蛹虫草(Cordyceps militaris (L.) Link)是我国重要的食药用菌之一,隶属于子囊菌门(Ascomycota)粪壳菌纲(Sordariomycetes)肉座菌亚纲(Hypocreomycetidae)肉座菌目(Hypocreales)虫草科(Cordycipitaceae)[1],是虫草属(Cordyceps)的模式种[2]。蛹虫草与冬虫夏草有相似或相同的化学成分和药理作用,并已在1986年被人工驯化成功[3],故可作为冬虫夏草的良好替代品[4]。蛹虫草活性成分主要包括:1)核苷类,如虫草素、腺苷、腺嘌呤和次黄嘌呤等[5-7];2)虫草多糖[8];3)虫草甾醇和糖醇类物质,如虫草酸(又名D-甘露醇)、麦角甾醇和胆固醇等[6];4)酶类,如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)[9]、纤维蛋白溶解酶[10]和溶栓酶等[8,11]。同时,蛹虫草具有抗炎[12]、抗氧化[13]、抗肿瘤[14-15]、免疫调节[16]、抗菌、抗细胞纤维化、改善低血糖症、降血脂、抗艾滋病、保护神经、保护肝脏、肾脏和肺等多种作用[17-18]。蛹虫草早期的使用与研究多集中在亚洲,并且主要集中在优化培养基与培养条件、提高其活性产物产量上[19-23]。近年来,蛹虫草在西方国家也开始受到关注,并作为非处方药使用。2005年4月,蛹虫草被正式收录于《中华人民共和国药典》,2009年3月被正式批准为新资源食品[24],2014年10月改称为新食品原料[25]。蛹虫草是目前公认的食药用虫草之一,在我国已经形成了一个巨大的产业,估计年产值可达100亿 元人民币[26-27]。
鉴于蛹虫草重要的食药用价值和巨大的应用前景,其已成为近年来人们研究的热点。随着基因组技术的普及和后基因组时代的到来,关于蛹虫草分子生物学方面的研究和技术越来越多,本文主要从蛹虫草遗传多样性、分子遗传学、基因组学、转录组学和蛋白质组学等方面介绍蛹虫草相关研究现状,以期为蛹虫草在分子生物学研究、人工栽培中存在的菌种退化问题以及虫草素代谢途径等的研究提供有力依据。
蛹虫草多生长在温带、低海拔的林地,地理分布广泛[28],北美、南美、欧洲和亚洲都有分布[29],在我国分布于辽宁、吉林、黑龙江、内蒙古、甘肃、西藏、陕西、河北、山东、安徽、浙江、福建、广东、广西、湖北、四川、贵州、云南和台湾[30-31]。蛹虫草寄主范围广泛,包括鳞翅目12 个科、鞘翅目3 个科、膜翅目1 个科和双翅目1 个科昆虫的蛹、幼虫或成虫[28,32]。
研究发现不同产地蛹虫草菌株间的遗传分化程度较低,这与不同产地冬虫夏草种内具有较高的遗传分化程度不同[33]。Sung等[34]利用随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)对韩国11 个地点的72 株蛹虫草菌株进行遗传关系分析,结果发现其平均遗传距离均小于0.221,11 个种群间没有遗传关系。Wang Lei等[35]基于nrDNA ITS序列分析比较了英国、中国、日本、韩国和挪威地区蛹虫草菌株的遗传多样性,发现其遗传分化程度很小(Kimura双参数遗传距离不超过0.010)。但也有相反的研究结论,Yuan Feng等[36]利用表达序列标签-简单序列重复标记(expressed sequence tagssimple sequence repeats,EST-SSR)技术分析不同地理来源的蛹虫草的种群遗传分化程度时发现基因分化系数为0.450,非加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA)的树状图分析以及相关性验证均表明其遗传多样性高与地理距离和地理来源无关,推测种群间高多样化水平可能是由中国的森林砍伐和森林碎片化造成的。李挺等[37]利用目标起始密码子多态性(start codon targeted polymorphism,SCoT)分子标记技术对中国不同地区来源的27 株蛹虫草菌株进行遗传多样性分析,发现蛹虫草菌株间的遗传多样性较高(遗传相似性系数在0.383~0.933之间),通过UPGMA法和主坐标分析法分析发现,菌株多样性与其来源有一定的相关性。这提示除了常用的ITS rRNA、RAPD和EST-SSR等分子标记,SCoT分子标记也可用于蛹虫草遗传多样性的研究。因此,蛹虫草种内遗传多样性特征仍不清晰,需要进一步扩大菌株样品量和筛选合适的、有代表性的分子标记。
已有多项研究证明正常菌株和退化菌株之间存在明显的遗传差异[38-39]。菌种退化是蛹虫草人工栽培中一个常见且难解决的问题,主要表现为菌种使用一段时间后子实体形成能力下降、原基减少、产孢能力大幅度上升或下降、培养周期变长、子实体生长受阻[40-41]、不长子实体或只有极少量子实体产生[42]。李美娜等[38]利用限制性内切酶片段长度多态(restriction fragment length polymorphism,RFLP)和RAPD方法对野生驯化蛹虫草及其退化菌株进行了基因水平的分析,表明两者在DNA水平上已经产生了明显的遗传差异。李美娜[43]还分析了野生菌株与退化菌株的酯酶、苹果酸酶和细胞色素酶等8 种同工酶,发现退化菌株的4 种同工酶不表达或表达量很低。李闽锋等[39]利用RAPD分子标记的方法对正常菌株与退化菌株进行了遗传多样性分析,结果发现其中有两对引物对6 个菌株的扩增谱带有明显的特异性,表明正常菌株与退化菌株间存在遗传差异。以上研究一定程度上证明了蛹虫草发生了较为频繁的遗传重组,验证了准性生殖理论。
菌物菌株的退化现象已被证实与细胞中的活性氧积累有关[44]。Xiong Chenghui等[45]利用基因工程的手段,克隆了模式菌物构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的抗氧化酶——谷胱甘肽过氧化物酶编码基因gpxA,通过基因敲入方法使其在两株不同的蛹虫草(正常产生子实体的Cm01菌株和在不同培养基上丧失了子实体生长能力的Cm04菌株)中持续表达[44]。过表达gpxA基因后,蛹虫草菌株内谷胱甘肽过氧化物酶总酶活力提高,清除细胞内活性氧的能力提高,退化菌株Cm04恢复子实体结实能力,且其中1 株转化株在继代培养10 代之后仍可产生子实体,原本就正常产生子实体的Cm01菌株仍然保持良好的子实体生长能力[44]。该研究进一步证明了菌种退化与菌丝氧化胁迫有关联性,但其中的因果关系仍有待进一步的研究[4]。
分子遗传学是研究遗传信息大分子的结构与功能的科学,着重研究遗传信息大分子在生命系统中的储存、复制、表达及调控过程[46]。
菌物分子遗传学研究需要一个高效的转化体系。农杆菌介导的遗传转化方法是目前实现菌物遗传转化应用最广泛的方法之一,该方法具有操作简单、受体范围广、转化效率高、单拷贝率高以及突变体遗传稳定等特点[47-48]。Zheng Zhuangli等[49]于2011年成功建立和优化了蛹虫草农杆菌介导的转化(Agrobacterium tumefaciensmediated transformation,ATMT)体系,其中农杆菌AGL-1中携带载体pATMT1,转化效率为每1×105个分生孢子产生30~600 个转化子,同时发现在其预培养或共培养过程中都无需额外补充乙酰丁香酮。这一体系的建立为从分子水平上更好地研究蛹虫草提供了技术支持。基于此,Jiang Keqing等[50]利用蛹虫草的ATMT体系方法筛选了一个具有快速子实体分化功能且高产的插入突变菌株g38,并在其中发现一个单拷贝基因Rhf1参与蛹虫草子实体的产生。该基因编码菌丝形成蛋白,利用T-DNA插入到野生菌株JM4中破坏了基因Rhf1功能,而突变菌株g38中没有检测到Rhf1。为了进一步证明Rhf1的功能,Jiang Keqing等[50]利用ATMT技术将构建好的Rhf1-RNAi质粒和过表达载体转入野生型JM4菌株中。在Rhf1-RNAi突变体库中找到了快速子座分化和能产生更大子实体的菌株。而过表达的突变体JM-OERhf1既产生子座,又产生子实体。回复突变株38-OERhf1的生长特性与野生型菌株JM4相似。这些结果表明基因Rhf1参与蛹虫草子实体产生。Zheng Zhuangli等[51]同样利用ATMT技术建了一个蛹虫草突变体库,并利用退化的特征筛选突变体,最终根据体内、体外子实体的产生和虫草素的形成情况筛选了含单拷贝T-DNA的6 个突变体。结合热不对称交错聚合酶链式反应(thermal asymmetric interlaced-polymerase chain reaction,TAIL-PCR)技术鉴定突变体T-DNA侧翼序列,结合生物信息学方法鉴定出了6 个参与子实体产生与虫草素形成的基因,其中ATP依赖的解旋酶、细胞色素氧化酶亚基I和泛素样激活酶参与体外人工子实体的形成,丝氨酸/苏氨酸磷酸酶参与寄主体内子实体的形成,葡萄糖甲醇胆碱氧化还原酶和端粒逆转录酶参与虫草素的合成。
除了农杆菌介导的遗传转化体系,茅文俊等[52]还建立了一种适合蛹虫草的基因枪转化技术。基因枪转化技术又称为生物弹道技术或微粒轰击技术,是一种将包裹了DNA的球状金粉或者钨粉颗粒通过火药爆炸或者高压气体加速手段直接送入完整的组织或者细胞中的技术[53]。其多用于植物,现在也有研究将其用于菌物的遗传转化[54]。该方法的优点为无需制备原生质体和农杆菌介导转化,操作较为简单。茅文俊等[52]采用蛹虫草野生型菌株为材料,以金粉包裹的质粒pdht-gpda-GFP-bar作为微弹,运用基因枪法转化,经草铵膦抗性筛选后,结合PCR鉴定、Southern印迹杂交以及绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)技术,成功获得两个遗传稳定的转化子Gfp2和Gfp3。这验证了基因枪法可以应用于菌物——蛹虫草,从而建立一种简单有效的遗传转化方法。
蛹虫草两种遗传转化体系的建立为蛹虫草基因功能鉴定提供了良好的基础,是目前蛹虫草研究中最为常用的遗传转化方法,将有助于今后鉴定蛹虫草未知基因的功能、寻找表型相关的基因等,可根据其优缺点按照实际需求选用。
DNA甲基化是一种在真核生物中基本的表观遗传学机制,但在不同类群中其模式和作用各不相同[55]。在菌物中,DNA甲基化对多样化的生物过程有多种影响[56]。然而,在菌物有性阶段其功能尚不清楚。蛹虫草容易进行有性生殖,为了解有性阶段中的表观遗传过程提供了一个非常丰富的模型。Wang Yulong等[57]利用基因组亚硫酸盐测序技术分析蛹虫草的单碱基分辨率甲基化谱来评估蛹虫草在有性阶段的DNA甲基化。结果表明,大约0.40%的胞嘧啶发生了甲基化,与在无性阶段的DNA甲基化水平(0.39%)类似,DNA甲基化在菌物发育期间经历了整体性的重组[57]。转录组测序技术分析表明蛹虫草中不同的差异甲基化区域与在菌物有性阶段起作用的基因无相关性。这些结果对蛹虫草有性生殖过程中DNA甲基化给出了较全面地描述,也证明了和高等动植物相比[58],菌物中的DNA甲基化可能并不是必须的,这将有助于未来更好地研究蛹虫草的表观遗传学。
Zheng Peng等[59]于2011年首次破译了蛹虫草的全基因组,组装后基因组大小为32.2 Mb,GC含量为51.4%,含7 条染色体,范围在2.0~5.7 Mb之间[60];基因组中共含有9 684 个蛋白编码基因,超过63%的编码基因在菌丝体和子实体发育阶段表达,大约16%的编码基因(1 547 个)参与菌物-昆虫的相互作用,没有发现已知对人类有害的编码菌物毒素的同源基因。蛋白质编码基因中13.7%为种特异性的基因,明显高于罗伯茨绿僵菌(Metarhizium robertsii,4.8%)和蝗绿僵菌(M. acridum,3.5%)。运用比较基因组学与进化基因组学分析手段,发现蛹虫草的出现较绿僵菌早约1.3亿 年,各自独立进化而具有杀虫特性,但表现出协同进化的特点,与其他菌物相比,蛋白酶和几丁质酶等用于昆虫体壁降解的蛋白质家族表现出明显的扩张现象。Zheng Peng等[61]利用种系基因组学分析表明,昆虫病原菌物已进化多次,蛹虫草由菌物寄生菌或植物内生菌分化而来。相较于植物病原菌和腐生菌,虫草属菌物都显示出了蛋白酶和几丁质酶的特征性基因组扩张现象,两种酶的作用都是帮助菌物分解侵入昆虫表皮。这也印证了蛹虫草的全基因组数据结果,提示这两种酶的扩张现象与蛹虫草的致病策略有关,其主要是通过降解昆虫体壁侵入虫体,然后进行侵染。Staats等[62]研究了蛹虫草比较基因组,发现蛹虫草基因组大小比罗伯茨绿僵菌(39.04 Mb)、蝗绿僵菌(38.05 Mb)和金龟子绿僵菌(M. anisopliae,38.5 Mb)等其他病原菌物要小(表1)。蛹虫草含2 245 个独有蛋白质编码基因,占蛹虫草中全部蛋白质编码基因的23.2%,相较于同为病原菌物的蝗绿僵菌(875 个)、金龟子绿僵菌(690 个)和罗伯茨绿僵菌(603 个),其种特异性基因的数量最多,这和Zheng Peng等[59]的研究结果一致。4 种菌物中共有蛋白质26 224 个,占蛋白质总数的62.64%,相较于其他3 种病原菌物,蛹虫草的种特异性蛋白质数量最少(141 个),但具体原因还有待于进一步研究。
表1 蛹虫草和其他病原菌物的原始基因组特征比较
Table1 Comparison of original genome features between Cordyceps militaris and other pathogenic fungi
注:B. bassiana.白僵菌(Beauveria bassiana);O. sinensis.冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)。
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基因组测序只找到一个单一的交配型基因(mating type gene,MAT)说明蛹虫草的有性生殖类型为异宗配合,但单交配型菌株也能够长出子实体[59]。蛹虫草有两种交配型基因:MAT1-1和MAT1-2,其是调控菌物有性生殖的一类重要转录因子,该两组类等位基因相互协同完成菌物的有性生殖[66]。因此,交配型基因对研究子囊菌系统进化关系、有性生殖以及小种分化差异等方面有着重要的意义。蛹虫草的两组交配型基因现已克隆成功,Cong Weiran等[67]利用TAIL-PCR技术克隆了MAT1-1,其核苷酸序列总长度为5 000 bp,包含两个基因:MAT1-1-1和MAT1-1-2。MAT1-1-1基因由1 480 bp的核苷酸组成,编码456 个氨基酸,还包含一个被两个内含子间隔的保守Alpha-box结构域。MAT1-1-2基因由1 066 bp的核苷酸组成,编码377 个氨基酸。魏静[68]利用巢氏PCR和染色体步行方法克隆了MAT1-2-1基因,其核苷酸序列总长度为8 580 bp,编码239 个氨基酸。这两种基因可作为蛹虫草的分子标记,为早期鉴定可产生子实体菌株、避免大规模的经济损失提供了可能。
虫草素是蛹虫草中最重要的活性成分之一[20],蛹虫草的全基因组测序和数据分析工作的完成,为从分子水平上解析虫草素的生物合成途径提供了可能,虫草素生物合成涉及多基因的表达和调控,开展虫草素生物合成相关基因研究,有助于从分子水平了解虫草素生物合成的调控机制,为通过基因操作提高虫草素的产量提供依据。目前,该方面的研究取得了一些新的进展。莫红丽等[69]使用诱变剂对蛹虫草菌株进行诱变,筛选虫草素高表达菌株,在确定该突变稳定可遗传的基础上,采用抑制消减杂交技术,从基因水平上对虫草素表达产生的差异进行分析,以突变型(高表达虫草素的菌株)作为检测子,以野生型(未作诱变处理的出发菌株)作为驱动子,经过消减杂交后得到了一组正调控基因片段的克隆,并对该组克隆进行了序列测定,克隆出7 个虫草素生物合成相关的序列,分别命名为chcs1、chcs2、chcs3、chcs4、chcs5、chcs6、chcs7,这些序列均为蛹虫草中首次报道,但是它们的具体功能有待进一步研究。叶小舟等[70]通过构建含有上述基因的高效植物表达转化载体,增加菌体内生物合成基因拷贝数,以提高虫草菌表达虫草素的含量,并申请了专利。Wang Chengshu等[71]在蛹虫草全基因组研究的基础上,通过与模式生物构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的比较基因组分析,结合基因敲除、异体表达和代谢分析等技术手段,在蛹虫草中发现了一组虫草素的合成基因簇,包括Cm1和Cm2和/或Cm3,分别对应构巢曲霉中的同源基因An1、An2和/或An3。Wang Chengshu等[71]还提供了一种能够实现虫草素生物合成的方法,即用虫草素生物合成相关基因(包括蛹虫草的Cm1和Cm2基因,或包括构巢曲霉的An1和An2基因)转化宿主细胞,使之生产虫草素。这一研究涉及蛹虫草代谢产物虫草素的合成基因簇的鉴定和应用,推进了虫草素生物合成的研究。但关于虫草素完整的生物合成代谢通路还未建立,这还是今后有待深入研究的重点。
除了基因组,线粒体基因组也具有自己特定的基因组成、遗传密码和复制方式,是研究物种起源与进化的有力工具[72]。Sung[73]于2015年报道了蛹虫草线粒体基因组,全长33 277 bp,包含14 个蛋白质编码基因、2 个rRNA亚基和27 个tRNA。核酸由36.98%的腺嘌呤(A)、26.23%的胸腺嘧啶(T)、15.21%的鸟嘌呤(G)和11.59%的胞嘧啶(C)组成。蛹虫草线粒体DNA包含共8 个Group I的内含子,总长为11 052 bp,其中4 个内含子包含在rnl基因中。因蛹虫草线粒体DNA具有较快的进化速率,现已开始被广泛应用于进化、遗传漂变、系统发育、种群遗传、杂交以及生物地理学等方面的研究。张永杰等[74]利用线粒体基因组,通过PCR扩增和序列分析,比较了20 个蛹虫草菌株在12 个线粒体DNA片段和3 个细胞核DNA片段上的序列变异。发现蛹虫草在线粒体DNA上的变异水平高于核DNA,主要表现为线粒体基因内含子的插入缺失多样性和较多的碱基变异位点,不同线粒体DNA片段的变异水平也有差异,而且内含子编码的蛋白质比外显子编码的蛋白质更易发生氨基酸的改变。通过增加使用的分子标记数目,其所揭示的遗传多样性程度也在逐渐提高,共找到了6 个线粒体DNA位点用于今后蛹虫草遗传多样性或群体遗传结构的分析。这为更好地筛选蛹虫草线粒体基因组中的分子标记提供了良好的支持。
综上所述,蛹虫草基因组和线粒体基因组的破译以及比较基因组的研究为深入研究蛹虫草活性成分代谢途径及其有性生殖的分子调控机理等奠定了良好的基础。这一系列研究将大力推进蛹虫草分子方面的后续研究。
转录组是特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下转录出来的所有RNA的集合,包括mRNA、rRNA、tRNA及非编码RNA;其狭义上指所有mRNA的集合[75]。转录组学研究为人们开启了基因功能研究的大门,已经成为研究植物、动物以及微生物较为常规的手段[76-77]。但关于蛹虫草转录组学方面的研究较少,而且大部分由我国学者报道。Xiong Chenghui等[78]采用EST分析技术,对不同培养条件及不同发育阶段的蛹虫草进行了研究,构建了4 个cDNA文库,分别代表蛹虫草液体培养阶段、人工培养基上产生子实体的早期和末期阶段以及注射蚕蛹产生子实体的末期阶段,挑选5 000多个克隆子进行了测序。组装后共获得1 341 个非重复序列基因(unigene),包括454 个重叠群和887 个单条序列。比较发现4 个文库间的基因转录差异显著,仅2.1%的unigene是共有的。利用基因本体论分析(gene ontology,GO)进行基因注释分析,发现不同文库间有不同的转录表达模式。和有性阶段相比,蛹虫草菌丝体在无性阶段中特异性地上调了更多细胞代谢、能量代谢以及压力应答相关的基因,还发现在人工培养基和注射蚕蛹所产生的子实体的转录谱中也有显著差异,但两个文库均含有丰富的细胞壁结构相关转录本,分别有38.72%和26.35%的unigene为细胞壁结构相关转录本[44]。这提示人工培养基上生长的菌丝体或子实体和虫体上产生的子实体之间具有相似活性成分的说法不可靠。Zheng Peng等[59]通过高通量转录组分析表明,在蛹虫草子实体阶段Zn2Cys6型转录因子和丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路被诱导激活,而非MAPK和蛋白激酶A共同调控,这点与其他菌物不同[59,79]。同时,菌丝体阶段和子实体阶段基因转录谱存在差异也验证了Xiong Chenghui等的研究结果[78]。Yin Yalin等[80]利用高通量Illumina测序分析蛹虫草转录组,发现蛹虫草菌丝体阶段和人工栽培子实体阶段之间的转录谱存在明显差异,预测到可变剪切与新的转录本,这一发现丰富了蛹虫草的转录数据库。通过基因表达分析,在菌丝体阶段和子实体阶段分别发现2 113 个和599 个基因上调。利用GO和京都基因与基因组百科全书分析来比较基因的表达差异,功能注释后显示,细胞内的核苷酸结合和代谢、转录调控和翻译在菌丝体阶段更积极,而糖代谢和信号转导在子实体阶段更为活跃。这意味着子实体生长需要更多的能量,大米培养基可以提供丰富的碳水化合物。此外,还对在不同发育阶段蛹虫草虫草素可能的代谢差异进行了研究。推测虫草素代谢途径可能在菌丝体阶段更加活跃[80]。这些关于蛹虫草转录组学的研究为今后探究其相关活性基因的表达调控和功能提供了依据,但是如前所述,虫草素的基因通路和代谢网络以及很多生物过程(例如菌株退化)的分子机制尚不清楚,今后仍然是研究重点。
对于研究基因的功能以及转录组数据的可靠性,反转录实时定量PCR(reverse transcription real-time quantitative PCR,RT-qPCR)是一种有力的技术手段,蛹虫草作为一种重要的食药用菌物,其基因表达分析已变得越来越重要和流行。在不同的实验条件下选择合适的参考基因验证是RT-qPCR分析的关键,但研究选择的内参基因五花八门,例如18S rRNA[45]、actin[81]、tub[81]等。Lian Tiantian等[82]选取3 组蛹虫草样品和5 个不同的发育阶段,分别培养于麦麸培养基和蚕蛹蛹体中,利用RT-qPCR技术,选择8 个候选内参基因:actin、cox5、gpd、rpb1、tef1、try、tub和ubi(均为持家基因),分别采用GENORM、NORMFINDER、BESTKEEPER和比较ΔCt法4 种不同的算法对其表达的稳定性进行评价。结果表明,所有发育阶段中rpb1是最好的内参基因,而最常用的actin和tub并不能作为合适的内参基因。cox5表现不佳且表达不稳定;ubi和gpd在采用不同的方法和不同的样品时得到的结果不一致。该研究为不同发育阶段内参基因的选择提供了依据,也表明在蛹虫草基因表达分析中RT-qPCR是一种更准确、更应广泛使用的基础技术。
蛋白质组的概念最早由Wilkins等[83]提出,指由一个基因组或一个细胞、组织表达的全部蛋白质。在转录时,一个基因可以有多种mRNA剪接形式,一个蛋白质组不是一个基因组的直接产物,蛋白质组中蛋白质的数目有时可以超过基因组的数目[84]。随着基因组测序技术的诞生与发展,生物学研究已经进入后基因组时代。生物过程的发生常常是受多因素影响的,势必涉及到多个蛋白质。因此,蛋白质组不仅是后基因时代研究的重要组成,还为全面描述未知基因的功能提供了有力的技术支持。Yin Yalin等[80]利用蛋白质组手段研究和分析蛹虫草菌丝体阶段和人工栽培的子实体阶段之间的差异。结合一维凝胶电泳与纳米电喷雾液相色谱-质谱技术测定了蛹虫草蛋白组数据,分别在蛹虫草菌丝体阶段和人工栽培的子实体阶段检测到359 个和214 个蛋白质,但仅有98 个蛋白质在两个阶段中都有表达。这个结果也从蛋白水平提示,人工培养基上生长的菌丝体或子实体和虫体上产生的子实体之间具有相似的活性成分这一说法不可靠。该研究还检测到了一些重要的蛋白质,如外源凝集素、SOD、糖苷水解酶和参与虫草素代谢的蛋白质,这为药用成分的进一步研究提供了线索,将促进蛹虫草的发育和药理研究。Staats等[62]的分析发现蛹虫草Cm01中有糖基化磷脂酰基锚定蛋白73 个,并预测到301 个与分泌有关的蛋白质,占总蛋白质数量(9 651 个)的3.1%。蛋白质组学集中于动态描述基因调节,对基因表达的蛋白质水平进行定量测定,解释基因表达调控的机制[85]。虽然基因决定蛋白质的水平,但是基因表达的水平并不能代表细胞内活性蛋白的水平,蛋白质组学分析是对蛋白质翻译和修饰水平等研究的一种补充,是全面了解基因组表达的一种必不可少的手段。
2011年蛹虫草基因组得以破译,蛹虫草分子方面的神秘面纱在逐步揭开,一系列关于蛹虫草转录组学、蛋白质组学等组学方面的研究也取得了较大进展。
然而,还有许多问题没有得到解决。虫草素作为蛹虫草中最重要的一类活性物质,其化学合成成本高、难度大,目前主要是靠从蛹虫草培养物中分离提取,所以价格昂贵。美国Sigma公司出售的蛹虫草来源的虫草素(C3394-25 mg)售价为2 765.88 元[20]。现在的研究多是以优化培养基或培养条件来提高虫草素的含量[86-88],其生物合成途径以及关键信号通路仍不清楚。另外,与一些丝状菌物一样,人工大规模栽培中蛹虫草菌株容易出现退化的现象[89-90],对生产会造成很大的经济损失[41,61,91],而且这种退化通常是不可逆和可遗传的[92-93]。现在关于蛹虫草菌株退化的研究大多集中于培养技术与保藏技术的优化,培养条件的确影响子实体的形成和代谢物(如虫草素、多糖)产生[94-95],但这些过程的分子遗传基础仍不清楚,蛹虫草分子水平上的变化才是引起菌种退化的根本原因。随着后基因时代的到来,除了基因组学、转录组学和蛋白组学,其他如宏基因组学、代谢组学、免疫组学以及RNA组学等组学手段可以应用于蛹虫草的研究中,这将有利于改善、解决蛹虫草菌种退化问题以及构建虫草素代谢通路。
本文总结了蛹虫草在遗传多样性、分子遗传学、基因组学、转录组学和蛋白质组学方面的研究现状,以期能够促进人们更好地认识和利用蛹虫草这一古老的药食同源菌,加快其基础研究和应用的步伐,造福于人类健康。
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