生鲜肉由于其水分含量高、蛋白质等营养物质含量丰富,在屠宰、分割、加工等过程中极易受微生物污染,如沙门菌、大肠杆菌、李斯特菌等致病菌。因此,生鲜肉的杀菌保鲜对其贮藏品质起着决定性的作用。关于生鲜肉杀菌保鲜方法的研究报道很多,主要包括物理法(如辐照[1-2]、超高压杀菌[3]、超声杀菌[4-5]、冷等离子体杀菌[6]、脉冲电场杀菌[7]等)和化学法(如使用乳酸[8-9]、CO2[10]等)。而辐照作为一种冷杀菌方式,能杀灭肉品内部绝大部分甚至全部的微生物,被认为是提高肉品卫生安全性、延长保质期最有效的方法之一[11-12]。Robert等[13]研究发现经3 kGy辐照后的生鲜牛肉,在4 ℃条件下可以贮藏42 d,而对照组未辐照的样品只能贮藏7 d。我国1986年就出台了《辐照食品卫生管理规定(暂行)》,允许肉品进行辐照处理,并在1994年制定了《辐照猪肉卫生标准》[14]。但是,到目前为止在我国辐照技术真正商业化用于生鲜肉的保鲜尚鲜见,其主要原因是肉类被辐照后会产生类似臭蛋味、血腥味、金属味、烧焦味、硫磺味等辐照异味[15],为消费者所不能接受。已有研究证实,肉品辐照异味主要是由于辐照过程中蛋白质发生氧化、降解有关。林若泰等[16]研究发现冷却真空包装猪肉γ-辐照后的异味成分主要是二甲硫、二甲二硫、甲硫醇等含硫挥发性化合物,且这些挥发性化合物主要来自于肌肉中的含硫氨基酸(半胱氨酸、蛋氨酸)以及VB1的辐照降解。Ahn等[17]认为肉品辐照过程中含硫氨基酸侧链容易发生降解形成异味化合物。但是,到目前为止大多数肉类辐照方面的研究还主要集中在辐照的杀菌效果和挥发性辐照异味化合物组成方面,而关于辐照过程中肌肉蛋白质的降解情况研究很少。已经有大量研究表明,食品中蛋白质降解形成的一些小分子寡肽对食品的滋味有非常重要的影响[18]。
本研究主要通过分析猪肉辐照前后肌肉中蛋白质降解形成小分子寡肽(<3 kDa)的情况以及氨基酸组成变化情况探索辐照对生鲜猪肉蛋白质降解的影响,为辐照技术在生鲜肉品中的应用提供参考,同时也为将来进一步研究辐照异味(滋味)形成机理提供实验支撑。
生鲜猪肉为雨润集团公司当日宰杀的猪后腿肉。
茚三酮、氨基酸分析用缓冲液(均为色谱纯)日本日立公司;氨基酸混合标准品、三氟乙酸、甲酸(色谱级) 美国Sigma公司;盐酸、氢氧化钠、柠檬酸均为国产分析纯试剂。
AR2140电子分析天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;QY-300电动匀浆机 江苏周庄科研器械厂;L-8900氨基酸自动分析仪 日本日立公司;D-37520-3-30K高速冷冻离心机 德国Sigma公司;Q ExactiveTM质谱仪 美国Thermo Fisher Scientific公司;60Co-γ辐照源(活度1.1×1016Bq) 湖北省辐照实验中心。
1.3.1 样品辐照
将购买的新鲜猪后腿肌肉去除结缔组织及肉眼可见的脂肪,将其切成50 mm×40 mm×15 mm规格大小肉块6 块,将所有肉块平均分成2 组,其中一组作为未辐照对照样品,另一组进行3 kGy γ-辐照(剂量率3.4 kGy/h)。辐照结束后样品立即取样进行氨基酸及多肽组成的分析。
1.3.2 氨基酸组成分析
1.3.2.1 样品酸水解
参考Galla等[19]的方法加以改进。将对照组和不同剂量辐照处理的肉样分别用绞肉机进行绞碎处理,绞碎后分别称取各处理组肉样250 mg,装入10 mL水解安瓿管中,缓慢加入8 mL 6 mol/L HCl溶液,轻轻转动安瓿管,使样品全部到达管底部,并保证样品全部润湿后,保持恒稳气流充氮2 min,丁烷喷枪封口,马弗炉(110±1)℃水解24 h。水解管取出冷却后,用医用磨刀石切开水解管,用去离子水全部转移到50 mL容量瓶中,定容、摇匀,双层滤纸过滤,取滤液1 mL置25 mL小烧杯中,在加有NaOH的真空干燥箱中蒸干(约50 ℃),加入1 mL pH 2.2的HCl溶液(或0.02 mol/L HCl溶液)毛细管搅拌溶解,于10 000 r/min离心10 min,最后经0.22 μm水系微孔滤头过滤,于样品瓶中备用,低温贮存(-20 ℃)待上机。
1.3.2.2 氨基酸标准曲线绘制
精确称取氨基酸混合标样0.24 mL,用0.2 mol/L HCl溶液定容至10 mL,Pro 6 nmol/50 μL,其余氨基酸单体3 nmol/50 μL,绘制梯度浓度,然后按样品测定步骤进行。
1.3.2.3 氨基酸分析程序与条件
分析程序采用Hitachi氨基酸全自动分析仪蛋白质分析标准程序,分析周期75 min。分析柱26 mm×150 mm;树脂2619;缓冲液流速0.225 mL/min;茚三酮流速0.3 mL/min;茚三酮压力25 kg/cm2;柱压90 kg/cm2;柱温53 ℃;N20.28 kg/cm2;洗脱液级数5 级;进样量50 μL;标样浓度3 nmol/50 μL。样品中氨基酸含量的最终结果以肉质量计(mg/100 g)。
1.3.3 多肽组成分析
1.3.3.1 小分子多肽提取
参考Ilko等[20]的方法,并作一定改进。50 mL无菌离心管内加入6 g肉样和24 mL超纯水,40 ℃振摇,静置2 min后,均质2 min,然后4 ℃、3 000×g离心30 min。离心结束后,取上清液过滤,得到微滤液(多肽粗提液)。获得的微滤液再用截留分子质量为5 kDa的超滤管以4 000×g进行20 min的超滤离心,截留分子质量小于3 kDa的多肽,得到相应超滤流穿液。上述样品超滤过程各超滤离心管以冰块和泡沫盒全程孵育,确保所有样品温度不超过4 ℃。
分别取各管超滤流穿液5 mL,转移至各新管,冷冻干燥处理48 h,完全去除水分,得到多肽粗提粉末。每一批多肽粗提粉末均用500 μL的超纯水进行复溶浓缩,之后分别转移至1.5 mL EP管中。每个EP管中分别加入1 mL乙腈,剧烈振荡,静置5 min,用于析出超滤不完全且分子质量较大的蛋白和少量极性杂质。之后上离心机,10 000×g离心5 min,充分聚集沉淀。对各EP管内上清液做氮吹处理至溶液体积约500 μL,彻底去除加入的乙腈。剩余上清液采用针式过滤器和0.22 μm水系滤膜进行过滤,用于滤去多余的脂肪乳(粒径大于0.22 μm),得到目标小分子多肽混合液。各EP管做好标记后,充氮置换掉残余空气,扣盖并以Bemis无菌膜(Parafilm M®)严格密封,置于-20 ℃冰箱,待进行液相色谱-质谱分析。1.3.3.2 多肽序列分析
采用Q Exactive™组合型四极杆Orbitrap质谱仪对辐照组预处理多肽样品进行序列鉴定,详细分级操作如下:
1)ZipTip µC-18微量层析柱用于纯化多肽。润湿柱子:吸取10 µL乙腈重复2 次;酸化柱子:吸取10 µL 0.1%三氟乙酸溶液重复2 次;吸附样本:吹吸样本15 次;除杂质:吸取10 µL 0.1%三氟乙酸溶液,重复2 次;洗脱样本:吸取2~5 µL 0.1%三氟乙酸溶液-50%乙腈溶液,将此洗脱液转入新EP管。
2)Empore™ SPE Cartridges C18(standard density)柱纯化多肽除盐。SPE柱加1 mL甲醇活化柱料;加1 mL 0.1%甲酸除去甲醇;加5%乙腈-0.1%甲酸溶液平衡柱子;加入样本(重复2 次);加入5%乙腈-0.1%甲酸除盐除杂,重复3 次;加入1 mL纯乙腈洗脱到1.5 mL离心管,冷冻抽干。
3)多肽液相色谱-质谱检测。多肽样品溶解液(0.1%甲酸溶液、2%乙腈溶液)溶解,充分振荡涡旋,13 200 r/min、4 ℃离心10 min,上清液转移到上样管中,色谱上样量5 µL。预装柱(Acclaim PepMap RSLC,C18,300 µm×5 mm,5 µm,100 Å,Dionex)对上样多肽液进行脱盐处理(0.1%三氟乙酸溶液洗涤柱子15 min),之后进入C18树脂分离柱(Acclaim PepMap,C18,75 µm×150 mm,3 µm,100 Å,Dionex)对混合多肽进行分离,流动相A为体积分数0.1%甲酸溶液,流动相B为体积分数80%乙腈溶液和体积分数0.1%的甲酸溶液(99∶1,V/V),流速300 nL/min,每个组分分析时间65 min。质谱分析使用单一的全扫描质谱Orbitrap(质量扫描范围m/z 400~1 500;分辨率140 000),分离后的肽段直接进入质谱仪Thermo Scientific Q Exactive进行在线检测,质谱原始文件经过MM File Conversion软件处理转换,得到MGF格式文件,然后用MASCOT(www.matrixscience.com)检索Uniprot_Susscrofa数据库。肽段分析图谱进一步通过国家国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库进行BLAST验证其可信度,获得最终多肽序列。
氨基酸检测结果以 ±s表示,并用SAS 9.3统计软件进行单因素方差分析,每组实验独立重复3 次。对于第0天各样品的多肽数据,多肽结果通过序列比较,对来源于蛋白的同源肽段清除位点进行分析,统计辐照前后的多肽清除位点,结果以表格和柱状图呈现。多肽组检索参数设置为一级质谱误差2×10-5;二级质谱误差0.6 Da。
表1结果表明,辐照处理后样品中大部分氨基酸的含量比对照组有显著降低(P<0.05),只有Vla、Pro 2 种氨基酸与对照组差异不显著。在辐照后含量发生下降的氨基酸中Leu、Ile、Met、Glu、Thr、Ser、Cys最为明显,这表明支链氨基酸(Leu、Ile)、含硫氨基酸(Met、Cys)和带醇羟基的氨基酸(Ser、Thr)在辐照过程中最容易受辐照的影响。这可能主要与这些氨基酸的结构有关,含硫氨基酸分子中的硫原子、Ser和Thr分子中的羟基,这些基团更容易受辐照的影响。关于辐照对含硫氨基酸的影响,大量研究已经证明辐照会使肉品中的含硫氨基酸发生显著降解,形成一些含硫的水溶性辐照异味化合物[21]。Ahn等[22]通过对单体氨基酸进行辐照实验研究发现脂肪族的Ile、Leu和Val是所有非含硫氨基酸中最容易受辐照影响的氨基酸,辐照能促使它们发生Strecker降解反应,分别形成2-甲基-丁醛、3-甲基-丁醛以及2-甲基丙醛;其次是脂肪族羟基氨基酸Ser和Thr,它们经过辐照后会形成大量的乙醛和丙醛。在肉品辐照过程中,氨基酸含量的变化还与蛋白质的水解有关,但是本研究中所有的氨基酸含量辐照后都呈不同程度的下降,这表明3 kGy剂量辐照还不足以使肌肉蛋白质彻底水解形成氨基酸,更多的可能是形成一些多肽。
表1 辐照前后样品中的氨基酸组成
Table 1 Amino acid composition of pork meat before and after irradiation
注:*.差异显著,P<0.05。
氨基酸种类 含量/(mg/100 g)未辐照组 3 kGy辐照Gly 856.07±7.358 820.87±6.324*Ala 1 237.69±10.123 1 209.44±1.204*Vla 1 319.53±7.173 1 317.65±3.090 Ile 1 143.08±12.078 1 016.34±17.560*Leu 1 676.37±19.710 1 491.51±14.726*Asp 1 982.56±19.380 1 874.05±38.182*Glu 3 276.08±27.530 3 173.91±62.055*Lys 1 944.38±18.788 1 868.29±39.970*Arg 1 344.13±12.893 1 282.87±3.249*Thr 1 023.09±7.566 920.95±26.164*Ser 874.11±8.039 731.32±26.505*Pro 174.68±27.940 171.72±94.191 His 1 030.53±14.394 911.81±12.084*Cys 621.48±1.841 467.85±6.162*Met 898.16±20.822 678.23±43.481*Tyr 1 106.25±10.440 1 058.45±25.694*Phe 1 074.54±17.348 998.80±52.037*
根据文献报道分子质量小于3 kDa的小分子肽对食品的滋味有重要影响,是食品滋味的重要贡献者[23-24]。因此,本研究辐照结束后,通过超滤的方法提取肌肉中分子质量小于3 kDa的寡肽,然后对其进行高效液相色谱-电喷雾串联质谱检测分析,表2表明,肌肉经辐照后共产生分子质量小于3 kDa的多肽104 种,分别来源于21 种不同的肌肉蛋白质。对104 条多肽进行分析,发现这些多肽中最大分子质量为2 888 Da,来自Importin 13 OS=Susscrofa;最小分子质量为670 Da,来自肌钙蛋白I。通过对不同分子质量小分子肽频率分布进行统计,由图1可知,3 kGy辐照后生成的小分子肽分子质量主要集中在1 200~2 600 Da之间,占到了辐照产生的小分子肽总量的76%。
表2 新鲜猪肉经辐照(3 kGy)显著产生的小分子多肽序列
Table 2 Major small molecular polypeptides in fresh pork produced after 3 kGy irradiation
序号 肽段定性 Uniprot标志 位置 m/z 电荷(+) 计算分子质量/Da Pe 氨基酸序列 Pf 1 Desmin OS=Susscrofa DESM_PIG 32~43 421.899 9 3 1 262.677 2 S SPVFPRAGFGTK G 2 Desmin OS=Susscrofa DESM_PIG 32~48 834.923 9 2 1 667.826 8 S SPVFPRAGFGTKGSSSS V 3 Desmin OS=Susscrofa DESM_PIG 31~51 1 022.014 2 2 042.006 9 L SSPVFPRAGFGTKGSSSSVTS R 4 Desmin OS=Susscrofa DESM_PIG 32~52 704.700 5 3 2 111.076 S SPVFPRAGFGTKGSSSSVTSR V 5 Desmin OS=Susscrofa DESM_PIG 28~55 962.835 8 3 2 885.467 2 G SPLSSPVFPRAGFGTKGSSSSVTSRVYQ V 6 Titin OS=Susscrofa I3L8Q0_PIG 523~542 788.074 9 3 2 361.202 3 K EQETRITGEITTKEEQKQIT Q 7 Titin OS=Susscrofa I3L8Q0_PIG 520~542 897.151 9 3 2 688.429 3 T KAKEQETRITGEITTKEEQKQIT Q 8 Titin OS=Susscrofa I3L8Q0_PIG 442~464 851.123 2 3 2 550.340 1 R TTTTAVHIQPAQEQIRKEAEKTA V 9 Titin OS=Susscrofa I3L8Q0_PIG 502~519 682.74 3 2 045.188 5 Q IRKETEKAFVPKVVISTT K 10 Titin OS=Susscrofa I3L8Q0_PIG 499~519 814.127 2 3 2 439.348 5 T HEQIRKETEKAFVPKVVISTT K 11 Titin OS=Susscrofa I3L8Q0_PIG 497~519 880.833 5 3 2 639.464 6 H VTHEQIRKETEKAFVPKVVISTT K 12 Titin OS=Susscrofa I3L8Q0_PIG 465~481 619.367 4 3 1 855.077 8 A VTKVVVAADKAKEQELK S 13 Titin OS=Susscrofa I3L8Q0_PIG 1 368~1 374 385.232 5 2 768.449 4 R SPIRISP A 14 Titin OS=Susscrofa I3L8Q0_PIG 425~441 637.358 7 3 1 909.049 3 M ARVREPVISAVEQTAQR T 15 Titin OS=Susscrofa I3L8Q0_PIG 1 881~1 897 652.012 9 3 1 953.010 8 R APEPKPEFHIHEPGKLQ F 16 Titin OS=Susscrofa I3L8Q0_PIG 635~654 667.03 3 1 998.089 8 I HGKVGVGKKAEAVATVVAYD Q 17 Titin OS=Susscrofa I3L8Q0_PIG 397~420 1 144.115 5 2 2 286.206 7 G AVATGAAEVKQETDKSAAVATVVA A 18 Titin OS=Susscrofa O97771_PIG 157~168 625.91 2 1 249.823 4 A KPKGPIKGVAKK T 19 Titin OS=Susscrofa O97771_PIG 65~77 710.373 2 1 418.729 3 A VPEPPPKAVEEVE A 20 Titin OS=Susscrofa O97771_PIG 62~77 572.646 8 3 1 714.914 1 K KPAVPEPPPKAVEEVE A 21 Titin OS=Susscrofa O97771_PIG 145~169 859.17 3 2 574.522 K KAEAKAPKEEAAKPKGPIKGVAKKT P 22 Nebulin OS=Susscrofa F1SHX0_PIG 52~59 463.282 1 2 924.539 2 V RLDAIPIQ A 23 Nebulin OS=Susscrofa F1SHX0_PIG 42~49 551.7 2 1 101.392 9 G WDEMKMSC D 24 Nebulin OS=Susscrofa F1SHX0_PIG 776~785 1 119.69 1 1 118.669 9 D KVKATSYILP S 25 Nebulin OS=Susscrofa F1SHX0_PIG 2 020~2 033 509.309 5 3 1 524.902 8 V TPALLHVKYATKIA S 26 Nebulin OS=Susscrofa F1SHX0_PIG 2 249~2 271 866.812 2 3 2 597.406 4 K YKETIGQGTPIPDLPEVKRVKET Q 27 Nebulin OS=Susscrofa F1SHX0_PIG 2 249~2 273 952.198 1 3 2 853.56 K YKETIGQGTPIPDLPEVKRVKETQK H 28 Nebulin OS=Susscrofa F1SHX0_PIG 2 421~2 439 730.060 7 3 2 187.153 6 F TPVVTDPITERVKKNTQDF S 29 Troponin T fast skeletal muscle type OS=Susscrofa Q75NG7_PIG 18~32 568.278 4 3 1 701.811 1 A PPPPAEVHEVHEEVH E 30 Troponin T fast skeletal muscle type OS=Susscrofa Q75NG7_PIG 17~34 667.993 7 3 2 000.959 2 E APPPPAEVHEVHEEVHEV H 31 Troponin T fast skeletal muscle type OS=Susscrofa Q75NG7_PIG 15~32 1 016.474 4 2 2 030.933 4 Q EEAPPPPAEVHEVHEEVH E 32 Troponin T fast skeletal muscle type OS=Susscrofa Q75NG7_PIG 192~208 685.373 8 3 2 053.059 2 D HLSEDKLRDKAKELWDA L
续表2
33 Troponin T fast skeletal muscle type OS=Susscrofa Q75NG7_PIG 29~46 728.375 5 3 2 182.101 8 H EEVHEVHEPEEKPRPKLT A 34 Troponin T fast skeletal muscle type OS=Susscrofa Q75NG7_PIG 26~46 850.100 5 3 2 547.271 7 H EVHEEVHEVHEPEEKPRPKLT A 35 Troponin T fast skeletal muscle type OS=Susscrofa Q75NG7_PIG 171~192 1 331.28 2 2 660.502 K QTAREMKKKVLAERRKPLNIDH L 36 Troponin I slow skeletal muscle type OS=Susscrofa Q4JH15_PIG 130~134 671.36 1 670.358 5 S KHKVC M 37 Troponin I slow skeletal muscle type OS=Susscrofa Q4JH15_PIG 120~139 758.4 3 2 272.185 4 A DAMLKALLGSKHKVCMDLRA N 38 Myotilin OS=Susscrofa F1RH92_PIG 22~36 797.374 6 2 1 592.731 8 L QPPGPETSSYSSQTK Q 39 Myotilin OS=Susscrofa F1RH92_PIG 19~36 650.657 4 3 1 948.949 G SRLQPPGPETSSYSSQTK Q 40 Myotilin OS=Susscrofa F1RH92_PIG 69~86 926.973 2 1 851.922 8 A FPASPQQPAASNPGQRVT A 41 Myotilin OS=Susscrofa F1RH92_PIG 68~86 962.492 7 2 1 922.959 9 S AFPASPQQPAASNPGQRVT A 42 Myotilin OS=Susscrofa F1RH92_PIG 68~87 998.008 2 2 1 993.997 S AFPASPQQPAASNPGQRVTA T 43 Myotilin OS=Susscrofa F1RH92_PIG 68~89 1 130.066 8 2 2 258.108 S AFPASPQQPAASNPGQRVTATY N 44 LIM domain-binding protein 3 OS=Susscrofa F1SEN8_PIG 232~238 400.250 6 2 798.485 1 S LPIKDLT V 45 LIM domain-binding protein 3 OS=Susscrofa F1SEN8_PIG 98~105 859.51 1 858.496 3 Q SPLPVIPH Q 46 LIM domain-binding protein 3 OS=Susscrofa F1SEN8_PIG 98~107 558.334 2 1 114.649 9 Q SPLPVIPHQK D 47 LIM domain-binding protein 3 OS=Susscrofa F1SEN8_PIG 388~395 432.281 7 2 862.538 9 A PAPKPRVV T 48 LIM domain-binding protein 3 OS=Susscrofa F1SEN8_PIG 383~396 702.404 3 2 1 402.793 2 S EAPAAPAPKPRVVT T 49 LIM domain-binding protein 3 OS=Susscrofa F1SEN8_PIG 473~479 435.727 8 2 869.439 6 S RPPWVTD D 50 LIM domain-binding protein 3 OS=Susscrofa F1SEN8_PIG 368~381 677.348 5 2 1 352.672 5 S PAVATSPAPAAHTY S 51 LIM domain-binding protein 3 OS=Susscrofa F1SEN8_PIG 232~246 809.443 3 2 1 616.866 1 S LPIKDLTVDSASPVY Q 52 LIM domain-binding protein 3 OS=Susscrofa F1SEN8_PIG 255~271 677.657 9 3 2 029.945 3 N KPEDEADEWARRSSNLQ S 53 Actinin-associated LIM protein 1a OS=Susscrofa D3GGC5_PIG 180~187 431.780 1 2 861.543 6 E LPGVKIVH A 54 Actinin-associated LIM protein 1a OS=Susscrofa D3GGC5_PIG 168~178 623.82 2 1 245.609 7 A AKMAPNIPLEM E 55 Actinin-associated LIM protein 1a OS=Susscrofa D3GGC5_PIG 94~107 792.906 1 2 1 583.794 3 T EDGKAHPFKINLES E 56 Syntaxin 3 homolog OS=Susscrofa O97510_PIG 33~42 607.41 2 1 212.799 2 A RKMLIIIIVV V 57 Syntaxin 3 homolog OS=Susscrofa O97510_PIG 35~45 613.92 2 1 225.841 4 K FLIIIIVVVVV L 58 Syntaxin 3 homolog OS=Susscrofa O97510_PIG 33~44 455.33 3 1 362.969 A RKVLIIIIVVVV V 59 Syntaxin 3 homolog OS=Susscrofa O97510_PIG 32~50 1 038.23 2 2 074.404 3 Q ARKMLIIIIVVVVVLLGIL A 60 Syntaxin 3 homolog OS=Susscrofa O97510_PIG 32~51 701.495 3 2 101.433 Q ARKSLIIIIVVVVVLLGILA L 61 Syntaxin 3 homolog OS=Susscrofa O97510_PIG 33~52 719.5 3 2 155.516 3 A RKVLIIIIVVVVVLLGILAL I 62 Syntaxin 3 homolog OS=Susscrofa O97510_PIG 29~49 767.5 3 2 299.519 5 Y QGQARKRLIIIIVVVVVLLGI L 63 Syntaxin 3 homolog OS=Susscrofa O97510_PIG 24~43 768.82 3 2 303.431 7 K RAVKYQGQARKHLIIIIVVV V 64 Syntaxin 3 homolog OS=Susscrofa O97510_PIG 28~49 803.52 3 2 407.529 4 K YQGQARKTLIIIIVVVVVLLGI L 65 Syntaxin 3 homolog OS=Susscrofa O97510_PIG 32~54 831.24 3 2 490.712 1 Q ARKHLIIIIVVVVVLLGILALII G 66 Syntaxin 3 homolog OS=Susscrofa O97510_PIG 33~56 864.26 3 2 589.780 5 A RKHLIIIIVVVVVLLGILALIIGL S 67 Synaptopodin2 OS=Susscrofa F1S156_PIG 633~647 865.93 2 1 729.861 7 Q PPPWPQPVPWSQPAF Y 68 Synaptopodin2 OS=Susscrofa F1S156_PIG 993~1 010 896.475 3 2 1 790.927 5 A LPPRPVNAGSPTNVQASS V 69 Synaptopodin2 OS=Susscrofa F1S156_PIG 836~857 678.669 1 3 2 032.963 6 T PTVNAAHAGAVGPSNELPGMSG K 70 Synaptopodin2 OS=Susscrofa F1S156_PIG 473~491 748.385 8 3 2 242.094 7 P DTTGKGALMFAKRRERMDQ I 71 Synaptopodin2 OS=Susscrofa F1S156_PIG 64~87 879.14 3 2 634.378 6 M ESITDSLQMLIKRPSSGISETLIT E 72 Synaptopodin2 OS=Susscrofa F1S156_PIG 764~790 893.46 3 2 677.338 8 V SPVWSPGVAPTQPPAFPTSSPSQGTVV S 73 Synaptopodin2 OS=Susscrofa F1S156_PIG 929~954 935.88 3 2 804.569 4 Q PSAPQASKTSKKKGKKPLNALDVMKH Q 74 Importin 13 OS=Susscrofa I3LNF6_PIG 850~861 785.42 2 1 568.805 5 V KEMVKEFTLLCR G 75 Importin 13 OS=Susscrofa I3LNF6_PIG 489~505 693.680 3 3 2 077.99 K QIHKTSQCMWLMQALGF L 76 Importin 13 OS=Susscrofa I3LNF6_PIG 151~173 818.422 1 3 2 452.237 3 A LIQAAFSALQDSELFDSSVEAIV N
续表2
注:Pe.肽序列前氨基酸残基的位置;Pf.肽序列后氨基酸残基的位置。
序号 肽段定性 Uniprot标志 位置 m/z 电荷(+) 计算分子质量/Da Pe 氨基酸序列 Pf 77 Importin 13 OS=Susscrofa I3LNF6_PIG 627~651 963.75 3 2 888.285 3 L DDFAPMVPQLCEMLGRMYSTIPQAS A 78 Heat shock protein beta-1 OS=Susscrofa HSPB1_PIG 52~57 389.205 6 2 776.397 G WPGYVR P 79 Heat shock protein beta-1 OS=Susscrofa HSPB1_PIG 51~58 466.244 7 2 930.471 2 S GWPGYVRP L 80 Heat shock protein beta-1 OS=Susscrofa HSPB1_PIG 51~62 668.364 3 2 1 334.713 5 S GWPGYVRPLPPP A 81 Heat shock protein beta-1 OS=Susscrofa HSPB1_PIG 52~63 675.375 2 2 1 348.729 2 G WPGYVRPLPPPA I 82 Heat shock protein beta-1 OS=Susscrofa HSPB1_PIG 52~65 796.436 6 2 1 590.855 8 G WPGYVRPLPPPAIE G 83 Potassium voltage-gated channel subfamily A member 1 OS=Susscrofa F1SL10_PIG 3~18 529.554 1 3 1 585.667 8 T VMSGENVDEASAAPGH P 84 Potassium voltage-gated channel subfamily A member 1 OS=Susscrofa F1SL10_PIG 287~301 604.4 3 1 810.178 1 T SLAILRVIRLVRVFR I 85 Potassium voltage-gated channel subfamily A member 1 OS=Susscrofa F1SL10_PIG 212~230 1 153.57 2 2 305.134 1 I YNSNIFTDPFFIVETLCII W 86 Nuclear pore complex protein Nup85 OS=Susscrofa F1RVX6_PIG 23~40 732.613 6 3 2 194.846 8 Q MCFDWGPGEMLVCETSFN K 87 Telethonin OS=Susscrofa A4GR69_PIG 140~152 637.399 2 2 1 272.780 6 Q LPPVVPVSKPGAL R 88 Goosecoid-like protein OS=Susscrofa F1RK76_PIG 71~82 758.22 2 1 514.453 9 T PEAAPCACCCCC G 89 Cytochrome b OS=Susscrofa A0SXX2_PIG 284~301 902.6 2 1 803.159 7 S IPNKLGGVLALVASILIL I 90 Cytochrome b OS=Susscrofa A0SXX2_PIG 169~186 652.15 3 1 953.401 8 F SVDKATLXXXXXXXXXXX X 91 Cytochrome b OS=Susscrofa A0SXX2_PIG 130~152 843.08 3 2 526.261 7 M GYVLPWGQMSFWGATVITNLLSA I 92 Cytochrome b OS=Susscrofa A0SXX2_PIG 199~221 854.055 8 3 2 559.170 0 L FLHETGSNNPTGISSDMDKIPFH P 93 Fucokinase OS=Susscrofa I3LTC2_PIG 999~1 011 697.33 2 1 392.627 8 H MMDALAPHVHGQS L 94 Fucokinase OS=Susscrofa I3LTC2_PIG 823~844 946.51 2 1 891.016 3 L PHGSGLGTSSILAGAALGALAA L 95 Fucokinase OS=Susscrofa I3LTC2_PIG 158~183 1 349.21 2 2 696.382 3 V PPNPGINWDGFRGARVIALPGSTAYA R 96 Fucokinase OS=Susscrofa I3LTC2_PIG 502~526 1 444.66 2 2 887.338 1 L GPQDMLWMLDPQEDGGKALRAWRDS W 97 Lactase-phlorizin hydrolase OS=Susscrofa I3L7V1_PIG 1 422~1 431 1 097.39 1 1 096.380 1 N NDIGDMACDS Y 98 Lactase-phlorizin hydrolase OS=Susscrofa I3L7V1_PIG 1 422~1 441 746.98 3 1 697.642 8 N NDIGDMACDSYHKIAEDVVA L 99 Lactase-phlorizin hydrolase OS=Susscrofa I3L7V1_PIG 1 229~1 242 566.88 2 2 033.059 1 S YEDDQELTEEEDPS W 100 Lactase-phlorizin hydrolase OS=Susscrofa I3L7V1_PIG 1 895~1 911 1 017.55 3 2 237.956 9 L LLGVCGVAFLSYKYCKR S 101 Sulfotransferase OS=Susscrofa I3LLX8_PIG 114~127 757.51 2 1 512.975 6 K VKVVYVARIALLLG P 102 Sulfotransferase OS=Susscrofa I3LLX8_PIG 113~127 838.55 2 1 675.054 9 Q KVKVVYVARFALLLG P 103 PI3 C alpha-protease inhibitor OS=Susscrofa F1SCC6_PIG 28~39 421.239 3 1 260.692 5 P ADDLASKTVTLK G 104 PI3 C alpha-protease inhibitor OS=Susscrofa F1SCC6_PIG 384~401 1 105.6 2 2 209.157 2 I ELTSIEFLTVHFNRPFLF S
图1 3 kGy辐照后形成小分子肽的分子质量分布
Fig. 1 Molecular mass distribution of small peptides produced after 3 kGy irradiation
根据Uniprot数据库结合BLAST验证表2中所有21 种蛋白序列号,并统计各种多肽的组织来源分布,如表3所示。
通过统计分析发现鉴定到的104 种多肽中,53%来自于肌肉结构蛋白降解,其中15.4%的多肽来源于肌联蛋白,6.7%的多肽来源于伴肌动蛋白,8.6%的多肽来源于肌钙蛋白T和肌钙蛋白I。其中,肌钙蛋白T产生的辐照小分子肽(6.7%)显著多于肌钙蛋白I产生的辐照小分子肽(1.9%)(P<0.05)。另外4.8%多肽来源于肌间线蛋白,5.8%来源于肌收缩蛋白,2个拥有LIM结构域的蛋白——LIM结构域结合蛋白3和辅肌动蛋白相关LIM蛋白1a产生小分子肽的比例则分别占到了8.7%和2.9%。据报道,LIM蛋白的LIM结构域往往与肌动蛋白纤维以及肌纤维的Z-线相联系,而肌收缩蛋白也是分布于肌节Z-线上一种重要纤维外结构蛋白质,往往和肌动蛋白及α-辅肌动蛋白相互结合作用[25]。因此,肌原纤维内骨架蛋白(肌联蛋白、伴肌动蛋白、肌钙蛋白T和肌钙蛋白I)的有限降解对辐照小分子肽具有突出贡献(30.7%),而肌原纤维外骨架蛋白如肌间线蛋白、肌收缩蛋白和肌肉LIM结构域蛋白对辐照小分子肽的贡献(22.2%)要低于肌原纤维内骨架蛋白(30.7%),这可能主要与其在肌肉中的含量以及水解敏感性有关。陈韬等[26]报道肌联蛋白、伴肌动蛋白都是在肌原纤维蛋白中含量比较高且很容易发生水解的蛋白质。
表3 辐照(3 kGy)显著产生的小分子多肽来源及分布比例
Table 3 Origin and distribution proportions of major small molecular peptides in pork produced after 3 kGy irradiation
序号 小分子多肽来源 多肽数量 多肽所占比例/%1 Desmin OS=Susscrofa 5 4.8 2 Titin OS=Susscrofa 16 15.4 3 Nebulin OS=Susscrofa 7 6.7 4 Troponin T fast skeletal muscle type OS=Susscrofa 7 6.7 5 Troponin I slow skeletal muscle type OS=Susscrofa 2 1.9 6 Myotilin OS=Susscrofa 6 5.8 7 LIM domain-binding protein 3 OS=Susscrofa 9 8.7 8 Actinin-associated LIM protein 1a OS=Susscrofa 3 2.9 9 Syntaxin 3 homolog OS=Susscrofa 11 10.6 10 Synaptopodin2 OS=Susscrofa 7 6.7 11 Importin 13 OS=Susscrofa 4 3.8 12 Heat shock protein beta-1 OS=Susscrofa 5 4.8 13 Potassium voltage-gated channel subfamily A member 1 OS=Susscrofa 3 2.9 14 Nuclear pore complex protein Nup85 OS=Susscrofa 1 1.0 15 Telethonin OS=Susscrofa 1 1.0 16 Goosecoid-like protein OS=Susscrofa 1 1.0 17 Cytochrome b OS=Susscrofa 4 3.8 18 Fucokinase OS=Susscrofa 4 3.8 19 Lactase-phlorizin hydrolase OS=Susscrofa 4 3.8 20 Sulfotransferase OS=Susscrofa 2 1.9 21 PI3 C alpha-protease inhibitor OS=Susscrofa 2 1.9
辐照(3 kGy)不仅造成肌肉本身结构蛋白的降解,而且还在一定程度上降解了其他类型蛋白质,形成的小分子多肽占总多肽含量31.8%。如突触融合蛋白3同源体、突触足蛋白2、核质穿梭转运体13、热休克蛋白β-1、钾离子电压阀门通道-亚型蛋白家族A成员1蛋白、核孔复合体蛋白Nup85、视松蛋白和一种Goosecoid同源框蛋白,它们占总多肽比例分别为10.6%、6.7%、3.8%、4.8%、2.9%、1%、1%和1%。这说明肌肉中其他类型非结构性蛋白质的降解也在很大程度上贡献了辐照风味。
而肌浆蛋白质主要包括肌红蛋白和参与肌肉收缩功能反应的酶蛋白,例如糖酵解酶系、三羧酸循环及脂肪酸β-氧化酶系、氧化磷酸化酶系、电子传递体有关酶系等。而本研究也发现了5 类可能对辐照小分子肽有贡献的酶系,它们包括细胞色素b、岩藻糖激酶、乳糖酶-根皮苷水解酶、磺基转移酶和一种PI3 C α-蛋白酶抑制剂,它们分别占到小分子肽含量的3.8%、3.8%、3.8%、1.9%和1.9%,总共贡献了15.2%的小分子肽。
图2 疏水性多肽数量与序列中疏水性氨基酸比例关系图
Fig. 2 Relationship between the proportion of hydrophobic amino acids and the number of major hydrophobic peptides produced after 3 kGy irradiation
图3 强疏水性多肽数量与序列中强疏水性氨基酸比例关系图
Fig. 3 Relationship between the proportion of highly hydrophobic amino acids and the number of major highly hydrophobic peptides produced after 3 kGy irradiation
文献报道疏水性氨基酸在多肽中的组成及位置都会影响多肽风味[27-29]。为进一步探究辐照处理降解肌肉蛋白质影响其风味的规律,分析3 kGy辐照后产生的多肽中疏水性氨基酸的分布情况。从图2可知,57.02%(65 种)多肽序列中疏水性氨基酸的比例超过了50%。根据氨基酸疏水值的高低,疏水值高于0.8以上的ILe、Leu、Vla、Phe、Trp归类为强疏水值氨基酸,低于0.8的Phe、Met、Pro等归类为低疏水值氨基酸[30]。图3表明,辐照风味肽强疏水性氨基酸的比例较低,其中76.32%(87 种)多肽序列中强疏水性氨基酸的比例不超过40%。这说明肌肉结构蛋白质的辐解过程中,低疏水性和亲水性的肽段更容易受到粒子轰击而掉落下来,而这些低疏水性或亲水性多肽可能对辐照滋味和辐照异味起重要作用。而在肌肉结构蛋白质的辐解过程中,辐照风味肽强疏水性氨基酸占比相对较少,可能是强疏水性氨基酸在蛋白质内部形成了疏水核心,不易暴露降解造成的。
辐照处理后样品中大部分氨基酸的含量比对照组有显著降低。其中支链氨基酸(Leu、Ile)、含硫氨基酸(Met、Cys)和带醇羟基的氨基酸(Ser、Thr)在辐照过程中最容易受辐照影响而降解。肌肉辐照产生的分子质量小于3 kDa的多肽主要集中在1 200~2 600 Da范围内,占到了原始多肽总量的76%。肌肉中不同蛋白质对辐照敏感性不同,其中,肌原纤维结构蛋白经辐解产生的小分子肽超过了全部肽总量的50%,且肌联蛋白、伴肌动蛋白、肌间线蛋白、肌钙蛋白和LIM蛋白这5种肌肉结构蛋白受3 kGy辐照显著降解;而肌浆蛋白中的酶系经3 kGy辐照后仅产生很少量的小于3 kDa的多肽。
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