、高效的抑菌作用[14-17]，可作为一种安全无毒的天然保鲜剂，用于鲜切红富士苹果、樱桃番茄、草莓果实等果蔬的采后保鲜和品质控制，能有效降低果蔬采后生理代谢进程，抑制微生物生长，有效延长果实采后保鲜期，保持果蔬采后贮藏品质[18-21]。但到目前为止，鲜见姜油树脂对引起采后橄榄果实腐烂病原菌控制及对橄榄果实保鲜效果的研究报道。本课题组前期研究发现，小孢拟盘多毛孢（Pestalotiopsis microspora）是引起采后橄榄果实腐烂的最主要病原菌之一，P. microspora菌丝生长和产孢的适宜温度为24～26 ℃，果实染病后会发生黑斑、腐烂等症状，严重影响其商品价值[22]。因此，本实验以福建省主栽品种‘长营’橄榄（Canarium album（Lour.）Raeusch cv. Changying）果实为实验材料，采用损伤接种法研究姜油树脂对P. microspora接种橄榄果实的抑菌效果，同时研究姜油树脂对橄榄果实采后病害发生和贮藏品质的影响，旨在为姜油树脂应用于采后橄榄果实贮藏保鲜提供科学依据和实践指导。
供试菌种P. microspora，由福建农林大学食品科学学院食品贮藏保鲜实验室分离、鉴定和保存。
供试‘长营’橄榄果实采自福建省福州市闽侯县白沙镇橄榄农场。果实采收当天迅速运至实验室，挑选成熟度一致、大小均匀、无病害、无损伤的健康果实进行实验。
姜油树脂（分析纯，姜辣素质量分数＞25%）上海一研生物有限公司；丙二醇、次氯酸钠、碘酸钾国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为国产分析纯或化学纯。
DRX-260恒温人工气候箱 宁波赛福实验仪器有限公司；UV-1750紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；SW-CJ-1F超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；TM-D24UV超纯水系统 美国Millipore公司。
1.3.1 孢子悬液的制备
参照陈南泉等[23]的方法制备P. microspora孢子悬液，浓度为106个/mL。
1.3.2 姜油树脂乳浊液的制备
姜油树脂主要成分为萜烯类、醛、酮、酚等，易溶于有机溶剂，前期预实验表明丙二醇对供试菌种无抑制效果，因此本实验将姜油树脂溶于丙二醇（体积比1∶1）中，并加入适量的重蒸水（ddH2O）和数滴琥珀酸淀粉酯，搅拌均匀，配制成所需浓度的姜油树脂乳浊液。
1.3.3 姜油树脂最佳抑菌剂量的筛选
采用损伤接种法，橄榄果实用杀菌剂（体积分数2%次氯酸钠溶液）浸泡2 min，然后用蒸馏水冲洗2 次，果实凉干后，用已灭菌的打孔器在果实上打5 mm（直径）×3 mm（深）的孔口，之后接种15 µL的P. microspora孢子悬液，并分别注入20 µL剂量为10、20、30、40 μL/mL的姜油树脂，处理后橄榄果实置于25 ℃、90%相对湿度条件下贮藏6 d，每隔1 d取样观察拍照并测定橄榄果实病斑直径，以确定姜油树脂的最佳抑菌剂量。每个处理20 个果实，设3 次重复，并以同体积无菌水处理为空白对照。
1.3.4 姜油树脂保鲜实验
经挑选后的‘长营’橄榄果实进行以下2 种处理：1）姜油树脂处理：用1.3.3节确定出最佳抑菌剂量的姜油树脂浸泡橄榄果实10 min，之后将橄榄果实取出并晾干，用聚乙烯保鲜膜袋（0.015 mm厚）包装（100 个/袋），之后在25 ℃、90%相对湿度下贮藏。2）对照：以蒸馏水取代姜油树脂，其余处理步骤与前面所述一样。
以上每一处理各30 袋（即每一处理3 000 个橄榄果实）。贮藏期间每隔7 d随机取样1 袋（100 个），用于橄榄果实病害指数、褐变指数及品质指标测定。
1.3.5 贮藏保鲜效果和品质指标测定
果实病害指数参照孔祥佳等[24]的方法测定，并略作修改。每次随机取100 个橄榄果实，按照果实表面的病害面积分为5级：果实无病害为0级；果实出现病害，病害面积＜1/4为1级；果实出现病害，1/4≤病害面积＜1/2为2级；果实出现病害，1/2≤病害面积＜3/4为3级；果实出现病害，3/4≤病害面积＜1为4级；果实表面全部出现病害斑为5级。按公式（1）计算果实病害指数。
果皮褐变指数参照孔祥佳等[24]的方法评价橄榄果皮褐变指数。每次随机取100 个橄榄果实，按照橄榄果实表面褐变面积大小把果皮褐变程度分为6级：1级果实没有褐变；2级果实褐变面积＜1/4；3级果实1/4≤褐变面积＜1/2；4级果实1/2≤褐变面积＜3/4；5级果实3/4≤褐变面积＜1；6级果实全部褐变。按公式（2）计算果皮褐变指数。
可溶性固形物（total soluble solids，TSS）质量分数采用阿贝折射仪测定。
可溶性总糖（total sugar，TS）质量分数参照孔祥佳等[25]的方法采用蒽酮比色法测定。
可滴定酸（titratable acid，TA）质量分数参照孔祥佳等[25]的方法采用酸碱滴定法测定。
VC含量参照郑道序等[26]的2,6-二氯靛酚滴定法测定。
总酚（total phenols，TP）、总类黄酮（total flavonoids，TF）含量的测定参照郑道序等[26]的分光光度法进行，以每克橄榄果实提取液在280 nm和325 nm波长处的光密度值（OD280nm/g mf和OD325nm/g mf）分别表示TP和TF的相对含量。
以上指标均重复取样测定3 次，采用DPS 12.01软件对实验数据进行统计分析，P＜0.05或0.01表示差异显著。采用Excel 2007和Origin 8.5软件进行数据处理分析及图形制作。
图1 姜油树脂对P. microspora接种橄榄果实病斑直径（A）和抑菌效果（B）的影响
Fig.1 Effect of ginger oleoresin on lesion diameter (A) and its antifungal effect (B) on Pestalotiopsis microspora-infected Chinese olive fruits
P. microspora是引起采后橄榄果实腐烂的最主要病原菌之一，不同剂量姜油树脂处理对P. microspora接种橄榄果实的抑菌效果如图1所示。由图1A可知，经姜油树脂处理的橄榄果实的病斑直径均较对照组小，且病斑扩展速度随剂量增加而逐渐延缓，当姜油树脂剂量超过30 μL/mL时，病斑直径没有明显增大。同时，贮藏期间，对照组、10 μL/mL和20 μL/mL姜油树脂处理的橄榄果实的病斑部位果皮发生凹陷，表面覆盖大量灰白色菌丝体，而经30 μL/mL和40 μL/mL处理的橄榄果实基本未见菌丝体，且病斑处很快干结（图1B）。
上述结果表明姜油树脂处理可显著抑制P. microspora生长（P＜0.01），有效延缓橄榄果实采后病害发生。因此，最终确定姜油树脂对橄榄果实的最佳抑菌剂量为30 μL/mL。
图2 姜油树脂对采后橄榄果实病害指数（A）和果皮褐变指数（B）的影响（25 ℃贮藏）
Fig.2 Effect of ginger oleoresin on fruit disease index (A) and pericarp browning index (B) of Chinese olives during postharvest storage at 25 ℃
病害指数和褐变指数是评价果实贮藏效果的重要指标。橄榄贮藏期间的果实病害指数和果皮褐变指数变化情况如图2所示。由图2A可知，橄榄果实病害指数随贮藏时间延长而增加，但姜油树脂处理组的果实病害指数均低于对照组。其中，姜油树脂处理组（30 μL/mL）的橄榄果实在贮藏前7 d未产生病害，而后缓慢上升，贮藏至第49天时，其果实病害指数为1.33，而对照组则高达3.56，两者存在极显著性差异（P＜0.01）。橄榄采后病害主要由病原菌引起，姜油树脂处理可有效延缓橄榄果实采后病害发生与其具有抑制这些采后病原菌活性有关。
从图2B可以看出，与对照组橄榄果实比较，姜油树脂处理能有效降低采后橄榄果实的果皮褐变指数。如贮藏至第35天时，对照组橄榄果实大部分发生褐变，果皮褐变指数高达4.83，而姜油树脂处理的果实果皮褐变指数0.86；贮藏至第49天时，对照组橄榄果实和姜油树脂处理橄榄果实的果皮褐变指数分别为5.11、1.65，两者之间的差异达到极显著水平（P＜0.01）。由此可见，橄榄果实常温贮藏期间，姜油树脂处理可有效抑制病原菌侵染引起的果实褐变，较好地保持橄榄果实的外观品质。
图3 姜油树脂对采后橄榄果实TSS（A）、TS（B）、TA（C）质量分数、VC（D）、TF（E）和TP（F）含量的影响（25 ℃贮藏）
Fig.3 Effect of ginger oleoresin on the contents of total soluble solids (A),total soluble sugars (B), titratable acid (C), VC (D), total flavonoids (E) and total phenols (F) of Chinese olive fruits during postharvest storage at 25 ℃
TSS质量分数是影响橄榄果实营养价值和口感的一个重要指标，也反映了果实的成熟进程。从图3A可以看出，两处理组的橄榄果实TSS质量分数在贮藏期间均呈先略微上升后下降的趋势，这可能是由于采后橄榄还未完全成熟，在成熟过程中，淀粉等大分子物质分解成了可溶性的小分子物质等，使得TSS的质量分数有所上升。随着贮藏时间的延长，其大分子物质降解速率开始小于代谢速率，导致TSS质量分数开始下降[6]。但姜油树脂处理的果实在贮藏期间TSS质量分数下降不明显，贮藏49 d后仍保持较高的质量分数（10.04%），与对照组（8.91%）差异极显著，表明姜油树脂处理在一定程度上延缓了果实的后熟衰老进程，提高了果实的贮藏品质。
TS质量分数是橄榄果实鲜食品质评价指标之一，TS质量分数高可在一定程度上掩盖其苦涩味，改善口感。由图3B可知，橄榄果实TS质量分数的变化趋势与TSS类似，呈先上升后下降趋势，这与橄榄果实在贮藏过程中多糖被分解转化为可溶性糖，而后随着果实呼吸作用加强又作为基质被消耗有关[6]。其中，对照组和处理组中橄榄果实中TS质量分数分别在贮藏14 d和35 d达到峰值，随后开始下降，但处理组TS质量分数变化较对照组平稳且均保持在较高水平（1.75%～1.98%），说明姜油树脂处理抑制了果实的呼吸作用，延缓橄榄果实中TS质量分数的下降。
TA是果实重要的营养组分之一，其质量分数越高，说明果实的成熟度越低，影响果实的风味品质。如图3C所示，在贮藏期间，对照组和姜油树脂处理组果实的TA质量分数均逐渐降低，可能由于果实有机酸的一部分转化为糖类物质，一部分作为呼吸底物被消耗[14]，但两者无显著差异（P＞0.05）。其中，对照组在贮藏7 d后开始快速下降，而姜油树脂处理组至14 d后才开始缓慢下降，可见姜油树脂处理可有效延缓橄榄果实TA质量分数的下降，保持果实良好的风味品质。
橄榄果实富含VC，其含量高低直接反映果实品质的优劣，但VC易氧化、对光热等不稳定。由图3D可以看出，在贮藏过程中，两处理组的橄榄果实VC含量均在第7天出现峰值，之后开始下降，但姜油树脂处理的橄榄VC含量下降速度显著低于对照组（P＜0.05），在贮藏49 d后，处理组VC含量比对照组高21.92%，说明姜油树脂有一定的抗氧化作用，可有效延缓橄榄果实VC在贮藏过程中被氧化的速度。
类黄酮具有清除自由基、抗衰老等功能，其含量是橄榄果实营养品质的重要指标之一。由图3E可知，两处理组橄榄果实的TF含量在贮藏期间均呈下降趋势，但姜油树脂处理后的橄榄中TF含量均高于对照组，贮藏至49 d后，处理组TF含量（0.29 OD325nm/g mf）约为对照组（0.09 OD325nm/g mf）的3 倍，表明姜油树脂处理可延缓橄榄果实TF含量的下降速度。
酚类物质是橄榄的次生代谢产物，具有抑菌作用和抗氧化作用，同时也是橄榄果实苦涩味的主要来源[2]。在橄榄果实贮藏期间，对照组和处理组橄榄果实贮藏期间TP含量均呈上升趋势（图3F），这可能是橄榄果实贮藏过程中随着衰老进程的发生导致细胞膜被破坏，引起液泡中多酚游离出来使得TP含量升高的缘故[26]。其中，对照组的TP含量在贮藏35 d后发生急剧下降，这可能与橄榄果实发生严重褐变导致多酚类物质含量降低有关，这与橄榄果实在贮藏35 d时褐变指数急剧上升的研究结果相一致（图2B）。进一步比较发现，贮藏35 d时，处理组的TP含量极显著（P＜0.01）高于对照橄榄果实，表明姜油树脂处理可延缓采后橄榄果实TP含量的下降速度。
上述结果表明，姜油树脂处理可保持橄榄果实采后贮藏期间较高的TSS、TS、TA、VC、TF、TP等营养物质含量，较好保持橄榄果实贮藏品质。
P. microspora为拟盘多毛孢属真菌，是引起采后橄榄果实发生褐变和腐烂的最主要病原真菌之一[22]。前人研究认为，姜油树脂对曲霉属、青霉属、镰刀菌属等真菌具有较强的抑制作用，它可通过改变微生物细胞壁和细胞膜的通透性和完整性、破坏细胞内的遗传物质以及干扰细胞内多种酶的活性等途径产生抑菌作用[19-21,27-31]。本研究发现，30 μL/mL的姜油树脂能有效抑制P. microspora接种橄榄果实病斑生长，延缓橄榄果实采后病害发生（图1）。进一步研究发现，姜油树脂能有效抑制P. microspora菌丝蛋白质和总糖的合成代谢，增加P. microspora菌丝的细胞膜通透性，改变P. microspora菌丝的细胞膜脂肪酸组份，导致其内含物外渗，从而抑制P. microspora菌丝的生长，P. microspora菌丝出现畸形、扭结、皱缩、断裂等现象，从而达到抑菌效果[32]。
姜油树脂含有挥发性姜精油、姜酮、姜酚等植物天然成分，是一种安全、环保的天然保鲜剂，能有效保持果蔬采后贮藏品质，抑制果蔬采后病害发生和延长果蔬保鲜期[18-21]。李伟锋等[19]报道，生姜醇提取物能显著延缓鲜切红富士苹果乙烯释放量和呼吸速率，减少其质量损失和被微生物侵染，较好保持鲜切红富士苹果品质和TA含量；郭艳华[20]利用生姜醇提物与VC、柠檬酸复配制备复合保鲜剂，研究发现复合保鲜剂能降低樱桃番茄采后失水和果实霉变率，保持较高果实营养成分；康明丽等[21]研究发现，生姜精油-羧甲基纤维素钠复合涂膜液能显著降低采后草莓果实呼吸强度、腐烂指数和失质量，保持较高的草莓果实贮藏品质，如TSS和花色苷含量。本研究发现，30 μL/mL的姜油树脂能显著降低橄榄果实采后贮藏期间的果实病害指数（图2A）和果皮褐变指数（图2B），延缓橄榄果实TSS、TS、TA质量分数，VC、TP及TF含量的下降（图3），较好保持采后橄榄果实的外观颜色和营养品质。因此认为，30 μL/mL的姜油树脂处理可有效控制橄榄果实采后病害发生，较好保持橄榄果实贮藏品质。
10、20、30、40 μL/mL的姜油树脂都可有效抑制P. microspora侵染所致橄榄果实采后病害发生，其中以剂量为30 μL/mL的效果更佳。
30 μL/mL的姜油树脂处理可显著降低橄榄果实采后贮藏期间的果实病害指数和褐变指数，延缓橄榄果实TSS、TS、TA质量分数，VC、TP及TF含量的下降，较好保持采后橄榄果实的外观颜色和营养品质。
30 μL/mL的姜油树脂处理可有效控制橄榄果实采后病害发生，较好保持橄榄果实贮藏品质。因此认为，植物天然产物姜油树脂可用于橄榄果实采后安全保鲜处理。
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Effect of Ginger Oleoresin on Postharvest Decay and Storage Quality of Chinese Olive Fruits