中国是世界肉类产销总量最多的国家，据国际肉类组织公布数据显示，中国畜禽肉类生产总量约占世界的27%[1]。冻藏作为肉类最重要的贮藏方式，能有效抑制微生物生长繁殖、延长货架期，是肉类产品进出口贸易和地区间流通的主要产品形态。然而，肉品在经冷冻、冻藏、解冻后汁液流失与品质劣变十分严重[2-4]。肉品的保水性是衡量肉品品质重要的指标之一，直接影响肉品的感官品质与食用品质[5]。我国冷冻肉解冻后汁液损失严重，给生产企业造成很大的经济损失[6]。因此，探究提高肉品保水性的新型冻结解冻技术具有极其重要的意义。
目前，肉类冻结解冻技术主要有超高压冻结解冻、电场冻结解冻、超声波冻结解冻、磁场冻结、微波解冻和静电场辅助冻结-解冻技术等[7]，其中静电场辅助冻结-解冻技术具有效率高、设备成本低、操作简单等优势[8]。该技术有助于提高冷冻食品的解冻速率、降低汁液流失、使解冻后肉品温度均匀、减少食品油脂酸化、抑制微生物生长、提高食品品质。静电场技术最早被用于水果和蔬菜的保鲜[9-12]，Bajgai等[13]运用高压静电场技术延长了水果保质期。Hsieh[14]、郭衍银[15]等在胡萝卜汁与冬枣的研究中得出相似结论，经高压静电场处理后蔬果的保质期长，新鲜度和营养价值得到提高。Zhao Ruiping等[16]认为静电场辅助处理可以提高青西红柿的抗氧化能力。也有学者先后在肉制品和水产品品质控制方面进行了研究。Hsieh等[17]发现，冷冻鸡胸肉在高压静电场作用下，其解冻时间较对照组缩短，多种微生物指标低于对照组。孙芳等[18]的研究发现，与常规解冻相比，高压静电场技术可缩短冻结牛肉解冻时间，显著降低解冻汁液流失。He Xiangli等[8]认为高压静电场对肉品嫩度及相关食用品质产生有益效果。Mousakhani-Ganjeh等[9]研究表明，静电场能显著提高冷冻鱼块解冻速率和挥发性盐基氮。但高压静电场的输出电压通常高于3 000 V，存在一定的安全隐患，具有一定局限性，不能运用于大规模食品冻结与解冻[19-20]。
低压静电场（low voltage electrostatic field，LVEF）可产生2 500 V左右的空间电势，影响食品内部细胞的生命活力、冻结及解冻速率，不仅较高压静电场作用安全、节能，并且能达到食品保鲜、延长食品货架期的目的，已引起广泛关注[21]。Uemura等[22]的研究发现LVEF可显著减少猪肉的解冻时间。路立立[23]的研究中，同样认为通过静电场处理可提高猪肉冻结、解冻速率及解冻后嫩度。但是目前学者的研究主要集中在肉品品质变化方面，关于静电场辅助冻结-解冻对于肉品蛋白质中水分迁移规律未知，对蛋白质理化特性的研究较少。为探究基于静电场辅助冻结-解冻条件下肌肉水分分布规律，揭示蛋白质理化特性的变化，本实验研究2 500 V LVEF环境下对牛肉保水性及蛋白理化特性的影响，为冷冻肉品质控制技术开发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
原料肉由北京御香苑畜牧有限公司提供，检疫合格、质量约为400 kg的2 岁龄草原黄牛背最长肌（Boine Longissmus dorsi）。牛屠宰后经48 h吊挂风冷排酸，从6 头情况相近的公牛胴体中分别取2 块背最长肌，共12 块肉样，每块约为5 cm×4 cm×4 cm，运回实验室后4 ℃冷藏并进行后续实验。
实验所用常规试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；735型温度仪 德国德图仪器有限公司；BCDW-228冰箱、DW-86L386型立式超低温保存箱 青岛海尔股份有限公司；Kjeltec 2300微量凯氏定氮仪 丹麦FOSS公司；Q200差示扫描量热（differential scanning calorimetry，DSC）仪 美国TA公司；Allegra X-12R冷冻离心机 美国Beckman Coulter有限公司；T6紫外分光光度计 北京普析通用有限公司；MesoMR23-060H-I低场核磁共振（low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）分析及成像系统 上海纽迈电子科技有限公司；DENBA＋鲜度保持电场装置 日本AGUA商事株式会社。
1.3 方法
1.3.1 样品处理
本实验所采用的LVEF装置由静电场发生装置和放电板组成，放电板在冷藏库内产生LVEF，形成负离子环境，物料不与放电板直接接触，输出电压2 500 V、电流0.2 mA，即为LVEF。其原理是离子化的气体在电场内移动，从而使带电粒子再受电场作用，从一极向另一极进行定向移动，达到加工所需目的。
12 块肉样随机平均分为4 组，分别为自然冻结-解冻（conventional freezing-conventional thawing，C-C）组（对照组）、LVEF辅助冻结-解冻（LVEF freezing-LVEF thawing，L-L）组、自然冻结-LVEF辅助解冻（conventional freezing-LVEF thawing，C-L）组、LVEF辅助冻结-自然解冻（LVEF freezing-conventional thawing，L-C）组。用透明聚乙烯膜包装后在-18 ℃冰柜中进行冻结-解冻实验，肉样距离静电板均为30 cm。
将温度仪探头插入样品几何中心记录其中心温度，每隔5 min记录一次温度。当肉样中心温度低至所设冻结温度-18 ℃时，取出肉样放置于4 ℃冰箱中进行解冻实验，至中心温度为1 ℃时视为解冻完全。
1.3.2 指标测定
1.3.2.1 冻结-解冻曲线绘制
样品冻结解冻过程中，将温度仪插入样品几何中心记录其中心温度，每隔5 min记录一次温度，绘制冻结-解冻曲线[24]。冻结、解冻速率v按照式（1）、（2）国际制冷协会提出的计算方法进行计算[25]。
式中：v1为冻结速率/（cm/h）；δ1为冻结过程中样品表面到热中心最短距离/cm；t1为样品表面达0 ℃至热中心温度达初始冻结点以下10 ℃所需的时间/h；v2为解冻速率/（cm/h）；δ2为解冻过程中样品表面与热中心的最短距离/cm；t2为样品表面达0 ℃至热中心温度达2 ℃所需的时间/h。
1.3.2.2 解冻汁液流失率测定
参照Honikel[26]的方法，准确称量解冻前、后肉块的质量，分别记为m1、m2，按照式（3）计算解冻汁液流失率。
1.3.2.3 肌原纤维蛋白表面疏水性测定
参照李银等[27]的方法，从牛肉样品中分离提取肌原纤维蛋白，再根据Chelh等[28]的方法，将肌原纤维蛋白悬浮液用20 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.0）调成2 mg/mL的溶液，取2 mL蛋白稀释液并加入40 μL 1 mg/mL的溴酚蓝溶液，充分混合。空白组为2 mL磷酸盐缓冲液中直接加入40 μL 1 mg/mL溴酚蓝溶液。将4 组样品置于室温条件下振荡10 min，然后在4 ℃条件下4 000×g离心15 min。上清液在595 nm波长处测定吸光度。按照式（4）计算结合态溴酚蓝质量，作为表面疏水性指数。
式中：A1为空白组吸光度；A2为样品吸光度。
1.3.2.4 热稳定性分析
参考Deng等[29]的方法。准确称取肉样10～16 mg，立即密封于铝盒中，放入DSC仪中测定，并以空铝盒为空白对照，测定条件为：样品于20 ℃平衡2 min，再以3 ℃/min的速率升到100 ℃；每个样品平行测定3 次，结果取3 次平均值。再参照李侠等[24]的计算方法将所得蛋白质DSC热流图换算为蛋白质变性温度和变性焓。
1.3.2.5 水分迁移程度分析
参照谢小雷等[30]的方法，采用磁共振成像技术（magnetic resonance imaging，MRI）测定牛肉H质子密度图像，使用MesoMR23-060H-I LF-NMR分析及成像系统，将实验样品放入永磁场中心位置的射频线圈中心，进行成像实验。主要参数为：重复时间2 000 ms，重复次数4 次，纵向弛豫时间20 ms；根据CPMG（Carr-Purcell-Meiboom-Gill）脉冲序列测得的弛豫时间T2，选择自旋回波时间20 ms。
1.4 数据统计分析
本实验中采用Microsoft Excel 2010软件处理数据并绘制分析图，除特殊说明外，指标测定均为3 次平行测定结果，表示为
利用IBM SPSS Statistics 19统计分析软件进行Duncan法多重比较及显著性分析，P＜0.05表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 LVEF对冻结-解冻速率的影响
图1 牛肉冻结-解冻过程中心温度变化
Fig. 1 Changes in internal temperature of beef during freezing and thawing process
图1分别为4 个处理组肉样的冻结和解冻曲线。冻结过程的温度曲线趋势大体相同，分为明显下降、平缓下降、明显下降3 个阶段。冻结过程中，样品内部80%以上水分都冻结成冰，释放相变热，温度下降缓慢，曲线平缓，该冰晶带的起始温度点即为冻结点。自然冻结与LVEF辅助冻结样品通过最大冰晶生成带历时分别为6.08 h和2.67 h，LVEF辅助冻结较自然冻结历时缩短了3.41 h。
表1 不同处理条件牛肉冻结-解冻速率和冻结-解冻时间变化
Table 1 Changes in freezing-thawing rate and freezing-thawing time of beef subjected to different treatments
注：同列肩标小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下同。
如表1所示，C-C组所需冻结时间为26.210 h，L-L、C-L、L-C组所需冻结时间分别为9.920、25.420 h和10.000 h。C-C组所需解冻时间为22.710 h，L-L、C-L、L-C组所需解冻时间分别为13.790、18.960 h和15.330 h。L-L组肉样冻结时间较对照组缩短16.290 h，解冻时间较对照组缩短8.920 h，可见LVEF处理的样品所需冻结-解冻时间较对照组明显缩短，可以有效提高牛肉冻结-解冻速率。
2.2 LVEF对解冻汁液流失的影响
图2 不同处理条件牛肉解冻汁液流失率（A）及蛋白质含量（B）
Fig. 2 Drip loss (A) during thawing and protein content (B) in beef subjected to different treatments
小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下同。
冷冻肉在解冻过程中汁液流失严重，流失的汁液中含有可溶性蛋白质，使肉品的营养损失。由图2A可知，4 组肉样解冻汁液流失率分别为8.30%、4.19%、4.28%和6.58%。由图2B可知，4 组肉样流失汁液中蛋白质含量分别为10.61%、9.91%、8.95%和10.10%。C-C组肉样解冻汁液流失率、流失汁液中蛋白质含量显著高于其他3 组（P＜0.05），L-L组肉样解冻汁液流失最少。结合图1可知，LVEF处理可使肉样冻结过程中通过最大冰晶生成带所用时间短，冻结与解冻速率快，有利于降低解冻过程中肉样汁液流失，从而保持牛肉的营养和风味[31]。
2.3 LVEF对肌原纤维蛋白表面疏水性的影响
蛋白质表面疏水性是表征与外界极性水环境相连的蛋白质表面疏水性基团数量的一个重要标志，其值越大则蛋白持水性越小，也预示着蛋白质的保水能力越弱，结合水和不易流动水越容易“态变”为自由水，解冻后汁液流失率也就越高。
图3 不同处理条件牛肉蛋白质表面疏水性变化
Fig. 3 Effect of different treatments on surface hydrophobicity of beef proteins
大写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
图3分别为4 个处理组肉样冻结-解冻过程蛋白质表面疏水性变化情况。C-C组与L-L、C-L、L-C组的肉样在冻结过程中肌原纤维蛋白吸附结合态溴酚蓝的质量分别为27.57、16.16、27.57 μg和16.16 μg。在解冻过程中肌原纤维蛋白吸附结合态溴酚蓝的质量分别为13.14、9.45、4.37 μg和3.47 μg，各组间差异显著（P＜0.05）。蛋白质表面疏水性升高可能是蛋白质分子解折叠，使肽链断裂或结构伸展，分子的内部疏水基团暴露。本实验研究发现自然冻结-解冻处理的牛肉样品中蛋白质表面疏水性最低，表明LVEF冻结或解冻处理均能有效抑制疏水基团的暴露，结合图2可知，LVEF处理能够延缓牛肉中蛋白在解冻过程中水合能力的下降，降低解冻汁液流失。
2.4 LVEF对蛋白热稳定性的影响
借助DSC记录热流量随时间或温度变化形成的曲线。就蛋白质体系而言，当提高到某个特定温度时，蛋白质本身受热发生转变，使蛋白质发生热解旋或凝聚，蛋白质之间、蛋白质与周围溶剂之间的相互作用导致热量差的产生，在DSC曲线上形成“波峰”或“波谷”，其对应的横坐标表示热转变发生的温度[32]，从而体现蛋白质的变性程度。
表2 不同处理条件牛肉蛋白质DSC分析结果
Table 2 DSC analysis of proteins in beef subjected to different treatments
研究表明，一个典型的肌肉DSC图谱有3 个热转变区域；发生在54～58 ℃之间第1个热吸收峰是由于主要由肌球蛋白受热转变而引起的，发生在65～67 ℃之间的热吸收峰由胶原质和肌浆蛋白变性引起，出现在80～83 ℃之间的峰是由肌动蛋白变性所引起的[33-34]。因此，峰1～3分别代表肌球蛋白、肌浆蛋白和肌动蛋白热稳定性的变化情况。峰的顶点温度为蛋白变性温度，3 个区域的峰面积代表蛋白质的变性焓。本实验测定的3 个峰的温度范围分别为40～56、60～64、77～80 ℃。变性温度反映了蛋白质稳定性，变性温度越高，其稳定性越高。变性焓反映了蛋白质变性的大小，其值越大，说明变性越小，抗变性能力越强[24]。
由表2可得，C-C组峰1、峰2热变性温度和变性焓显著低于其他处理组（P＜0.05），L-L组峰1的热变性温度、变性焓显著高于其他处理组（P＜0.05），各处理组峰3的热变性温度、变性焓之间无显著性差异（P＞0.05）。这表明LVEF处理使肉样肌球蛋白、肌浆蛋白的稳定性较高，有助于维持肉样该蛋白的抗变性能力，且该蛋白的变性程度小于LVEF辅助冻结作用或LVEF辅助解冻作用（L-C组和C-L组）。
2.5 LVEF对水分迁移程度的影响
LF-NMR技术是通过测定质子在磁场中的弛豫特性来研究样品中含水率、水分分布、迁移及其他相关品质，主要包括MRI和磁共振波谱分析（magnetic resonance spectroscopy，MRS）技术。通过LF-NMR技术测定H质子的横向弛豫时间T2来表征肌肉中水分的变化规律[35]。H质子的弛豫时间与水分的流动性密切相关，在食品体系中，水分状态的不同，都会使弛豫时间T2发生改变[36]。肌肉中不同活动状态的水，包括结合水、不易流动水和自由水，分别用T21、T22、T23所对应的峰面积来表示各自的相对含量[37]。
表3 不同处理条件牛肉水分分布及组成
Table 3 Moisture distribution and composition of beef subjected to different treatments
由表3可知，冻结过程C-C组不易流动水T22、自由水T23在NMR图谱上信号较弱，相对含量较低，结合水T21相对含量达到97.100 0%，L-L组不易流动水T22未检出，结合水T21相对含量大于对照组，自由水T23相对含量反之。解冻后，由于蛋白质复性及表面疏水性的降低，发生水分回吸现象，部分自由水态变为不易流动水。对照组解冻后的牛肉中较易转变为自由水，形成解冻损失，而L-L组肉样中不易流动水相对比例较高，自由水相对含量为0.120 00%（P＜0.05）。推测认为，LVEF处理影响了牛肉中不同活动状态水的分布情况，使解冻后自由水含量显著降低，从而解冻汁液损失降低。
利用MRI技术可以获得肌肉中水、脂肪等成分的高分辨率H质子密度像，能直观地表现出肌肉中水分的分布及迁移[38-39]。MRI伪彩图像中亮度越强，表明H质子信号越强，该部分的含水率越高。
图4 不同处理条件牛肉冻结-解冻过程H质子密度加权伪彩图
Fig. 4 Weighted pseudo color images of H proton density in beef during different freezing-thawing processes
如图4所示，在冻结过程中，自然冻结肉样H质子密度图像显示出零星的“亮点”，而LVEF辅助冻结处理的肉样H质子密度图像中的“亮点”几乎检测不到；解冻后，L-L组肉样较多地呈现出红褐色，说明该处理组含水率丰富，C-C、C-L、L-C组解冻后肉样较多地呈现出蓝色，红褐色较少，说明该处理组汁液流失较严重。LVEF辅助冻结-解冻能有效降低汁液流失率。
3 结 论
LVEF辅助冻结-解冻处理能够显著缩短肉样通过最大冰晶生成带的时间和解冻时间，有效提高牛肉冻结-解冻速率，有助于维持肌原纤维蛋白的抗变性能力和热稳定性，提高解冻过程中蛋白水合能力，降低肌肉中的自由水含量，从而有效地减少牛肉解冻汁液流失率，提高肌肉保水性。
LVEF辅助冻结-解冻处理可提高肉与肉制品品质，LVEF不仅比高压静电场更安全、节能，并且同样能达到食品保鲜、延长货架期的目的。但LVEF对食品在冻结及解冻过程中的影响机制还需进一步研究。
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