萝卜籽粕蛋白质的组成及功能性质

赵功玲,梁新红,郭延成,孔 瑾*,李柯柯,康超娣,时翠萍

(河南科技学院食品学院,河南 新乡 453003)

摘 要:以萝卜籽粕为原料,提取了其中的蛋白质;根据溶解性,萝卜籽粕蛋白中的清、球、谷、醇溶蛋白被分离;用氨基酸自动分析仪测定了萝卜籽粕蛋白的氨基酸组成;物理化学方法测定萝卜籽粕蛋白的功能性质以及体外清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、•OH、NO2-、H2O2的能力。结果表明:萝卜籽粕蛋白中球、谷、清和醇溶蛋白含量分别占总蛋白质的44%、33%、21%和2%;萝卜籽粕蛋白含18 种氨基酸,第一限制氨基酸为蛋氨酸,其氨基酸评分为57。萝卜籽粕蛋白具有很好的功能性质及抗氧化能力,表明有很高的开发价值。

关键词:萝卜籽粕;蛋白质;氨基酸组成;功能性质;抗氧化

萝卜为十字花科植物,在中国已有2 700多年的栽培历史,是我国城乡居民的大众化蔬菜,其成熟的种子——萝卜籽又名莱菔子、萝白子、菜头子等。中医认为干燥成熟的萝卜籽,具有多种药理功效,可调节老化的皮肤,防止皱纹的产生,并且还具有祛斑和改善肤色等美容功效[1-3]。现代研究表明,萝卜籽中含有丰富的异硫氰酸盐,在异硫氰酸盐的种类中,莱菔素的含量最高,约占总异硫氰酸盐的60%以上,有很强的抗氧化活性[4-6];萝卜籽中含油量可达45%,且油脂质量优良,是生产食用油的优良原料[7-9]。和许多油料种子如大豆、油菜籽等相同,萝卜籽中蛋白质的含量也很高[10],且蛋白品质优良,有很好的应用价值及前景[11]。在我国优质植物蛋白质资源匮乏的情况下,把生产萝卜籽油的副产品——萝卜籽粕作为肥料使用,甚是可惜。

本研究拟采用碱溶酸沉法提取脱脂萝卜籽饼粕中的蛋白质,研究提取出的粗蛋白的组成、功能性质、抗氧化性能,以期揭示萝卜籽粕蛋白质的结构组成和功能特性之间的关系,为萝卜籽饼粕蛋白质的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

萝卜籽粕:亚临界萃取油脂后的残渣,经高速粉碎机粉碎,避光低温保存备用;大豆蛋白粉为市售。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) 山东西亚化学工业有限公司;对氨基苯磺酸钠、盐酸萘乙二胺、NaNO2、邻二氮菲、FeSO4、H2O2、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS) 北京化工厂;无水乙醇、浓硫酸、硼酸、硫酸钾、硫酸铜、氢氧化钠、盐酸 天津科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

高速粉碎机 浙江武义县屹立工具有限公司;恒温磁力搅拌器 金坛市杰瑞尔电器有限公司;LGJ-10冷冻干燥机 北京松原华兴科技发展有限公司;320P-063-Star型pH计 美国奥立龙公司;T6紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任;TDL-5-A低速大容量离心机 北京安亭科学仪器厂;L8800氨基酸分析仪日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 萝卜籽粕蛋白质的制备方法

按料液比1∶50(m/V)的比例将萝卜籽粕粉与水混合,调pH值至10,60 ℃下搅拌90 min后,11 000 r/min离心6 min,取上清液调pH值至4.5,静置30 min后,11 000 r/min离心6 min,去上清液,冷冻干燥沉淀,获得干燥蛋白质粉。在此提取条件下,萝卜籽粕中蛋白质提取率可达80.2%,蛋白质纯度为89.5%。

1.3.2 萝卜籽粕蛋白组分分离方法

采用Osborne法[12-13]分离蛋白质组分。取10 g萝卜籽粕蛋白质,依次用蒸馏水、3% NaCl溶液、70%乙醇溶液和0.2% NaOH溶液分别提取清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。

1.3.2.1 清蛋白的提取

准确快速称取一定量的萝卜籽粕蛋白质于预冷的研钵中,加少量蒸馏水和石英砂研磨成匀浆,用10 倍体积的蒸馏水分几次将匀浆液转移至三角瓶中,置于磁力搅拌器上低温搅拌提取1 h,4 ℃、11 000 r/min离心10 min,残渣用相同的方法重复提取2 次。合并上清液,调pH值至4.5,以下按1.3.1节中方法制备干燥清蛋白粉,并称质量。

1.3.2.2 球蛋白的提取

用3% NaCl溶液作溶剂,按照1.3.1节中方法,制取提取清蛋白后残渣中的球蛋白,称质量。

1.3.2.3 醇溶蛋白的提取

用70%乙醇溶液作溶剂,按照1.3.1节中方法,制取提取球蛋白后的残渣中的醇溶蛋白,称质量。

1.3.2.4 谷蛋白的提取

用0.2% NaOH溶液作溶剂,按照1.3.1节中方法,制取提取醇溶蛋白后的残渣中的谷蛋白,称质量。以提取出的4 种蛋白为总蛋白质量,分别计算谷蛋白、清蛋白、醇溶蛋白及球蛋白占萝卜籽粕蛋白质的百分比。

1.3.3 蛋白质含量的测定方法

参照GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》的方法,采用凯氏定氮法测定蛋白质的含量,蛋白质换算系数取6.25。

1.3.4 蛋白质氨基酸组成测定方法及蛋白质营养价值评价

用氨基酸自动分析仪,按照GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的测定》方法测定氨基酸含量。色氨酸按照NY/T 57—1987《谷物籽粒色氨酸测定法》方法测定。

蛋白质营养价值评价:采用FAO/WHO氨基酸评分法(1973)评价[14]

按照公式(1)计算出8 种必需氨基酸的评分(amino acid score,AAS),以最低分记为该蛋白质的AAS。

1.3.5 蛋白质的功能性质分析

参考文献[15-16],测定蛋白质的溶解性、水合能力、吸油能力、乳化性(emulsifying activity index,EAI)、乳化稳定性(emulsifying stability index,ESI)、起泡性和泡沫稳定性。

1.3.5.1 溶解性的测定

准确称取1.0 g萝卜籽粕蛋白质,加入50 mL蒸馏水,室温下搅拌40 min,使蛋白质充分溶解,然后11 000 r/min离心15 min,取上清液。凯氏定氮法测定上清液中蛋白质量。按式(2)计算蛋白质样品的溶解性。

以大豆蛋白替代萝卜籽粕蛋白质,做相同实验,加以比较。

1.3.5.2 水合能力的测定

准确称取3.0 g萝卜籽粕蛋白于100 mL的烧杯中,加入30 mL水搅拌1 h,使之充分吸水后移至50 mL的离心管中,11 000 r/min离心20 min,去上清液,称质量。按公式(3)计算水合能力。

式中:m为萝卜籽粕蛋白质量/g;m1为吸水前萝卜籽粕蛋白和离心管总质量/g;m2为吸水后萝卜籽粕蛋白和离心管总质量/g。

以大豆蛋白替代萝卜籽粕蛋白质,做相同实验。

1.3.5.3 吸油能力的测定

准确称取5.0 g萝卜籽粕蛋白于已经称质量的离心管中,加入30 mL的一级大豆油,振荡2 min,置于60 ℃的水浴锅中保温30 min,使之充分吸油,11 000 r/min离心20 min后,将离心管上层的油全部除去,称质量。按式(4)计算蛋白质样品的吸油能力。

式中:m为萝卜籽粕蛋白质量/g;m1为吸油前萝卜籽粕蛋白质和离心管总质量/g;m2为吸油后萝卜籽粕蛋白质和离心管质量/g。

以大豆蛋白替代萝卜籽粕蛋白,做相同实验。

1.3.5.4 EAI与ESI的测定

取2 g的萝卜籽粕蛋白溶于40 mL 0.05 mol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲液中,然后与40 mL一级大豆油混合,在10 000 r/min搅拌机中搅拌3 min,形成均一的乳化液后,立即用移液管从底部取1.0 mL该乳化液,加入20 mL 0.1%的SDS溶液,快速摇匀后在500 nm波长处测定吸光度,记为A0(以SDS溶液为空白),将乳化液静置30 min后,从底部取1.0 mL,同样稀释、比色,记录吸光度A30。按式(5)、(6)计算蛋白样品的EAI及ESI。

式中:m为萝卜籽粕蛋白质量/mg;φ为油相所占的体积分数(5.66%)。

以大豆蛋白替代萝卜籽粕蛋白质,做相同实验。

1.3.5.5 起泡性和泡沫稳定性的测定

准确称取1.0 g萝卜籽粕蛋白,溶于100 mL蒸馏水中,调pH值至7.0,然后在8 000 r/min搅拌机中均质2 min,快速倒入500 mL量筒中,在室温下记录泡沫总体积V0/mL,静置30 min后记录泡沫总体积V30/mL。然后按式(7)、(8)计算萝卜籽粕蛋白的起泡性和泡沫稳定性。

以大豆蛋白替代萝卜籽粕蛋白,做相同实验。

1.3.6 萝卜籽粕蛋白体外抗氧化活性测定

采用萝卜籽粕蛋白清除DPPH自由基、、H2O2、•OH评价其抗氧化活性[17-19]

1.3.6.1 萝卜籽粕蛋白质清除DPPH自由基活性测定

取不同含量的萝卜籽粕蛋白质溶液3.0 mL于试管中,分别加入0.6 mL的0.4 mmol/L DPPH溶液,再加6.0 mL蒸馏水。混匀反应体系,置于黑暗中反应30 min,于517 nm波长处测定吸光度A1;将不同含量的萝卜籽粕蛋白质溶液与无水乙醇等体积混合于试管中,摇匀,于黑暗处反应30 min,于517 nm波长处测定吸光度A2;再将DPPH与蒸馏水等体积混合,测517 nm波长处的吸光度A0;以蒸馏水和无水乙醇的等体积混合溶液作空白用于仪器调零,每个实验做3 次平行实验,按式(9)计算萝卜籽粕蛋白质对DPPH自由基的清除率。

1.3.6.2 萝卜籽粕蛋白质清除活性测定

在反应体系中依次加入1 mL 0.2%亚硝酸钠标准使用液,加入蛋白质液1 mL,置于37 ℃水浴锅中10 min后取出,分别加入2 mL 0.4%对氨基苯磺酸溶液,充分混匀后,反应3 min,再加入1 mL 0.2%盐酸萘乙二胺溶液,反应15 min后,在538 nm波长处测定溶液的吸光度A1;同时做空白实验,测定吸光度A0;每个实验做3 次平行实验,按式(10)计算萝卜籽粕蛋白质对NO2-的清除率。

1.3.6.3 萝卜籽粕蛋白质清除H2O2活性测定

取不同浓度蛋白溶液2.0 mL于试管中,分别加入4.8 mL磷酸盐缓冲液(0.1 mol/L,pH 7.4)和1.2 mL 40 mmol/L H2O2溶液,混匀,于室温下放置10 min,230 nm波长处吸光度A1。以蒸馏水替代样品做相同实验,吸光度A0。以蒸馏水替代H2O2和样品做相同实验,吸光度A2。每个实验做3 次平行实验。按式(11)计算萝卜籽粕蛋白质对H2O2的清除率。

1.3.6.4 萝卜籽粕蛋白质清除·OH活性测定

在反应体系中依次加入1 mL 0.75 mmol/L的邻二氮菲溶液,1.5 mL 150 mmol/L(pH 7.5)的磷酸盐缓冲液,充分混匀后,再加入1 mL 0.75 mmol/L硫酸亚铁溶液,立即摇匀,再向反应体系中加入不同浓度的蛋白质溶液1 mL,均匀后,加入1 mL 0.01%的H2O2溶液,混匀后37℃反应30 min,于536 nm波长处测吸光度A2。以等体积蒸馏水代替蛋白质样品做相同实验,测定吸光度A1。以等体积蒸馏水代替蛋白质和H2O2溶液做相同实验,测定吸光度A0。重复上述实验3 次,按公式(12)计算萝卜籽粕蛋白质对·OH的清除率。

1.4 数据分析

实验结果采用SPSS 17.0软件进行分析,以表示。

2 结果与分析

2.1 萝卜籽粕蛋白组分组成

萝卜籽粕蛋白主要以球蛋白、谷蛋白和清蛋白为主,分别占总蛋白质量的44%、33%、21%,醇溶蛋白含量很少,只占总蛋白质的2%。Ikeda等[20]研究认为,球蛋白、谷蛋白对胃蛋白酶和胰蛋白酶敏感,属易消化蛋白,萝卜籽粕蛋白中的球蛋白和谷蛋白占总蛋白质量的77%,预示萝卜籽粕蛋白易被人体消化吸收。醇溶蛋白和谷蛋白是构成面筋蛋白的主要成分,它们在萝卜籽粕蛋白中的比例只有35%,在一定程度上会制约萝卜籽粕蛋白的食品加工特性。

2.2 萝卜籽粕蛋白氨基酸组成及营养价值评价

表1 萝卜籽粕蛋白的氨基酸组成及含量
Table 1 Amino acid composition of radish seed meal protein isolate

从表1可以看出,萝卜籽粕蛋白含18 种氨基酸。功能性氨基酸中的谷氨酸含量最高,为157 mg/g,其次是精氨酸、天冬氨酸和亮氨酸,分别为70、62、61 mg/g,再次是赖氨酸、甘氨酸、脯氨酸,分别为49、49、47 mg/g。必需氨基酸含量(342 mg/g)占氨基酸总量(798 mg/g)的43%,必需氨基酸与非必需氨基酸含量的比值为0.75,接近或超过FAO/ WHO建议的40%和0.6[14]。亲水性氨基酸总量为518 mg/g,远大于疏水基氨基酸总量(280 mg/g),有利于在食品工业中应用。根据文献[21-22],天冬氨酸和谷氨酸都有较强的抗氧化能力,另一些氨基酸,如脯氨酸、精氨酸等也具有一定的抗氧化能力,而在萝卜籽粕蛋白中,这些氨基酸的含量很高,预示萝卜籽粕蛋白可能具有很好的抗氧化能力。

以FAO/WHO模式为参考,根据公式(1)及表1计算出的萝卜籽粕蛋白的AAS值见表2。与大豆蛋白相似,萝卜籽粕蛋白中的第一限制氨基酸为蛋氨酸,其AAS值为57,而大豆蛋白为51。对于一种蛋白质来说,若仅从化学的角度评价其营养价值,一般AAS值越高,说明其营养价值越高,可以认为萝卜籽粕蛋白的营养价值稍高于大豆蛋白。还可以看出,除蛋氨酸外,萝卜籽粕蛋白中的其他AAS值都在80~90之间,说明了氨基酸之间的配比较平衡,有利于人体利用。而大豆蛋白的其他AAS值在75~120之间,较萝卜籽粕蛋白稍显不平衡。也再一次说明,萝卜籽粕蛋白的营养价值稍高于大豆蛋白。当然,综合评价两种蛋白的营养价值需要多种指标,有望在今后的研究中完善。

表2 萝卜籽粕蛋白质AAS
Table 2 AAS of radish seed meal protein isolate

2.3 蛋白质的功能性质

表3 萝卜籽粕蛋白的功能性质
Table 3 Functional properties in radish seed meal protein isolate

由表3可知,萝卜籽粕蛋白的溶解性和水合能力分别为(38.55±0.38)%和(3.78±0.36)g/g,高于大豆蛋白,可能与萝卜籽粕蛋白的亲水性基团的数量较多有关。蛋白质的起泡能力和稳定性取决于其溶解性,萝卜籽粕蛋白的高溶解性,已经决定了其良好的起泡性和泡沫稳定[25-26];萝卜籽粕蛋白的起泡性为(115.00±1.97)%,泡沫稳定性为(56.00±0.46)%,均高于大豆蛋白,也验证了这一理论。

萝卜籽粕蛋白的EAI为(29.12±0.29)cm2/mg,ESI为(4.83±0.74)min,与大豆蛋白相比,萝卜籽粕蛋白的EAI及ESI都较大豆蛋白好,在食品工业的应用中,萝卜籽粕蛋白应具有更高的价值[27]。萝卜籽粕蛋白的吸油能力为(1.84±0.11)g/g,稍低于大豆蛋白。

2.4 萝卜籽粕蛋白质的抗氧化能力

由图1可知,萝卜籽粕粗蛋白及其4 种蛋白组分对DPPH自由基、•OH、NO2-、H2O2都有一定的清除能力,且随蛋白质含量的升高,清除率也随之上升。其中,对DPPH自由基的清除能力按强弱排序依次为清蛋白>粗蛋白、醇溶蛋白>球蛋白>谷蛋白;对·OH、NO2-、H2O2的清除率按强弱排序依次为谷蛋白>粗蛋白>球蛋白>清蛋白>醇溶蛋白。

图1 萝卜籽粕蛋白对DPPH自由基(A)、•OH(B)、(C)、H2O2(D)的清除率
Fig. 1 Scavenging effects of radish seed protein isolate on DPPH free radicals (A), ·OH (B),(C), H2O2(D)

由图1A可知,在蛋白质含量为0.14 mg/g时,清蛋白对DPPH自由基的清除率可达(77.2±1.7)%,粗蛋白、醇溶蛋白、球蛋白分别仅为(31.8±1.7)%、(27.4±2.0)%和(22.4±1.8)%,谷蛋白只有(6.1±1.4)%。粗蛋白清除DPPH自由基的能力差于清蛋白,与其中的谷蛋白和球蛋白占比例较大,而清除DPPH自由基的能力较差有关。由图1B可知,醇溶蛋白对•OH的清除能力远低于其他4 种蛋白,在最大蛋白质含量0.14 mg/g处,醇溶蛋白对•OH的清除率只有(46.4±2.1)%,而清蛋白为(88.5±1.8)%,球蛋白为(92.4±2.2)%,谷蛋白与粗蛋白为100%。图1C显示,清蛋白和醇溶蛋白对NO2-的清除能力相近,但远低于其他3 种蛋白,在最大蛋白质含量0.14 mg/g,清蛋白和醇溶蛋白对的清除率分别只有(35.4±1.4)%和(32.5±1.9)%,而球蛋白、粗蛋白、谷蛋白分别为(72.3±1.5)%、(80.5±1.6)%和(85.3±2.0)%。由图1D可知,在最大蛋白质含量0.14 mg/g,醇溶蛋白对H2O2的清除率远低于其他4 种蛋白,醇溶蛋白对H2O2的清除率只有(44.4±2.0)%,而清蛋白、球蛋白、粗蛋白、谷蛋白分别为(76.9±2.1)%、(83.2±1.7)%、(86.1±2.2)%和(96.4±1.6)%。

相同蛋白含量下,粗蛋白、谷蛋白、球蛋白对•OH、H2O2、DPPH自由基的清除有相同的规律,清除率由大到小分别为•OH、H2O2、DPPH自由基;粗蛋白、谷蛋白、球蛋白对DPPH自由基的清除率远低于对•OH、H2O2、NO2-的清除率。清蛋白清除•OH、H2O2、DPPH自由基的能力中,对•OH的清除能力最强,清除的能力最差,清除H2O2、DPPH自由基的能力相近。醇溶蛋白清除•OH、H2O2、DPPH自由基的能力由大到小分别为H2O2、•OH、、DPPH自由基,由于在最大含量0.14 mg/g处,对H2O2的清除率只有(44.4±2.0)%,可以认为,萝卜籽粕蛋白的4 种组分中,醇溶蛋白的抗氧化能力最差。萝卜籽粕蛋白蛋比菜籽粕蛋白[28]、荞麦蛋白[29]、铁棍山药蛋白质[30]具有更好的清除DPPH自由基、•OH的能力。

3 结 论

萝卜籽粕蛋白的组成中球蛋白、谷蛋白、清蛋白和醇溶蛋白分别占总蛋白质的44%、33%、21%和2%。萝卜籽粕蛋白中含18 种氨基酸,其中谷氨酸含量最高,其次是精氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、赖氨酸等,第一限制氨基酸为蛋氨酸,AAS评分值为57;必需氨基酸的构成比及AAS评分都优于大豆蛋白。与大豆蛋白相比,萝卜籽粕蛋白具有很好的溶解性、水合能力、起泡性、泡沫稳、EAI和ESI,吸油能力稍差于大豆蛋白。萝卜籽粕蛋白质及其四组分对DPPH自由基、•OH、及H2O2都具有清除能力。粗蛋白、谷蛋白、球蛋白对•OH、及H2O2有很好的清除能力。清蛋白对•OH、H2O2、DPPH自由基有较好的清除能力。4 种蛋白质中,醇溶蛋白的抗氧化能力最差。如今,人们应用较多的优质植物蛋白源只有大豆蛋白,显得很单一。由于萝卜籽粕蛋白营养价值高,并且有很好的功能性质及一定的抗氧化能力,因此萝卜籽粕蛋白具有很高的开发价值。

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Composition and Functional Properties of Proteins in Radish Seed Meal

ZHAO Gongling, LIANG Xinhong, GUO Yancheng, KONG Jin*, LI Keke, KANG Chaodi, SHI Cuiping
(School of Food Science, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China)

Abstract:This study aimed at the extraction, fractionation and functional characterization of proteins from radish seed meal.According to their solubility, albumin, globulin, glutelin and prolamin were separated from radish seed meal. The amino acid composition of the protein isolate extracted from radish seed meal was determined with an automatic amino acid analyzer and its functional properties and 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl free radicals, ·OH, NO2-and H2O2scavenging capacity of in vitro were analyzed by physical and chemical methods. Results showed that globulin, glutelin, albumin and prolamin accounted for 44%, 33%, 21% and 2% of the total proteins in radish seed meal. Eighteen amino acids were detected in the protein isolate, and the ベrst limiting amino acid was methionine with an amino acid score of 57. From this study, we concluded that radish seed meal proteins have good functional properties and antioxidant capacity and thus can be regarded as a potentially valuable resource that can be developed into high-value products.

Keywords:radish seed meal; protein; amino acid composition; functional properties; antioxidant capacity

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201803018

中图分类号:TS229

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2018)03-0117-06

引文格式:赵功玲, 梁新红, 郭延成, 等. 萝卜籽粕蛋白质的组成及功能性质[J]. 食品科学, 2018, 39(3): 117-122.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201803018. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Gongling, LIANG Xinhong, GUO Yancheng, et al. Composition and functional properties of proteins in radish seed meal[J]. Food Science, 2018, 39(3): 117-122. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201803018.http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2016-10-27

基金项目:河南省基础与前沿技术研究计划项目(142300410141;152300410096);河南省高等学校重点科研项目(16A550014)

第一作者简介:赵功玲(1968—),女,副教授,硕士,研究方向为食品营养与卫生。E-mail:hnzgl@163.com

*通信作者简介:孔瑾(1957—),男,副教授,硕士,研究方向为食品生物活性物质。E-mail:kongjin320@sohu.com