葡萄籽原花青素提取物对砷诱导人肝细胞HL-7702损伤的保护作用及其机制

徐孟川,李述刚*,丁玉松,牛 强,冯刚玲,申 卉,郭方明

(石河子大学医学院,新疆 石河子 832000)

摘 要:目的:研究葡萄籽原花青素提取物(grape seed proanthocyanidin extract,GSPE)对砷诱导的人肝细胞HL-7702损伤的保护作用及其机制,为砷中毒的防治和GSPE的抗氧化研究提供理论依据。方法:将人肝细胞HL-7702分为对照组、砷染毒组(25 μmol/L)、GSPE干预组(5、10、25、50 mg/L)以及GSPE单独干预组(50 mg/L),分别处理24 h和48 h后,分别测定天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate transaminase,AST)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平以及总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)变化。噻唑蓝(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-yl)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT)法分析细胞生存率,利用实时定量聚合酶链式反应以及Western blot法检测HL-7702细胞中核因子E2相关因子(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)、血红素氧合酶1(heme oxygenase 1,HO-1)、醌氧化还原酶1(quinone oxidoreductase 1,NQO1)和谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase,GST)的mRNA以及蛋白表达。结果:MTT实验发现,与对照组比较,高浓度砷(≥25 μmol/L)染毒组细胞存活率显著降低(P<0.05)。GSPE干预组(>10 mg/L)细胞中的ALT和AST活力、MDA水平显著低于砷染毒组(P<0.05),SOD活力、GSH含量以及T-AOC水平显著高于砷染毒组(P<0.05),GSPE干预组HL-7702细胞中Nrf2、HO-1、NQO1、GST的mRNA及蛋白表达增高(P<0.05)。结论:GSPE对砷诱导的人肝细胞HL-7702氧化损伤具有拮抗作用,且具有一定的剂量效应关系,其机制可能是通过激活Nrf2介导的抗氧化信号通路,提高细胞抗氧化能力,从而改善砷引起的肝损伤。

关键词:葡萄籽原花青素提取物;砷;抗氧化活性;核因子E2相关因子

无机砷是一种自然界广泛存在的环境污染物。全球约有1.4亿 人的健康受到砷暴露的威胁[1]。研究发现,砷可以导致肝脏纤维化、心血管疾病、神经系统疾病以及多系统肿瘤等[2]。研究显示,肝脏是砷毒性作用的重要靶器官之一,砷进入机体后在肝脏蓄积,可引起肝纤维化、肝硬化甚至是肝癌[3]。目前认为,砷导致机体发生氧化应激,产生过多的活性氧(reactive oxygen species,ROS)并破坏机体抗氧化防御系统[4]。核因子E2相关因子(nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2)是细胞对抗氧化应激的重要调控因子之一[5]。研究表明,砷可以抑制Nrf2的表达,减弱抗氧化反应[6-7]。原花青素是一种具有极强的自由基清除能力及抗氧化功效的多酚类物质[8-9],能有效降低人体血清中丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性和机体的总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)[10-11]。原花青素能有效清除多种ROS,具有抗氧化[12]、抗炎[13]、保护心血管[14]、抗肿瘤[15]和降血糖[16]等多方面的生物活性。研究发现,葡萄尤其是葡萄籽中含有较为丰富的原花青素[17]

但是关于葡萄籽原花青素提取物(grape seed proanthocyanidin extract,GSPE)能否拮抗砷导致的肝细胞HL-7702的氧化损伤及其分子机制鲜见报道。本研究以肝细胞HL-7702为对象,给予As2O3染毒,并施加GSPE进行干预,分析As2O3对HL-7702细胞毒性作用,评价GSPE对As2O3致HL-7702肝细胞毒性的拮抗效果,探讨其可能作用机制,为砷中毒防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

As2O3(分析纯) 北京化工厂;GSPE(纯度>95.0%) 天津尖峰天然产物研究开发有限公司;人肝细胞HL-7702(培养箱中培养) 上海和元生物技术股份有限公司。

天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate transaminase,A S T)试剂盒、丙氨酸氨基转移酶(a l a n i n e aminotransferase,ALT)试剂盒、蛋白标准测定试剂盒、谷胱甘肽(glutathione,GSH)试剂盒、SOD试剂盒、T-AOC试剂盒和MDA试剂盒 南京建成生物工程研究所;Nrf2检测抗体、血红素氧合酶1(heme oxygenase 1,HO-1)检测抗体、醌氧化还原酶1(quinone oxidoreductase 1,NQO1)检测抗体、谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase,GST)检测抗体 英国Abcam公司;DMEM高糖培养基、胎牛血清、胰蛋白酶 美国Gibco公司。

1.2 仪器与设备

Galaxy 170S二氧化碳恒温培养箱 德国Eppendorf公司;SW-CJ-2FD超净台 苏州净化设备有限公司;倒置相差显微镜、Varioskan Flash酶标仪 美国Thermo Fisher Scientific公司;EDC-810聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪 东胜创新生物科技有限公司;JY300水平电泳仪、JY02S紫外-可见光分析仪 北京君意东方电泳设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养

人肝细胞HL-7702常规培养于DMEM高糖培养基(含有10%胎牛血清(体积分数,下同)、100 kU/L青霉素、100 mg/L链霉素),在饱和湿度、5% CO2、37 ℃条件下培养,待细胞进入对数生长期后用0.25 g/100 mL胰蛋白酶消化传代。取处于对数生长期的细胞,随机分为7 组:对照组(正常培养)、砷染毒组(25 μmol/L砷溶液)、GSPE干预组(As+G1组:5 mg/L的GSPE溶液、25 μmol/L砷溶液;As+G2组:10 mg/L的GSPE溶液、25 μmol/L砷溶液;As+G3组:25 mg/L的GSPE溶液、25 μmol/L砷溶液;As+G4组:50 mg/L的GSPE溶液、25 μmol/L砷溶液)、GSPE单独干预组(50 mg/L的GSPE溶液)。配制1 000 μmol/L的As2O3母液以及1 000 mg/L的GSPE母液备用,染毒时用完全培养基稀释成相应浓度,加入细胞培养皿中,分别处理24 h和48 h后,检测各项指标,每组重复测3 次。

1.3.2 指标检测

1.3.2.1 细胞活性检测

人肝细胞HL-7702培养于96 孔板中,待细胞密度增至80%,用不同浓度的砷(0.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μmol/L)对细胞进行干预。24、48 h后,用噻唑蓝(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-yl)-3,5-diphenytetrazoliumromide,MTT)试剂盒进行细胞活性的检测。

1.3.2.2 氧化应激及肝功能指标检测

按照上述分组对细胞干预2 4 h和4 8 h后,0.25 g/100 mL胰酶消化后,1 000 r/min离心5 min,弃去上清液,收集细胞沉淀,在液氮反复冻融3~5 次以破碎细胞。分别按照相应试剂盒说明书的操作方法进行检测:硫代巴比妥酸法测定MDA含量、微量酶标法测定GSH含量、WST-1法测定SOD活力、比色法测定T-AOC水平、考马斯亮蓝法测定蛋白含量、赖氏法测定ALT以及AST活力。

1.3.2.3 mRNA及蛋白表达检测

表1 RT-PCR引物设计
Table 1 Primer sequences for RT-PCR

利用逆转录(reverse transcription,RT)-PCR和Western Blot法分别检测细胞内Nrf2、GST、HO-1、NQO1的mRNA和蛋白表达情况,具体检测方法参照文献[18]。细胞中待测蛋白的表达水平用其条带的总灰度值与内参蛋白(β-actin)条带的总灰度值的相对比值大小表示。RT-PCR引物设计见表1。

1.4 数据统计分析

采用Excel 2010软件处理数据,采用SPSS 17.0软件进行统计分析,多组间均数比较采用单因素方差分析,两两比较采用Bonferroni法,检验水平α=0.05。各组实验数据均以表示。

2 结果与分析

2.1 细胞活性变化

图1 不同浓度砷对细胞存活率的影响
Fig. 1 Effect of arsenic on the survival rate of cells

*.干预24 h后与对照组相比差异显著(P<0.05);#.干预48 h后与对照组相比差异显著(P<0.05)。

MTT实验发现(图1),当As2O3单独作用于细胞24 h后,与对照组相比,2.5 μmol/L时细胞活性显著增加,大于25.0 μmol/L时细胞活性明显降低(P<0.05)。As2O3单独作用于细胞48 h后,10.0 μmol/L时细胞活性开始显著下降,趋势与24 h基本一致。

2.2 细胞氧化应激水平及肝功能变化

由表2可知,砷染毒24 h和48 h后,与对照组比较,砷染毒组细胞内SOD活力、GSH含量、T-AOC水平明显降低,MDA含量显著升高(P<0.05);与砷染毒组相比,GSPE干预组随着GSPE质量浓度升高,细胞内SOD活力、GSH含量、T-AOC水平逐渐升高,而MDA含量逐渐下降;与对照组相比,GSPE单独作用24 h和48 h后,MDA含量升高,而GSPE单独作用48 h后,T-AOC水平增强,差异均具有统计学意义(P<0.05)。GSPE干预组与砷染毒组相比,随着GSPE质量浓度上升,ALT及AST活力逐渐降低,差异均具有统计学意义(P<0.05);GSPE单独干预组与对照组比较,总体上无明显差异。

表2 As2O3与GSPE作用24、48 h对HL 7702肝细胞氧化应激水平以及肝功能的影响(n= 3)
Table 2 Changes in oxidative stress and liver function induced by arsenic and GSPE in HL 7702 cells after 24 and 48 h (n= 3)

注:*.与对照组相比差异显著(P<0.05);#.与砷染毒组相比差异显著(P<0.05)。下同。

2.3 细胞内Nrf2及其下游基因mRNA表达变化

表3 干预24 h和48 h后Nrf2及其下游mRNA表达情况(n= 3)
Table 3 mRNA expression of Nrf2 and its downstream genes after 24 and 48 h treatment (n= 3)

由表3可知,与对照组相比,砷染毒组Nrf2、HO-1、NQO1、GST的mRNA表达明显降低,并且染毒48 h要低于染毒24 h;施加GSPE进行干预后,与砷染毒组比较,Nrf2、HO-1、NQO1、GST的mRNA表达量随着GSPE质量浓度的升高而逐渐上升,其中As+G3组和As+G4组均差异显著(P<0.05)。单独施加高剂量GSPE后,与对照组比较,Nrf2、HO-1、NQO1、GST的mRNA表达量无明显变化。

2.4 细胞内Nrf2及其下游基因蛋白表达变化

图2 Nrf2及其下游基因蛋白电泳图
Fig. 2 Protein electrophoresis of Nrf2 and its downstream genes

1~11.依次为对照组、砷染毒组处理24 h、砷染毒组处理48 h、As+G2组处理24 h、As+G2组处理48 h、As+G3组处理24 h、As+G3组处理48 h、As+G4组处理24 h、As+G4组处理48 h、GSPE单独干预组处理24 h、GSPE单独干预组处理48 h。

由图2、3可知,与对照组相比,砷染毒组Nrf2、HO-1、NQO1、GST蛋白表达明显降低,并且染毒48 h要低于染毒24 h;施加GSPE进行干预后,与砷染毒组比较,Nrf2、HO-1、NQO1、GST蛋白表达量随着GSPE质量浓度的升高而逐渐上升;单独施加高剂量GSPE后,与对照组比较,Nrf2、HO-1、NQO1、GST蛋白表达量无明显变化。

图3 Nrf2及其下游基因蛋白表达量变化
Fig. 3 Protein expression of Nrf2 and its downstream genes

A~D.分别为Nrf2、HO-1、NQO1、GST的蛋白表达量变化;a.与对照组处理24 h相比差异显著(P<0.05);b.与砷染毒组处理24 h相比差异显著(P<0.05);c.与对照组处理48 h相比差异显著(P<0.05);d.与砷染毒组处理48 h相比差异显著(P<0.05)。

3 讨 论

砷是一种已确定的人类致癌物。研究发现,砷中毒可以引起肝脏纤维化、肝硬化,严重者甚至会发生肝癌。因此,探讨拮抗砷的肝脏毒性作用对于砷中毒防控具有重要意义。

通过MTT实验发现,低剂量(0.0~2.5 μmol/L)砷在短时间(24 h)内可刺激肝细胞的生长。另外有研究表明,低剂量砷可以活化肝星状细胞[19],进而导致肝脏纤维化。而高浓度的砷则具有明显的细胞毒性,导致肝细胞活性显著降低(P<0.05)。通过检测肝细胞内氧化应激水平发现,砷使细胞内SOD活力、GSH含量下降,MDA含量上升,进一步导致细胞T-AOC水平下降,与Singh[20]和Kumar[21]等研究一致。这可能是因为砷引起肝细胞氧化应激,产生过多的ROS,消耗细胞内的SOD以及GSH,ROS导致脂质过氧化,产生MDA;另一方面,GSH含有巯基,能与三价砷结合形成复合物,也会对其产生消耗;此外,砷需要被甲基化才能被排出体外,而砷的甲基化过程也需要GSH的参与。ALT、AST是常被用于评价肝功能的指标,砷染毒组细胞内ALT、AST水平明显高于对照组,说明砷可以引起肝功能损伤。

大量研究表明原花青素具有较强的抗氧化活性[22-23]。本次研究也发现,施加GSPE干预后,与砷染毒组比较,细胞内SOD活力、GSH含量明显升高,而MDA含量显著降低(P<0.05)。说明GSPE具有良好的抗氧化效果,且具有一定的剂量关系。当GSPE质量浓度为50 mg/L时,能明显改善砷对肝细胞造成的氧化损伤。GSPE单独干预组与砷染毒组相比,ALT、AST水平显著降低,提示GSPE对砷引起的肝功能损伤具有一定的保护作用;但是,与对照组相比,GSPE单独干预组细胞氧化应激水平以及肝功能总体上并无明显差异,这可能是由于当机体处于正常状态时,并不需要GSPE的抗氧化能力,但是当机体受到氧化刺激的时候,GSPE则发挥其生物学活性,提高机体的抗氧化能力;这也表明高剂量(50 mg/L)的GSPE并不会对肝细胞造成损伤,是一种比较安全的抗氧化剂。

Nrf2/抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)信号通路是机体抵抗外界氧化和化学刺激的防御性转导通路[24]。Nrf2可以调控多种抗氧化酶(如GST、HO-1、NQO1)的表达[25],从而提高机体的抗氧化能力。本次研究发现,砷染毒组细胞中Nrf2、HO-1、NQO1以及GST的mRNA和蛋白的表达量均明显降低,与Shafik[26]、Rodriguez-Ramiro[27]等研究一致,说明砷可能是通过Nrf2信号通路抑制下游各抗氧化酶的表达来降低机体的抗氧化能力,进一步对肝细胞造成氧化损伤。与砷染毒组相比,GSPE干预组细胞中Nrf2、HO-1、NQO1以及GST的mRNA和蛋白的表达量均有所上升,与Gao Shuang等[28]研究一致。这可能是因为当机体受到刺激时,GSPE促使Nrf2与Keap1解离并进入细胞核[29],与DNA上的ARE元件结合[30],进而诱导其下游的HO-1、NQO1、GST等抗氧化酶的表达,发挥其抗氧化作用。

综上所述,GSPE对砷引起的细胞氧化损伤具有明显的抑制作用,能够改善砷导致的肝功能损伤,且具有一定的剂量关系,其最佳作用质量浓度在25~50 mg/L之间。原花青素的作用机制可能是通过活化Nrf2信号通路,进而抑制砷所致的肝脏氧化损伤。但是,GSPE调节Nrf2的确切机制尚需大量研究证实,进而为砷中毒的防治提供科学依据。

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Protective Mechanism of Grape Seed Proanthocyanidin Extract against Oxidative Damage Induced by Arsenic in HL-7702 Cells

XU Mengchuan, LI Shugang*, DING Yusong, NIU Qiang, FENG Gangling, SHEN Hui, GUO Fangming
(School of Medicine, Shihezi University, Shihezi 832000, China)

Abstract:Objective: To explore the protective mechanism of grape seed proanthocyanidin extract (GSPE) against oxidative damage induced by arsenic for the purpose of providing a theoretical foundation for the prevention and treatment of arsenic poisoning and for the evaluation of the antioxidant activity of GSPE. Methods: HL-7702 cells were randomly divided into seven groups: control, arsenic poisoning (25 μmol/L), GSPE intervention (5, 10, 25 and 50 mg/L), and single GSPE treatment(50 mg/L) groups. After treatment for 24 and 48 h, the levels of aspartate transaminase (AST), alanine aminotransferase (ALT),glutathione (GSH), superoxide dismutase (SOD), total antioxidant capacity (T-AOC), and malondialdehyde (MDA) were determined by commercial kits. Cell viability was tested by 3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-yl)-3,5-di-phenytetrazoliumromide (MTT).We used polymerase chain reaction (PCR) and Western blot to detect the mRNA and protein expression levels of nuclear factor erythroid-2 related factor 2 (Nrf2), glutathione S-transferase (GST), heme oxygenase 1 (HO-1), and quinone oxidoreductase 1(NQO1). Results: The cell viability in the high-concentration arsenic groups (≥ 25 μmol/L) was signiベcantly lower than that in the control group (P < 0.05). The levels of ALT, AST and MDA in the GSPE intervention group were signiベcantly lower than those in the arsenic poisoning group (P < 0.05), while a signiベcant elevation was observed for GSH, T-AOC and SOD (P < 0.05).The mRNA and protein expression levels of Nrf2, GST, HO-1 and NQO1 in the GSPE intervention group were signiベcantly elevated when compared with the arsenic poisoning group (P < 0.05). Conclusion: GSPE has an antagonistic action against arsenic poisoning in a dose-dependent manner by activating the Nrf2-mediated signaling pathway to improve the antioxidant capacity of cells and consequently reduce arsenic-induced liver oxidative injury.

Keywords:grape seed proanthocyanidin extract; arsenic; antioxidant activity; nuclear factor erythroid-2 related factor 2 (Nrf2)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201803027

中图分类号:R151

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2018)03-0176-06

引文格式:徐孟川, 李述刚, 丁玉松, 等. 葡萄籽原花青素提取物对砷诱导人肝细胞HL-7702损伤的保护作用及其机制[J]. 食品科学, 2018, 39(3): 176-181.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201803027. http://www.spkx.net.cn

XU Mengchuan, LI Shugang, DING Yusong, et al. Protective mechanism of grape seed proanthocyanidin extract against oxidative damage induced by arsenic in HL-7702 cells[J]. Food Science, 2018, 39(3): 176-181. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201803027. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2017-02-10

基金项目:国家自然科学基金地区科学基金项目(81560517;81760584);兵团应用基础研究项目(2015AG014);兵团科技领域重点攻关项目(2014BA039);石河子大学国际合作项目(GJHZ201602);2016年自治区研究生科研创新项目(XJGRI2016053)

第一作者简介:徐孟川(1991—),男,硕士研究生,研究方向为砷与健康。E-mail:1062967269@qq.com

*通信作者简介:李述刚(1979—),男,副教授,博士,研究方向为砷与健康。E-mail:lishugang@ymail.com