图1 重蒸酚、次氯酸钠与沸水浴时间对吸光度影响
Fig. 1 Effects of phenol, NaClO and boiling water bath time on absorbance
γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一种四碳非蛋白质组成的氨基酸，广泛存在于微生物、动植物内。在植物中，GABA是一种主要在谷氨酸脱羧酶催化L-谷氨酸脱羧下生成的代谢产物[1]。在哺乳动物的脑内，GABA是一种主要的抑制性神经递质，具有调节血压、抑制癌细胞增殖、预防阿尔茨海默病、治疗失眠等多种重要的生理功能[2]。近年来，富含GABA的食品已成为研究热点，研究者们普遍采用发酵或营造植物逆境条件的方法开发富含GABA的稻谷、小麦、茶叶、发酵食物等[3-6]。
桑叶是卫生部公布的药食同源食品，具有丰富的营养价值和多种药用功能，开发前景广阔[7-8]。已研发了以桑叶茶（下称桑茶）为代表的系列桑叶食品。在桑叶中，谷氨酸含量（以干物质计）高达23.23 mg/g[9]，因此桑叶是开发GABA食品的潜在资源。桑茶是按照茶叶加工方法生产的代用茶，已有研究报道，经过富集处理后的桑茶中GABA含量可达3.87 mg/g[10]，远超业界关于茶中GABA含量为1.5 mg/g的认定标准。
目前，GABA含量测定的方法主要有纸层析法[11]、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法[12]、液相色谱-质谱联用[13]、氨基酸分析仪[14]、基于Berthelot反应的可见光比色法[15]、基于酶反应的紫外比色法[16]等。其中，HPLC、液相色谱-质谱、氨基酸分析仪检测结果更加精确，但前处理繁琐[17]。Berthelot比色法最为方便快捷且成本低廉，但易受样品中其他成分干扰。魏珍珍等[18]发现无法用Berthelot比色法准确测定茶叶中GABA含量；何秋云等[19]检测马铃薯中GABA时也发现Berthelot比色法的误差极大。目前，鲜见关于Berthelot比色法与HPLC法定量桑茶中GABA的比较研究。为此，本研究采用HPLC和基于Berthelot反应的酶标仪分别进行方法学验证并比较，旨在寻求一种快速准确测定桑茶中GABA含量的方法，以期为大通量筛选合适的桑叶品种、叶片部位和桑茶加工工艺提供理论依据。
桑叶：育711、大十、鲁山桑采自国家桑种质资源镇江桑树圃；粤桑购自广西玉林桑树圃；湖桑购自河南信阳桑树圃；荆桑购自山东泰安。
GABA（纯度≥99%）、乙酸钠、冰醋酸、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、无水乙醇、四硼酸钠、重蒸酚、次氯酸钠（活性氯≥7.5%）、2,4-二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene，FDBN）（均为分析纯），甲醇、四氢呋喃（均为色谱纯） 国药集团化学试剂有限公司。
DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱 上海三发科技仪器有限公司；BK-FD10S冷冻干燥机 济南展康医疗器械有限公司；DFT-150手提式粉碎机 温岭市林大机械有限公司；HH·S21-6-S电热恒温水浴锅 上海精其仪器有限公司；1260 HPLC仪 美国Aglient公司；SpectraMaxi3酶标仪 美国Molecular Devices公司。
1.3.1 样品制备
将干燥的桑茶粉碎，过100 目筛。依据茶叶冲泡习惯，并参照Huang等[20]的提取方法，取适量桑茶粉末按照料液比1∶40（g/mL），用沸水浸泡，充分混匀后在40 ℃水浴1 h，每隔20 min振荡1 次。取出后滤纸过滤，滤液再过0.45 μm滤膜得桑茶待测提取液。
桑叶样品处理同上。
1.3.2 比色法
取系列质量浓度的GABA标品溶液1.0 mL，加入0.1 mol/L四硼酸钠缓冲液1.0 mL，再依次加入质量分数分别为4%、5%、6%、7%、8%的重蒸酚溶液1.2 mL，质量分数分别为4%、5%、6%、7%、8%的次氯酸钠溶液0.6 mL混匀，分别于沸水浴5、10、15、20、25 min后立刻冰浴5 min，至室温待其出现蓝绿色时再加入60%乙醇溶液2.0 mL，测定吸光度。
1.3.3 HPLC法
参考Somasundaram等[21]的测量方法。衍生处理：取0.2 mL提取液与0.1 mL 0.5 mol/L的NaHCO3溶液混合，加入0.02 mL体积分数为1% FDBN（由乙腈稀释）溶液与0.18 mL超纯水，密封。摇匀后在60 ℃水浴锅中暗反应1 h，取出冷却至室温后加入0.4 mL 0.01 mol/L的KH2PO4溶液，摇匀放置15 min，离心待测。
HPLC条件：Agilent TC-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm）；流动相A为0.05 mol/L的乙酸钠缓冲溶液（pH 5.7，体积分数2%冰醋酸调pH值，加入四氢呋喃30 mL/L），流动相B为甲醇；洗脱程序：0～20 min，70% A；20～35 min，50% A；35～60 min，30% A；60～90 min，0% A；流速1 mL/min；柱温28 ℃；检测波长360 nm；进样量10 μL。
数据以 ±s表示，显著性差异分别用t检验和单因素方差分析（SNK法），采用SPSS 22.0软件分析。
2.1.1 显色条件的优化
根据1.3.2节方法进行显色反应，扫描光谱后，在波长640 nm处出现最大吸收波长，因此，选择640 nm为检测波长。如图1所示，取0.1 mg/mL的GABA标准品溶液1.0 mL，加入0.1 mol/L四硼酸钠缓冲液1.0 mL，6%重蒸酚溶液1.2 mL，7%次氯酸钠溶液0.6 mL混匀，于沸水浴10 min后体系的吸光度最高。
图1 重蒸酚、次氯酸钠与沸水浴时间对吸光度影响
Fig. 1 Effects of phenol, NaClO and boiling water bath time on absorbance
2.1.2 标准曲线的建立
从2.0 mg/mL的标准品溶液中分别取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，加入去离子水定容至1.0 mL，再加入显色剂进行显色反应，测吸光度，结果表明，在0.2～1.0 mg/mL范围内，吸光度与GABA质量浓度呈良好的线性关系。线性方程为Y=0.295 4x+0.026 1，R2=0.990 3。
2.2.1 GABA标准品检测
配制1.0 mg/mL的GABA标准品溶液，按1.3.3节衍生后进样检测。GABA标准品的色谱图如图2所示，GABA的保留时间为7.009 min。
图2 样品与标准品的色谱图
Fig. 2 Chromatograms of sample and GABA standard
2.2.2 样品中GABA含量检测
称取1.0 g桑茶粉末，按1.3.1节方法提取，按1.3.3节方法检测，如图2所示，在7.013 min发现目标峰，且目标峰与邻近峰分离度好，该检测条件适宜。
2.2.3 标准曲线的建立
配制1.0 mg/mL的GABA标准品溶液稀释成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的标准液，衍生后进样。以峰面积为纵坐标，标准液质量浓度为横坐标绘制标准曲线。得到线性方程为Y=7 796.59X－485.24，R2=0.994 4，在GABA质量浓度为0.1～0.5 mg/mL范围内线性关系良好。
2.3.1 精密度实验结果分别取1 mL 1.0 mg/mL GABA标准溶液与1.0 g桑茶样品，按1.3.2节与1.3.3节方法，在不同的时段各重复测量6 次，结果见表1。采用比色法与HPLC法测量，日内精密度与日间精密度的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）均在2%以内，表明这2 种实验方法的精密度良好。比色法平均相对标准偏差为1.28%，HPLC法为0.37%。且不同时间内采用HPLC法测量的RSD均小于比色法，表明HPLC法测量的结果更精确。
表1 分析方法的精密度实验（n= 6）
Table 1 Precision of the colorimetric and HPLC methods (n= 6)
方法 试样 日内精密度（第1天） 日间精密度（第3天） 日间精密度（第5天）含量/（mg/g） RSD/% 含量/（mg/g） RSD/% 质量浓度/（mg/mL） RSD/%检测比色法 桑茶 0.529±0.005 3 1.07 0.530±0.009 4 1.77标准溶液1.007±0.010 1 1.007 HPLC 桑茶 0.524±0.002 3 0.44 0.525±0.001 3 0.25标准溶液1.003±0.004 1 0.42
2.3.2 回收率实验结果
表2 分析方法的回收率实验（n=3）
Table 2 Recovery of the colorimetric and HPLC methods (n= 3)
检测方法GABA质量/mg加标量/（mg/mL） （mg/mL） 回收率/% 平均回收率/% RSD/%检出量/比色法0.265 0.2 0.464 92 99.96 0.265 0.4 0.654 02 97.25 98.46 1.40 0.265 0.6 0.853 97 98.16 HPLC 0.265 0.2 0.466 92 100.96 0.265 0.4 0.664 6 99.90 100.10 0.78 0.265 0.6 0.8615 8 99.43
取0.5 g桑茶样品提取后依次加入0.2、0.4 mg/mL和0.6 mg/mL的GABA标准液1.0 mL。然后分别采用比色法和HPLC法测量并计算回收率。如表2所示，2 种测量方法的平均回收率均大于98%，表明实验方法准确可行；比色法的加标平均回收率为98.46%，小于HPLC法的平均回收率（100.10%），表明采用HPLC法测量GABA时准确度更高。此外，2 种方法的RSD均小于2%，显示了2 种实验方法均具有良好的精度。
分别采用2 种实验方法对桑茶样品和1.0 mg/mL标准液进行检测，对检测结果进行t检验。t桑=2.037、t标=0.551、t0.05(10)=2.228，t桑和t标均小于t0.05(10)，表明比色法和HPLC法测量桑茶GABA无统计学差异。
分别将不同地区与品种的桑叶以冻干、微波干燥、烘箱烘干3 种方式干燥至恒质量；另取同一批次的镇江地区新鲜桑叶，分别按红茶与绿茶加工工艺制成桑叶红茶和桑叶绿茶（桑茶采用烘干干燥，具体为110 ℃加热30 min，然后90 ℃至恒质量）。然后各称取1.0 g样品采用比色法与HPLC法检测GABA含量，结果见表3。
表3 桑茶和桑叶中的GABA含量
Table 3 GABA contents in mulberry leaf tea and mulberry leaves mg/g
注：同列不同小写字母表示差异显著（P＜0.05），大写字母表示差异极显著（P＜0.01）；n=3。
处理方式 育711 大十 鲁山桑 粤桑 湖桑 荆桑比色法 HPLC 比色法 HPLC 比色法 HPLC 比色法 HPLC 比色法 HPLC 比色法 HPLC冻干桑叶 0.529±0.002 6aA0.525±0.001 2aA0.531±0.002 2aA0.531±0.001 1aA0.533±0.006 3aA0.530±0.001 6aA0.635±0.004 5aA0.629±0.000 9aA0.615±0.009 6aA0.599±0.001 8aA0.688±0.008 7aA0.679±0.001 1aA微波干燥桑叶 0.522±0.002 0bA0.520±0.001 4bA0.530±0.003 2aA0.525±0.001 8bB0.530±0.002 7aA0.526±0.001 8bA0.631±0.003 5aA0.626±0.001 6bAB0.607±0.003 1aA0.588±0.002 9bB0.689±0.005 4aA0.656±0.002 5bB烘干桑叶 0.458±0.003 5cB0.454±0.002 3cC0.442±0.008 1bB0.438±0.001 4cC0.446±0.007 1bB0.454±0.001 4cC0.629±0.004 6aA0.623±0.001 4cB0.607±0.006 9aA0.579±0.000 9cC0.662±0.003 3bB0.644±0.002 8cC桑叶红茶 0.523±0.002 0aA0.520±0.001 5aA0.532±0.007 1aA0.533±0.001 7aA0.535±0.005 2aA0.532±0.000 6aA桑叶绿茶 0.514±0.003 6bA0.512±0.001 4bB0.529±0.002 7aA0.529±0.000 7bA0.526±0.005 4aA0.522±0.000 5bB
结果表明，干燥方式不同，GABA的含量不同。冻干桑叶中GABA含量最高，微波干燥次之，烘干桑叶最低。这可能与加热的时间与温度有关[22]。李赟等[23]研究表明，高温烘焙，会使面包中的GABA含量降低；Katsube等[24]发现冷冻干燥较喷雾干燥对速溶红茶中的GABA影响较小。
桑叶在制成桑茶后，与烘干相比GABA含量极显著提高（P＜0.01）。这可能是由于桑叶离体后，在摊晾、萎凋、碰撞、揉捻过程中，谷氨酸脱羧酶活力增强，由谷氨酸生产GABA有关[5,25]。本次加工所得的桑叶红茶中GABA含量略高于桑叶绿茶，这可能是由于桑叶红茶多了发酵工艺所致，但二者均未达到150 mg/100 g的标准，这提示可能需要在加工中采用厌氧[3]、浸泡[26]、低温[27]等方式来进一步富集GABA。
对不同品种制得的桑叶红茶、桑叶绿茶和干燥桑叶，分别采用比色和HPLC法进行测量GABA含量，经t检验，2 种检测方法无统计学差异。
GABA理论上可采用Berthelot反应[28]定量测量。但是，桑叶样品中含有的微量氨、铵盐、酰胺等物质[29]以及色素[30]，可能会影响测量结果。本研究表明，Berthelot比色法可准确定量测量干燥桑叶或桑茶中的GABA含量，测定条件为提取液1.0 mL加入0.1 mol/L四硼酸钠缓冲液1 mL，再依次加入6%的重蒸酚溶液1.2 mL、7%的次氯酸钠溶液0.6 mL混匀，沸水浴10 min后立刻冰浴5 min，至室温待其出现蓝绿色时再加入60%乙醇溶液2 mL，波长640 nm处测定吸光度。
比色法、HPLC法均可准确定量测量桑茶及桑叶中的GABA。比色法的平均相对标准偏差为1.28%，平均回收率为98.46%；HPLC法的平均相对标准偏差为0.37%，平均回收率为100.10%。2 种检测方法均符合中国药典要求，经t检验比较分析，2 种检测方法无统计学差异。
不同加工工艺对桑叶中GABA含量有影响。桑叶加工成桑茶后，GABA含量高于烘干桑叶。同一品种桑叶制成的桑叶红茶的GABA含量略高于桑叶绿茶。经t检验比较分析，2 种检测方法无统计学差异但比色法更加方便快捷，对于桑茶的选材、加工和贮藏，以及桑叶系列食品的开发更有现实意义。
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Comparison of Colorimetry and HPLC for Determination of γ-Aminobutyric Acid in Mulberry Leaf Tea