冷却肉在冷藏过程中完成后熟，后熟使肉质变得柔软而富有弹性，鲜味氨基酸得到释放，使肉变得美味。冷却肉的安全性、营养性和质构特性均优于热鲜肉和冷冻肉，因此已经成为生鲜肉发展的必然趋势。冷却肉在生产和流通过程中虽然一直处于低温（0～4 ℃），但一些嗜冷微生物仍可以生长繁殖，如假单胞菌属（Pseudomonas）、热死环丝菌（Brochothrix）、不动杆菌属（Acinetobacter）、肠杆菌属（Enterobacteriaceae）等。低温条件下嗜冷微生物的新陈代谢速度虽然受到抑制，但大量导致冷却肉腐败变质的微生物仍可繁殖[1-2]。因此冷却肉保鲜的关键在于抑制微生物生长繁殖，可通过降低原料肉初始菌落总数以及控制贮藏温度来延长冷却肉的货架期[3]。
天然保鲜剂主要来源于动植物原料，以及利用工程菌发酵得到的产物[4]，其使用剂量低且保鲜效果好，同时具有安全、天然、高效、抑菌谱广等特点[5]。乳源抗菌肽是通过酶工程技术制备的一类活性肽，是一种新型天然绿色保鲜剂[6-7]。抗菌肽具有分子质量小、耐热性强、水溶性好、抗菌谱广等优点[8]。苏晋文[9]、王盼[10]等使用木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解山羊乳酪蛋白，得到的抗菌肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌具有很强的抑制作用。乳酸链球菌素（Nisin）由34 个氨基酸残基组成，对革兰氏阳性菌有很强的杀菌作用，但对革兰氏阴性菌、酵母菌和霉菌的抑制效果差。壳聚糖是一种天然碱性多糖，具有良好的抑菌性、成膜性、安全性和吸附性[11]，已被美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准为食品添加剂应用于食品生产加工中[12-14]。茶多酚主要功能成分为儿茶素类化合物，具有优异的抗氧化和抗菌活性[15]。丁香花蕾精油（丁香精油）的主要活性成分丁香酚具有抗菌和杀虫作用[16]。于见亮等[17]对Nisin、茶多酚和壳聚糖进行复配应用于冷却羊肉保鲜中，结果表明Nisin和壳聚糖之间存在极显著的交互作用（P＜0.01）。Li Tingting等[18]研究表明，茶多酚与Nisin、壳聚糖复合使用时能发挥协同作用，可以达到更强的抑菌效果。张慧芸等[19]研究表明，丁香精油与壳聚糖制成的复合可食用膜可有效抑制冷却肉菌落总数和高铁肌红蛋白含量的增加，同时还可以抑制冷却肉贮藏过程中脂肪氧化，显著延长冷却肉的货架期。但是冷却肉货架期得到有效延长的同时无法保持良好的色泽及组织状态，目前乳源抗菌肽结合多种天然保鲜剂应用于冷却肉保鲜及货架期模型构建的研究较少，而企业又亟需该技术的支持。
因此，本实验通过均匀试验研究乳源抗菌肽、Nisin、壳聚糖、茶多酚和丁香精油复配保鲜剂对冷却牛肉的保鲜效果，分析各天然保鲜剂之间的交互作用。利用适宜的复合天然保鲜剂处理冷却牛肉，-1～6 ℃条件下贮藏，以微生物生长动力学模型结合Arrhenius方程建立冷却牛肉的货架期预测模型，为延长和预测冷却牛肉的保鲜期提供参考。
新鲜牛肉（成年秦川牛肉）分别在5、6、11、12月清晨购于陕西省咸阳市杨凌区新康乐市场，其中5、6月购买的牛肉样品测定挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量、pH值和菌落总数，11、12月购买的牛肉样品测定菌落总数，由于夏季和冬季气温差异大，购买的样品初始菌落总数不相同；新鲜无抗西农莎能山羊乳 西北农林科技大学畜牧场。
Nisin、壳聚糖、茶多酚（均为食品级） 山东福瑞达生物科技有限公司；丁香精油 郑州雪麦龙食品香料有限公司；胃蛋白酶（3 000 U/g） 美国Sigma公司；平板计数琼脂 北京陆桥技术有限责任公司；其他试剂均为分析纯。
PB-10酸度计、JA3003型电子分析天平 德国赛多利斯公司；HH-S4A型电热恒温水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司；SW-CJ-1F型超净工作台 苏净集团；L5紫外-可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司；TGL-16G高速台式离心机 上海安亭科学仪器厂；BCD-450ZE9H型冰箱 合肥美菱股份有限公司；PYXDHS-40×50-BS-Ⅱ隔水式电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂。
1.3.1 乳源抗菌肽的制备
1.3.1.1 乳酪蛋白粗品的制备
新鲜无抗山羊乳在4 ℃、5 000 r/min条件下离心20 min脱脂，2 mol/L HCl溶液调节pH值至4.5±0.1，40 ℃水浴静置30 min沉淀酪蛋白，将酪蛋白沉淀液以5 000 r/min离心10 min去除上清液，用0.05 mol/L醋酸钠缓冲液洗涤酪蛋白沉淀2 次，每次洗涤后以4 000 r/min离心10 min，所得沉淀物即为酪蛋白粗品[20]。按凯氏定氮法（GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》[21]）测定其蛋白含量为17.36 g/100 g。
1.3.1.2 羊乳酪蛋白酶解物的制备
称取适量酪蛋白粗品，置于250 mL三角瓶中，加入少量0.1 mol/L NaOH溶液助溶，加水至100 mL（蛋白质含量为80 g/kg），沸水浴加热10 min杀菌，冷却至室温后置于37 ℃的恒温水浴锅中，待粗酪蛋白溶液中心温度与水浴锅温度一致后，调节pH值至1.5±0.1，准确加入3 000 U/g胃蛋白酶，酶解过程中用2 mol/L NaOH溶液维持pH值为1.5±0.1，酶解2 h，沸水浴加热10 min灭酶，冷却至室温后5 000 r/min 离心15 min，所得上清液即为乳源抗菌肽[10]。参考鲁伟等[22]的方法测定其活性肽质量浓度为14.94 g/L。
1.3.2 复合保鲜剂的制备
具体按表1的添加量，将乳源抗菌肽（1.3.1.2节制备所得）、Nisin、茶多酚和丁香精油加入到无菌蒸馏水中，搅拌溶解后加入壳聚糖，逐滴加入食品级冰醋酸并不断搅拌，当pH值为4.4～5.0时，壳聚糖完全溶解，此时得到均匀稳定的复合保鲜剂溶液。
表1 均匀试验设计因素与水平
Table1 Factors and levels used for uniform design
试验号 X1Nisin添加量/（g/L）X2乳源抗菌肽添加量/（g/L）X3茶多酚添加量/（g/L）X4丁香精油添加量/（g/L）1 0.20 9.7 2.5 5.5 2 0.15 8.2 4.0 10.0 3 0.35 6.0 4.0 2.5 4 0.40 4.5 2.5 5.5 5 0.50 7.5 4.5 7.0 6 0.45 9.7 3.5 11.5 7 0.25 4.5 4.5 13.0 8 0.30 7.5 2.0 13.0 9 0.40 6.0 5.0 8.5 10 0.30 9.0 5.0 4.0 11 0.25 6.7 3.0 11.5 12 0.45 8.2 3.0 2.5 13 0.15 5.2 3.5 7.0 14 0.50 5.2 2.0 10.0 15 0.20 6.7 1.5 4.0 16 0.35 9.0 1.5 8.5
1.3.3 肉样的处理
在无菌条件下，将当天购买的新鲜牛肉去除脂肪、筋膜，分割成形状规则的肉块，每块质量约50 g，随机分为16 组，每组3 块。在对应保鲜剂中浸泡3 min后沥干，放入无菌均质袋中，（4±1）℃条件下贮藏，并设置未添加保鲜剂的空白组。保鲜剂的添加按照均匀试验的拟水平法，通过U16（84）均匀试验，每组均加入22.5 g/L壳聚糖，其他保鲜剂的添加量见表1。（4±1）℃冷藏24 d后，以TVB-N含量、pH值和菌落总数为指标，确定复合保鲜剂适宜配比。之后取新鲜牛肉处理后分为2 组，每组18 块，在复合保鲜剂中浸泡3 min后沥干，放入无菌均质袋中，置于4 ℃条件下贮藏，每隔5 d检测TVB-N含量、pH值和菌落总数，验证复合保鲜剂的保鲜效果。GB 2707—2016《鲜（冻）畜、禽产品》[23]中新鲜肉的要求为TVB-N含量不超过15 mg/100 g，pH值不超过6.2，菌落总数不超过106CFU/g。
1.3.4 冷却肉货架期模型的构建
将经过复合保鲜剂处理的冷却牛肉分别置于-1、2、4、6 ℃条件下贮藏54 d，每隔6 d检测菌落总数。采用微生物生长动力学模型描述一定条件下微生物数量变化与时间的关系，一级模型方程见式（1）。
式中：t表示贮藏时间/d；y0表示初始菌落总数对数值（lg（CFU/g））；y表示t时的菌落总数对数值（lg（CFU/g））；ky表示微生物生长速率/d-1。
采用Arrhenius方程[24]描述温度与微生物生长速率ky之间的二级模型，具体表达见式（2）。
式中：k0为频率因子/d-1；EA为活化能/（J/mol）；T为热力学温度/K；R为摩尔气体常数（约为8.314 J/（mol·K））；ky是微生物生长速率/d-1。
根据式（3）通过ln ky对1/T作图，得到斜率为-EA/R的线性方程，同时得到常数k0和EA的值，则可通过式（4）得到冷却牛肉货架期（shelf life，SL）的预测模型。
1.3.5 冷却肉货架期模型的验证
取新鲜牛肉按照1.3.3节预处理后，切成45 块，随机分为3 组，每组15 块。在复合保鲜剂中浸泡3 min后沥干，放入无菌均质袋中，分别在2、4 ℃和6 ℃条件下贮藏30 d后，每隔2 d检测菌落总数，当菌落总数刚超过106CFU/g时，此时为冷却牛肉实际货架期。
1.3.6 指标测定
TVB-N含量参考GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》[25]中半微量定氮法测定。
pH值参考GB 5009.237—2016《食品安全国家标准食品pH值的测定》[26]进行测定。
菌落总数参考GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[27]中琼脂平板计数法测定。
感官评价参考GB/T 22210—2008《肉与肉制品感官评定规范》[28]进行，分别对冷却牛肉的色泽、气味和组织状态进行评分。选择5 名有感官评分培训经验的人员，按照表2要求进行评分，综合得分取各项得分的平均值。3 分以下表明冷却肉已不新鲜或变质。
表2 感官评定标准
Table2 Sensory evaluation criteria
分值 色泽 气味 组织状态5 鲜红，有光泽 鲜肉特有气味，无任何异味 弹性好，指压后立即恢复4 较鲜红，有光泽 鲜肉气味，无异味 弹性较好，指压后可恢复3 暗红，无光泽 稍有异味 弹性一般，指压后缓慢恢复2 褐红，无光泽 异味较强 无弹性，指压后凹陷不能恢复1 暗褐，无光泽 强烈腐败味 弹性丧失，组织松散
均匀试验数据使用DPS 7.55软件中均匀设计回归分析（极小值）进行处理分析，采用t检验进行差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。
复合保鲜剂的配比优化实验结果见表3。设Nisin、乳源抗菌肽、茶多酚、丁香精油的添加量分别为X1、X2、X3、X4，TVB-N含量、pH值和菌落总数分别为Y1、Y2、Y3。对TVB-N含量、pH值、菌落总数进行回归分析，得到回归方程、决定系数和显著性检验结果（表4）。根据表4可知，Y1、Y2回归方程的R2＞0.99，Y3回归方程的R2＞0.91，说明回归方程在本实验中有意义，回归方程为分别为：
通过对回归系数的检验（表4）可知，影响冷却牛肉TVB-N含量的主次顺序是X4＞X2＞X3＞X1，表明丁香精油对冷却牛肉TVB-N含量影响最大，其次是乳源抗菌肽，再次是茶多酚，而Nisin的效应最小；其中X2、X3、X4影响显著（P＜0.05），而X1影响不显著（P＞0.05）。交互作用分析可知，P（X1X2）、P（X1X3）、P（X2X3）和P（X2X4）均小于0.01，说明Nisin与乳源抗菌肽、Nisin与茶多酚、乳源抗菌肽与茶多酚、乳源抗菌肽与丁香精油之间有极显著的交互作用，P（X1X4）＜0.05说明Nisin与丁香精油之间有显著的交互作用。典型分析可知：X1＝1.00、X2＝8.00、X3＝1.00、X4＝8.00时，Y1有最小值，为5.85。将各保鲜剂编码值换算为添加量，得到复合保鲜剂的最优配比为：Nisin 0.15 g/L、乳源抗菌肽9.7 g/L、茶多酚1.5 g/L、丁香精油13.0 g/L。
表3 复合保鲜剂对冷却牛肉保鲜效果的影响
Table3 Effect of composite preservatives on total viable counts of chilled beef
试验号 Y1TVB-N含量/（mg/100 g）Y2pHY3菌落总数（lg（CFU/g））1 6.43 5.53 4.75 2 7.11 5.63 4.03 3 6.72 5.59 3.98 4 8.32 5.74 3.93 5 7.69 5.60 3.88 6 7.88 5.50 4.08 7 8.36 5.61 4.15 8 6.56 5.49 4.00 9 8.00 5.52 4.21 10 13.75 5.81 5.27 11 8.22 5.60 3.78 12 7.65 5.76 4.77 13 13.20 5.70 3.93 14 10.66 5.65 4.13 15 11.28 6.00 3.93 16 10.49 5.64 3.90
表4 回归系数及变量分析
Table4 Regression coefficients and significance test
注：*.影响显著（P＜0.05）；**.影响极显著（P＜0.01）。
回归系数 Y1Y2Y3常数 13.796 4 6.547 5 3.399 0 X1-0.678 6 -0.002 9 0.112 8 X2-1.079 1* -0.079 4 0.078 1 X3-1.037 8* -0.230 2* 0.037 6 X42.198 4** -0.026 9 0.020 9 X1-0.100 5* -0.001 9 -0.011 0 X2 2-0.065 5 -0.003 1 0.015 7 X3 2 2 0.132 3* 0.011 3 -0.000 2-0.252 1** -0.001 7 0.009 9 X1X20.330 2** 0.009 8* -0.004 5 X1X3-0.216 7** -0.004 5 -0.010 5 X1X40.184 3* -0.003 8 0.011 7 X2X30.199 6** 0.017 4* 0.018 2 X2X4-0.191 9** -0.004 4 -0.044 3 X3X4-0.049 9 0.010 9* -0.006 5 R20.999 3 0.994 3 0.911 0 X4 2
影响冷却牛肉pH值的主次顺序是X3＞X2＞X4＞X1，表明茶多酚对冷却牛肉pH值的影响最大，其次是乳源抗菌肽，再次是丁香精油，而Nisin的效应最小；其中X3影响显著（P＜0.05），而X1、X2、X4影响不显著（P＞0.05）。P（X1X2）、P（X2X3）和P（X3X4）均小于0.05，说明Nisin与乳源抗菌肽、乳源抗菌肽与茶多酚、茶多酚与丁香精油之间有显著的交互作用。典型分析可知：X1＝1.00、X2＝8.00、X3＝1.00、X4＝8.00时，回归方程Y2有最小值，为5.15。将各保鲜剂编码值换算为添加量，得到复合保鲜剂的最优配比为：Nisin 0.15 g/L、乳源抗菌肽9.7 g/L、茶多酚1.5 g/L、丁香精油13.0 g/L。
影响冷却牛肉菌落总数的主次顺序为X1＞X2＞X3＞X4，表明Nisin对冷却牛肉菌落总数影响最大，其次是乳源抗菌肽，再次是茶多酚，而丁香精油的效应最小，其中X1、X2、X3和X4影响均不显著（P＞0.05），原因可能是壳聚糖的抑菌作用较强[10]，而本实验中壳聚糖为固定因素。4 种保鲜剂之间交互作用均不显著（P＞0.05），可能是由于贮藏24 d冷却牛肉较为新鲜，各试验组菌落总数均较低，未表现出不同配比复合保鲜剂对微生物抑制作用的差异，因而交互作用未表现出来。典型分析可知：X1＝1.00、X2＝8.00、X3＝1.00、X4＝8.00时，Y3有最小值为3.27。复合保鲜剂的最优配比为：Nisin 0.15 g/L、乳源抗菌肽9.7 g/L、茶多酚1.5 g/L、丁香精油13.0 g/L。
由TVB-N含量、pH值和菌落总数回归分析可知，Nisin的单因子效应最小且不显著（P＞0.05）。冷却牛肉贮藏24 d时TVB-N含量、pH值和菌落总数均在国标要求范围内，此时冷却牛肉属于鲜肉，TVB-N含量决定系数R2最大（0.999 3），说明TVB-N含量更能反映不同配比的复合保鲜剂对冷却牛肉保鲜能力的差异性，且通过TVB-N含量、pH值和菌落总数得到的复合保鲜剂配比相同，为Nisin 0.15 g/L、乳源抗菌肽9.7 g/L、茶多酚1.5 g/L、丁香精油13.0 g/L、壳聚糖22.5 g/L。下面实验均以此复合保鲜剂配比处理的条件下进行。
2.2.1 TVB-N含量
图1 复合保鲜剂对冷却牛肉TVB-N含量的影响
Fig.1 Effect of composite preservative on TVB-N value of chilled beef
TVB-N含量是判断肉类新鲜度的重要指标，它是蛋白质经酶和细菌作用后，分解产生的氨及胺类等碱性含氮挥发性物质[29]。由图1可以看出，新鲜牛肉TVB-N含量为6.53 mg/100 g，空白组TVB-N含量在第5天达到14.69 mg/100 g，接近GB 2707—2016[23]鲜肉标准的15 mg/100 g。复合保鲜剂处理组在贮藏的前25 d的TVB-N含量增长缓慢，在贮藏25 d后，TVB-N含量快速增加，在第30天时达到12.74 mg/100 g，尚未超过GB 2707—2016鲜肉标准，说明复合保鲜剂能有效延缓TVB-N含量的增加，使货架期相对空白组延长25 d以上。
2.2.2 pH值
图2 复合保鲜剂对冷却牛肉pH值的影响
Fig.2 Effect of composite preservative on pH of chilled beef
如图2所示，冷却牛肉初始pH值为5.83，空白组pH值在贮藏0～10 d快速升高，第10天时达到6.21，超出GB 2707—2016[23]鲜肉标准。复合保鲜剂处理组pH值先降低后升高，在第5天时达到最低值5.25，随后缓慢增长，并维持在较低水平（5.3～5.5），与谢晶[30-31]、Pawar[32]等研究结果相同。pH值的变化是由于死后糖原酵解产生乳酸使pH值不断下降，随着贮藏时间延长，肌肉中的蛋白质在内源性酶及微生物的作用下分解，产生碱性氨、胺类化合物或挥发性碱导致pH值上升[33-35]。说明复合保鲜剂能明显抑制冷却牛肉pH值的升高，有效延长冷却牛肉的货架期。
2.2.3 菌落总数
图3 复合保鲜剂对冷却牛肉菌落总数的影响
Fig.3 Effect of composite preservative on total viable counts of chilled beef
微生物的生长和繁殖是导致冷却牛肉变质的最主要因素，冷却牛肉初始菌相中主要微生物是乳酸菌和假单胞菌，二者初始菌落总数相差不大，但假单胞菌生长速率更高[36]，假单胞菌和热死环丝菌是冷却牛肉的优势腐败菌[37-38]。由图3可以看出，初始菌落总数为4.56（lg（CFU/g）），可能是屠宰、加工和运输过程中未按卫生标准操作，导致冷却牛肉表面沾染大量微生物。贮藏期间，空白组菌落总数不断增加，在第5天时已超过106CFU/g，说明初始菌落总数极大地影响了冷却牛肉货架期。复合保鲜剂具有强效杀菌能力，使冷却牛肉菌落总数在0～5 d不断降低，并对微生物具有较大抑制作用，延缓了微生物生长迟滞期，使菌落总数在5～25 d缓慢增加，25～30 d进入对数生长期，微生物快速生长，在第30天时菌落总数为5.08（lg（CFU/g）），仍未超过GB 2707—2016限量，说明复合保鲜剂能相对延长冷却牛肉货架期25 d以上。
2.2.4 感官评分
图4 复合保鲜剂对冷却牛肉感官品质的影响
Fig.4 Effect of composite preservative on sensory evaluation of chilled beef
贮藏过程中，在微生物作用下冷却牛肉表面生成黏液，肌肉中蛋白质被分解使组织结构变松软，持水能力下降，分解产生氨及胺类化合物产生异味，进而腐败变质，失去食用价值[39-40]。如图4所示，空白组感官得分下降速率快，在5 d时色泽呈褐色，肌肉组织松软，有异味，感官分值为2.67 分，低于鲜肉标准分值（3 分），10 d时即色泽暗褐，散发强烈氨臭味。复合保鲜剂处理组感官分值下降缓慢，30 d时感官分值为3.27 分，还能较好保持冷却肉原有品质，感官分值明显高于空白组，说明复合保鲜剂能够有效抑制微生物生长繁殖，阻滞肌肉蛋白质分解、脂肪氧化等过程，较好地保持冷却牛肉感官品质，有效延长冷却牛肉货架期。
2.3.1 冷却牛肉货架期预测模型构建
图5 不同贮藏温度下冷却牛肉的菌落总数变化
Fig.5 Changes in total viable counts of chilled beef at different storage temperatures
如图5所示，6 ℃贮藏48 d时，冷却菌落总数已超过106CFU/g，即认为样品已不属于鲜肉。而-1、2 ℃贮藏54 d时菌落总数分别为3.88（lg（CFU/g））和4.55（lg（CFU/g）），表明样品较为新鲜。
根据一级模型方程式（1）对各温度条件下菌落总数随贮藏时间变化的数据进行回归分析，得到不同温度下微生物生长速率ky值以及决定系数R2，具体见表5。
表5 冷却牛肉在不同贮藏温度下菌落总数变化的动力学模型参数
Table5 Kinetic model parameters for total viable counts in chilled beef at different storage temperatures
理化指标 T/K y0kyR2菌落总数（lg（CFU/g））272.15 1.397 6 0.016 0 0.919 7 275.15 1.482 3 0.019 8 0.951 7 279.15 1.453 2 0.029 2 0.984 8
根据二级反应模型式（3），以热力学温度的倒数（1/T）为横坐标，微生物生长速率的对数（ln ky）为纵坐标作图，对数据结果进行回归分析，得到ln ky与1/T的线性关系如图6。
图6 变化速率常数对数与热力学温度倒数的关系
Fig.6 Linear correlation between ln kyand 1/T
经回归分析得到回归方程为：y＝-6 567.2x+19.991，回归系数R2＝0.991 6，说明此回归方程在所选温度范围内具有良好的线性关系。根据式（3）结合回归方程的斜率值和截距值，计算得出k0＝4.81×108d-1，-EA/R＝-6 567.2 K，y0＝1.6（lg（CFU/g））。将k0、-EA/R、y0值带入式（4）得到冷却牛肉货架期预测模型（式（5））。
由于GB 2707—2016[23]规定鲜肉菌落总数不超过106CFU/g，即y＝6，将其代入式（5）可得-1～6 ℃贮藏条件下冷却牛肉货架期预测模型，见式（6）。
2.3.2 冷却牛肉货架期预测模型验证
为评价所构建的-1～6 ℃贮藏条件下冷却牛肉货架期预测模型的准确性，将经过复合保鲜剂处理过的冷却牛肉，在2、4 ℃和6 ℃条件下贮藏，测定冷却牛肉实际货架期，与通过货架期模型所得预测值进行比较，以相对误差为评价标准，验证货架期模型的准确性，结果见表6。
表6 冷却牛肉在2、4 ℃和6 ℃贮藏条件下货架期的预测值和实测值
Table6 Predicted and observed shelf life of chilled beef stored at 2, 4 or 6 ℃
注：相对误差/%＝（预测值-实测值）/实测值。
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由表6可知，通过货架期预测模型得到的2、4、6 ℃贮藏温度下货架期预测值与实验得到的货架期实测值的相对误差分别为5.98%、2.66%、-2.37%，均小于6%，说明此模型可以快速、准确、有效地预测经复合保鲜剂处理过的冷却牛肉的货架期。
冷却肉的腐败变质是内源性酶、微生物以及各种理化反应共同作用的结果，其中微生物的生长繁殖对冷却肉理化和感官品质影响最大，初始菌落总数和贮藏温度直接影响冷却肉货架期[41]。天然保鲜剂绿色安全且抗菌性强，但单独使用时存在抑菌谱窄的问题，不能有效抑制某些微生物的生长繁殖，而多种天然保鲜剂复合使抑菌谱得到扩大[42]，并具备抗氧化的作用[43]，对保持冷却肉色泽具有重要作用[44]，利用保鲜剂之间的协同作用，不仅降低了各保鲜剂使用剂量，而且增强了抑菌效果[45]。He Li等[46]研究发现，采用Nisin（0.625 g/L）、茶多酚（0.313 g/L）和壳聚糖（3.752 g/L）复合保鲜剂处理冷却羊肉能有效抑制其在4 ℃贮藏过程中腐败微生物和病原菌的生长，使冷却羊肉货架期从6 d延长至18 d。章薇等[47]研究了Nisin（0.25 g/L）、茶多酚（0.5 g/L）、香辛料提取物（20.0 g/L）和抗坏血酸（0.2 g/L）复合保鲜剂对冷却鸡肉保鲜效果的影响，研究表明，复合保鲜剂可使4 ℃条件下冷却鸡肉货架期由7 d延长至21 d。Qin Yuyue等[48]研究了壳聚糖（10.0 g/L）和不同浓度茶多酚复合，通过脱气和干燥处理制成复合膜对4 ℃贮藏条件下猪肉糜的保鲜效果，研究表明，复合膜可有效减缓脂质过氧化反应和高铁肌红蛋白含量的增加，相比于对照组，该复合膜可使货架期延长6 d。研究表明冷却肉初始菌落总数对产品货架期影响显著[3]，本实验所用乳源抗菌肽复合保鲜剂处理冷却牛肉后，可明显降低冷却牛肉初始菌落总数，并在冷却牛肉表面形成一层膜，阻止微生物的侵染。冷却牛肉在冷藏过程中持水性的下降导致水分析出，水分从冷却牛肉表面渗出过程中会附带将肉表面的复合保鲜剂溶解，使得肉表面覆盖的复合保鲜剂膜破裂损失，当肉浸泡在含有复合保鲜剂的汁液中时，由于浓度梯度的存在，可能加速肉中水分的析出，这一过程可能影响复合保鲜剂的保鲜效果。
食品货架期预测模型主要有BP神经网络、威布尔危险值分析、Q10模型以及基于微生物生长动力学的一、二、三级模型[49]。冷却肉货架期预测模型的获得，一般通过测定自然污染或接种特定微生物的原料肉的菌数变化来建立模型[50]，常使用的一级模型主要有对数模型、Logistic模型、Baranyi模型和Gompertz方程等，二级模型主要有平方根模型、Arrhenius方程和响应面模型等[51]。冷却肉的腐败变质主要由微生物生长繁殖造成，贮藏温度和菌落总数的变化与冷却肉货架期密切相关；因此，通常使用菌落总数或特定腐败菌为指标建立货架期预测模型。董庆利等[50]研究采用修正的Gompertz方程和平方根模型，对猪肉中接种的气单胞菌的生长进行预测，建立了0～20 ℃贮藏温度下冷却猪肉货架期预测模型，相对误差小，模型具有较好可靠性。宋晨等[52]研究采用一级动力学模型和Arrhenius方程，以菌落总数为指标，建立了-25～25 ℃贮藏温度下冷冻羊肉货架期预测模型，该模型预测准确性高。马妍等[53]通过一级化学反应动力学模型和Arrhenius方程建立了0～8 ℃贮藏温度下河豚鱼货架期预测模型，结果表明该模型对菌落总数和TVB-N含量变化具有较高拟合度，货架期预测准确率高。本研究使用自然污染的冷却牛肉来建立货架期模型，原料肉初始菌落总数为2.63（lg（CFU/g）），经过复合保鲜剂浸泡3 min后，菌落总数降为1.60（lg（CFU/g）），因而较低的初始菌落总数使冷却牛肉货架期得到极大延长，4 ℃贮藏条件下冷却牛肉货架期可达53 d。对货架期预测模型的使用时需要注意使用条件，冷却牛肉须经过乳源抗菌肽复合保鲜剂处理，并在-1～6 ℃温度范围内贮藏，如果超出此温度范围，该预测模型可能不具有较好的符合度。
在下一步的研究中，将考虑研究天然复合保鲜剂结合冰温贮藏对冷却肉持水性的影响，并通过气调包装控制贮藏过程中气体环境，抑制微生物生长繁殖，控制蛋白质、脂肪氧化，利用低场核磁共振技术[54-55]研究复合保鲜剂处理对贮藏过程中冷却牛肉水分分布、移动性和肌肉结构变化的影响，从而进一步延长冷却肉货架期并保持良好感官品质。
冷却牛肉复合保鲜剂配比为乳源抗菌肽9.7 g/L、茶多酚1.5 g/L、丁香精油13.0 g/L、壳聚糖22.5 g/L和Nisin 0.15 g/L，（4±1）℃条件下冷却牛肉货架期比空白组延长25 d以上。Nisin与乳源抗菌肽、Nisin与茶多酚、Nisin与丁香精油、乳源抗菌肽与茶多酚、乳源抗菌肽与丁香精油之间对冷却肉TVB-N含量有显著的交互作用（P＜0.05）。Nisin与乳源抗菌肽、乳源抗菌肽与茶多酚、茶多酚与丁香精油之间对冷却保鲜肉pH值有显著的交互作用（P＜0.05）。单因素分析表明丁香精油对冷却牛肉TVB-N含量影响最大，其次是乳源抗菌肽，再次是茶多酚，而Nisin的影响最小。
使用乳源抗菌肽复合保鲜剂处理冷却牛肉，构建了-1～6 ℃范围内冷却牛肉的货架期预测模型，为SL＝2.75×10-9×exp（6 567.2/T），对该货架期模型进行预测值和实测值验证实验，其相对误差均在6%以内，说明在-1～6 ℃的范围内该模型能够准确、有效地预测冷却牛肉货架期。综上所述，天然复合保鲜剂可有效维持冷却牛肉感官品质，延长其货架期，通过货架期模型可判断冷却牛肉腐败程度，从而达到降低食品安全风险、减少经济损失、控制冷却肉安全性的目的。
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