表示，Duncan多重比较法进行差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著。花鲈（Lateolabrax maculatus）是我国主要的养殖海水鱼品种之一。每年10～11月份养殖鲈鱼开始大量上市，其中以鲜活花鲈价格最高、市场行情最好[1]；因此有必要实现花鲈由养殖基地到销售市场的保活运输。采用生态冰温无水活运法运输花鲈的研究目前鲜见报道，如能成功运用这项技术则可以显著降低花鲈运输成本，并加大运输量、扩大活鱼销售范围[2]。
生态冰温无水活运法运输活鱼的过程中，人工操作（捕捞、降温、包装、搬运、运输）会导致鱼产生一系列应激行为，造成鱼生理指标变化，甚至鱼体体表及组织产生损伤[3-4]。温度可对鱼类代谢反应起控制作用，从而影响鱼体生理生化变化[5]。肝组织是鱼体产生应激反应的主要器官，表现为肝细胞凋亡、细胞结构破坏、细胞质外流等[6]。细胞凋亡是指机体在一定的自身或外界条件刺激下，细胞为维护机体而结束自身活性的过程。细胞凋亡受到半胱氨酸蛋白酶家族严格调控；因此，检测细胞凋亡酶活性变化可反映鱼体组织的受损伤程度[6-11]。在正常情况下，半胱氨酸蛋白酶家族（Caspase）处于非活化的酶原状态，凋亡程序被触发后酶活性明显升高，随后发生凋亡蛋白酶的层叠级联反应；其中，Caspase-3最后被激活，它是细胞凋亡的执行者[8]。鱼前蛋白转化酶枯草溶菌素前蛋白转化酶枯草溶菌素-9（protein convertase subtilisin kexin type 9，PCSK-9）是层叠级联反应中的一员，参与细胞凋亡，同时，还可影响鱼体细胞周期、炎症和应激反应等[10]。采用生态冰温无水活运活鱼必须经历从常温开始的降温过程，而降温速率是影响活鱼无水保活运输成活率的关键因素；鉴于此，本实验通过对花鲈肝组织Caspase-3活力、丙二醛（malonaldehyde，MDA）浓度、血清中PCSK-9、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）活力变化研究，探讨无水运输过程中不同降温速率对花鲈肝组织造成的影响，为其保活运输工艺的开发提供参考。
花鲈购自上海当地水产品市场。挑选体质健康、无外伤、鳞片完整、大小基本一致（长约40 cm）的活花鲈作为实验材料。
实验用水由经颗粒活性炭过滤后曝气的自来水和海盐配制而成，实验开始前1 d配制，连续曝气24 h后用于实验。水温22～23 ℃、盐质量分数1.6%～1.7%、溶解氧质量浓度4～6 mg/L、pH 7.5～8.5[10]。
Caspase-3活力检测试剂盒、MDA检测试剂盒、PCSK-9酶联免疫吸附检测试剂盒及AST、ALT检测试剂盒 南京建成生物工程研究所。
全自动循环冷水机 广东海利集团；LX-100VTR模拟运输振动台 上海鲁轩仪器设备厂；SH-1000Lab-全波长酶标仪 北京宏昌信科技有限公司；F2640型多点温度采集仪 美国Fluke公司；5810R高速冷冻离心机上海艾测电子科技有限公司。
1.3.1 样品前处理
在养殖池（密度：20 尾/m³）中进行周期饥饿驯化[12]，喂食1 d饥饿3 d（持续2 个周期），早晚各喂食1 次，投喂鱼体质量10%的饲料[13]，并接受日常光照；第3周期饥饿开始的第1天将花鲈食物诱捕（单条捕捞）进暂养箱（密度：1 尾/50 L），禁食暂养6 h[14-15]；再对鱼进行冷驯化（冷水机分别按照1、3、5 ℃/h降温速率将暂养箱中水温从22～23 ℃降至临界温度4 ℃）对鱼进行冷驯化[16-18]（此时鱼体呼吸频率（24±3）次/min，鱼体表现为失去平衡、鱼腹朝上、裂鳃、应激反应迟钝、呼吸极不规律）。在冷驯化过程中，随着水温降低，鱼呼吸速率明显减慢，在触及反应十分微弱后捞出，放于泡沫箱（23 cm×45 cm×13 cm）内的湿木屑上（4 ℃、盐质量分数1.6%～1.7%的水润湿1 h后沥干），然后装入塑料袋内（1 箱/袋），将塑料袋内空气排出，放入CO2吸收药包、冰袋（不与鱼接触）后充入氧气，扎紧袋口后，放入振动台上大保温箱内[19-20]。
1.3.2 模拟汽车中长途公路运输
振动台上进行室内模拟运输实验；运输过程：B级路面（80 km/h）1 h→A级路面（100 km/h）5 h→B级路面（80 km/h）2 h；运输总时间8 h（运输时间由预实验确定）；总路程740 km[21]。模拟运输8 h结束后，打开包装，取出鱼，放入22～23 ℃养殖水温中直接唤醒。
本实验是通过物理降温的方式诱导花鲈休眠，以达到无水保活的目的。实验共分为3组，每组样品30 条。花鲈生理指标检测时间点为：运输开始0 h、运输1 h、运输2 h、运输8 h、8 h唤醒后；每个测试点随机选取3 尾鱼进行指标测试；以养殖池中饥饿驯化过，未经降温、运输操作的花鲈为对照组（CK组）；每组剩余10 尾用于记录花鲈运输后各降温速率处理组的唤醒时间，以及唤醒后8 h和1、2 d时的死亡率。
1.3.3 指标测定
花鲈经木棒敲击致死，称质量和量体长后，采用1 mL一次性医用注射器（预先用10 mg/mL肝素钠溶液润洗）尾部静脉取血，采取的血样在4 ℃冰箱放置2 h后，4 ℃、10 000 r/min离心5 min，上清液即为制备的血清；取血后的鱼置于冰盘上，解剖出鱼肝脏，血清和肝脏均迅速存放于-80 ℃冰箱。
1.3.3.1 肝组织中Caspase-3活力、MDA浓度的测定
分别采用Caspase-3活力检测试剂盒、MDA检测试剂盒测定肝组织匀浆中的Caspase-3活力/（U/L）和MDA浓度/（nmol/L）。
1.3.3.2 血清中PCSK-9、AST、ALT活力的测定
采用PCSK-9酶联免疫吸附检测试剂盒和AST、ALT检测试剂盒分别测定血清中PCSK-9、AST、ALT活力，单位为U/L。
应用SPSS 19.0软件对实验数据进行统计分析，结果以表示，Duncan多重比较法进行差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著。
细胞凋亡检测是组织发生损伤时的常规检测。Caspase-3在细胞受到刺激、损伤或接到死亡信号指令等信号时被激活，活化的Caspase-3可通过水解特异性蛋白底物从多方面促进细胞凋亡的发生，是凋亡的关键执行者[22-25]。CK组Caspase-3活力为（1.44±0.17）U/L。如图1所示，与CK组相比，各降温速率处理组在运输0 h时，肝组织中Caspase-3活力明显升高（P＜0.05），且不同降温速率处理组之间差异明显。随着运输时间的延长，3 个不同降温速率组的Caspase-3活力不断增强，运输结束后Caspase-3活力呈下降趋势，说明运输8 h唤醒后花鲈肝组织细胞凋亡现象减弱。降温结束后（运输0 h），1 ℃/h降温处理组Caspase-3活力显著高于3、5 ℃/h降温处理组（P＜0.05），这是可能是由于降温处理时间过长，环境刺激肝组织细胞，导致Caspase-3活力强。3 ℃/h降温处理组Caspase-3活力显著低于1、5 ℃/h降温处理组（P＜0.05），这可能是由于3 ℃/h降温速率有效地降低了鱼体的氧化应激，因氧化应激诱导的细胞凋亡减少，Caspase-3活力降低。徐瑾等[26]研究发现，超低温保存中的氧化应激不仅可以直接造成细胞损伤，也可诱导细胞凋亡。5 ℃/h降温处理组Caspase-3活力低于1 ℃/h降温处理组（P＜0.05），可能是由于该组降温速率快，处理时间短，低温抑制了Caspase-3活力。由此可知降温速率慢会导致Caspase-3活力升高，从而引起肝组织细胞发生凋亡。
图1 降温速率对花鲈无水活运过程中肝组织Caspase-3活力的影响
Fig.1 Effect of cooling rate on caspase-3 activity in liver tissue of Lateolabrax maculatus during live transportation without using water
图2 降温速率对花鲈无水活运过程中肝组织MDA浓度的影响
Fig.2 Effect of cooling rate on MDA concentration in liver tissue of Lateolabrax maculatus during live transportation without using water
在运输环境下，鱼类会产生过量的氧自由基，引起脂类、蛋白质和核酸等大分子过氧化，其中脂质过氧化对机体的损伤最大，脂质过氧化产生的MDA等物质会破坏生物体细胞结构和功能。肝脏是鱼体抗氧化反应的主要器官，肝组织氧自由基生成增多是诱导凋亡发生的重要原因。有研究表明，肝组织内MDA含量与肝实质细胞凋亡数量有显著的正相关关系[27]。CK组MDA浓度为（8.38±0.73）nmol/L。如图2所示，降温结束后，3 个不同降温速率组的MDA浓度增加，且随着运输时间的延长，MDA浓度不断增加，运输结束后，唤醒过程使MDA浓度下降（P＜0.05）。运输过程中3 ℃/h降温处理组肝组织内MDA浓度显著低于1、5 ℃/h降温处理组（P＜0.05），这表明3 ℃/h降温有效降低了鱼体的氧化应激。不同降温速率导致无水活运过程中花鲈肝组织产生剧烈脂质过氧化，造成肝组织细胞大量凋亡与损伤，这可能也是花鲈无法长时间活运的主要原因。与运输8 h比较，唤醒后花鲈的肝组织内MDA浓度呈下降趋势，但依然很高，表明无水活运过程对花鲈肝脏的损伤是不可逆的。
图3 降温速率对花鲈无水活运过程中血清PCSK-9活力的影响
Fig.3 Effect of cooling rate on serum PCSK-9 activity of Lateolabrax maculatus during live transportation without using water
PCSK-9可进入体循环影响血脂水平，还可参与细胞的凋亡[28-29]。研究发现PCSK-9被激活后，细胞凋亡率也有所升高，其机制可能是通过切割Caspase-3前体，从而激活Caspase-3的活力，发挥促使细胞凋亡的作用[30-34]。CK组PCSK-9活力为（0.095±0.570）U/L。如图3所示，运输0 h时，3 个降温速率处理组花鲈肝组织Caspase-3活力较CK组均增高，且5 ℃/h降温处理组花鲈血清中PCSK-9活力显著低于1、3 ℃/h降温处理组（P＜0.05）；这可能是由于降温速率快，温差大抑制了花鲈血清中PCSK-9活力。运输2 h，3 ℃/h降温处理组花鲈血清中PCSK-9活力显著低于1、5 ℃/h降温处理组（P＜0.05），5 ℃/h降温处理组呈现骤然增高的值，同时偏差较大，不排除取样时鱼体样本自身原因；PCSK-9参与了花鲈的细胞凋亡，这个过程中通过消耗PCSK-9激活Caspase-3的活力，故而血清中PCSK-9活力在运输过程中呈现较低水平。运输8 h后，唤醒阶段3、5 ℃/h降温处理组花鲈血清中PCSK-9活力明显增高，这可能是由于运输结束后使用常温养殖水直接唤醒，再次诱发了鱼体产生应激。
图4 降温速率对花鲈无水活运过程中血清AST（A）、ALT（B）活力的影响
Fig.4 Effect of cooling rate on serum AST (A) and ALT (B) activity of Lateolabrax maculatus during live transportation without using water
正常情况下花鲈血清中AST、ALT活力很低而且含量相对稳定，但当肝脏受到损伤时血清中AST、ALT活力会升高，故血清中AST、ALT活力可以反映肝细胞损伤和代谢程度，被用来作为确认肝功能是否损伤的最具特异性并广泛使用的指标[35]。CK组AST、ALT活力分别为（92.19±3.23）、（53.29±2.46）U/L。如图4A、B所示，运输0 h时，1、3、5 ℃/h降温处理组花鲈血清中AST、ALT活力明显高于CK组，表明降温会对鱼体的肝脏造成损伤。何蓉等[36]研究不同温度无水活运中华鳖，发现低温造成AST活力升高，且随运输时间延长，AST活力有所下降，与本研究结果相一致。3 ℃/h降温处理组花鲈血清中AST、ALT活力明显低于1、5 ℃/h降温处理组（P＜0.05），表明3 ℃/h降温时，因降温处理时间短、温差小能够适当缓解花鲈因为运输操作造成的肝脏损伤。运输8 h的过程中，3 组花鲈血清中AST、ALT活力均呈升高趋势，其中运输8 h和唤醒处理后，1 ℃/h降温处理组花鲈血清中AST、ALT活力均显著低于5 ℃/h降温处理组（P＜0.05），且5 ℃/h降温处理组ALT活力升高速度快（P＜0.05），表明降温速率快会导致鱼体肝脏组织受损加重。运输8 h后，唤醒过程中3 ℃/h降温处理组花鲈血清中AST活力较运输过程中的增长减缓（P＜0.05），5 ℃/h降温速率处理组ALT活力降低，1 ℃/h降温速率处理组AST、ALT活力仍较高。这可能是由于长时间低温无水环境，机体代谢逐渐以无氧呼吸为主，体内抗氧化系统出现问题，导致“唤醒”后的花鲈肝脏恢复缓慢或已产生不可修复的损伤。
将生态冰温无水活运法运输后的花鲈直接放入常温（22～23 ℃）水中，可以观察到鱼尾摆动幅度越来越大，鱼鳃开始不规律地开闭，呼吸频率越来越大，逐渐接近正常水平，过程大约需20 min左右（1、3、5 ℃/h降温处理并无水活运后花鲈唤醒时间分别为19、1 min和16 min）（表1），鱼体恢复正常的游动。
表1 唤醒后时间对不同降温速率处理组无水活运花鲈死亡率的影响
Table1 Mortality rate of Lateolabrax maculatus with precooling treatment at different cooling rates%
?
各组花鲈在常温水中唤醒8 h后均出现死鱼现象，如表1所示，1 ℃/h降温处理组花鲈在运输后1 d死亡率就高达50%，2 d死亡率达到70%；随着唤醒后时间的延长，1 ℃/h降温处理组花鲈死亡率不断升高，3 ℃/h降温处理组花鲈死亡率在3 个降温处理组中最低，但与业界期望值还有差距。这可能是本实验操作“唤醒”步骤时采用了常温快速唤醒，花鲈已经过降温、包装、运输过程中的应激，体内能量已不足，免疫系统紊乱，适应环境能力差，将此时的花鲈放入与之前运输箱内环境差异较大的地方，导致花鲈再次应激，因而死亡率高。
花鲈可以通过低温诱导休眠的方式进行无水保活，无水活运8 h，常温唤醒后鱼体可回到正常状态并存活一段时间，这项技术可用于花鲈一定距离的无水活运。运输0 h，1、3、5 ℃/h 3个降温速率处理组的花鲈肝组织Caspase-3活力、MDA浓度及血清中PCSK-9、AST、ALT活力指标数值较CK组均增高，运输结束后，唤醒过程使Caspase-3活力和MDA浓度下降，PCSK-9活力增高，ALT活力增加减缓或降低。1 ℃/h降温处理组花鲈唤醒时间长，唤醒后2 d死亡率达到70%，不利于实现保活运输价值。3 ℃/h降温处理组肝组织中Caspase-3活力、MDA浓度和血清中ALT、AST活力、养殖水唤醒后死亡率显著低于1、5 ℃/h降温处理组（P＜0.05），且显著高于CK组（P＜0.05）；因此3 ℃/h降温处理后无水活运对花鲈肝组织损害低。
建议将花鲈通过低温诱导休眠的方式进行无水保活的降温速率设定为3 ℃/h，同时建议今后可在暂养密度、包装条件尤其是“唤醒”工艺等参数优化方面开展进一步深入研究，提高运输后的存活率。目前研发的生态冰温无水活运法可用于中短途花鲈的保活运输。
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Effect of Precooling Treatment on Survival ofLateolabrax maculatusduring Live Transportation without Using Water