白扁豆又名扁豆，系豆科植物扁豆的成熟干燥种子，原产于印度、印度尼西亚等地，在汉、晋时期引入我国[1]。白扁豆营养价值高、味甘性温、生理活性强、作用范围广，其中碳水化合物含量高达57%[2]，含有蛋白质、脂肪、微量的钙、磷、铁及多种维生素等重要的生理活性物质，对食欲低下、胸闷胃虚、醉酒呕吐等症状均具有良好的防治效果，在抗菌、抗肿瘤、抗氧化等方面均有重要的生理作用。从张广智等[3]的研究中发现，缺氧/复氧（anoxia/reoxygenation，A/R）除造成脑神经细胞死亡之外，还会造成细胞主动凋亡[4]，此过程会受到相应基因的表达与调节[5]。为了研究这种作用，参考神经细胞的体内生存环境，提供适宜的生长条件，实际模拟脑部A/R过程[6]，以建立大脑神经细胞A/R应激性损伤模型，根据A/R模型探究白扁豆多糖（dolichos bean seed polysaccharide，DBSP）对神经细胞损伤的保护机制[7]。相关研究证明细胞凋亡过程中相关基因的表达受DBSP提取物的影响，A/R损伤导致神经细胞凋亡受到抑制[8]，因此DBSP对神经细胞的A/R应激性损伤具有保护作用。为进一步研究DBSP对神经细胞缺氧性凋亡的保护机制，通过培养原代胎鼠大脑皮层神经细胞[9]，建立A/R模型，即先用含糖培养液培养神经细胞，在氮气、氧气以及二氧化碳培养箱中进行缺氧处理，最后灌注复氧[10]，加入DBSP处理A/R损伤的胎鼠大脑皮层神经细胞，与正常对照组比较细胞活性以及凋亡水平，同时使用流式细胞仪检测相应乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、线粒体膜电位及Ca2＋相对浓度的变化，来探究DBSP对体外培养的A/R损伤神经细胞的保护机制[11]，并根据阻断剂组（LY294002＋DBSP＋A/R）研究PI3K-Akt信号通路对DBSP的神经保护产生的介导作用。
1 材料与方法
1.1 动物、材料与试剂
清洁级SD大鼠6 只，体质量（200±20）g，购自江西中医药大学动物科技中心，生产许可证号：SCXK（赣）2006-0001，动物合格证号：SCXK（赣）2005-0001，雌雄比例以1∶2合笼，共2 笼，合笼后于每天早晨观察鼠况，若出现阴道栓则表明雌鼠受孕，孕16～18 d的胎鼠用作原代培养神经细胞。
DMEM 美国Thermo Fisher公司；特级马血清北京索莱宝科技有限公司；DBSP 中国科学院成都生物研究所；胎牛血清 杭州四季青生物工程有限公司；胰蛋白酶 美国Amresco公司；Annexin V-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）试剂盒 美国BD公司；噻唑蓝（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT） 普博欣生物工程有限公司；Fluo-3/AM 美国Biotium公司。
1.2 仪器与设备
3111型二氧化碳培养箱 美国Thermo Fisher公司；090-135.001型倒置显微镜 德国Leica公司；EPICSXL型流式细胞仪、Allegra-64R型离心机 美国Beckman Coulter公司；YQX-2型厌氧培养箱 上海跃进医疗机器厂；DYY-8C型电泳仪 北京六一仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 胎鼠大脑皮层神经细胞原代培养
取受孕第16～18天的SD大鼠，用体积分数为10%的水合氯醛1.5 mL注入受孕大鼠的腹腔使其麻醉[12]，再用乙醇消毒[13]，用高压蒸汽消毒的眼科剪沿两耳连线剪开裂口，后以矢状缝纵向剪口，弯镊分离颅骨，沿颅缝T形剪口使大脑皮层暴露，取全脑置于预冷D-Hank’s液。在放大镜下，用显微剪和弯镊分离全脑中的大脑皮质并剪碎，收集大脑皮层约1 mm3的细小碎块，用质量浓度为1.25 mg/mL胰酶在37 ℃的条件下消化0.5 h左右，DMEM液终止消化，后用移液枪转入离心管，设置1 000 r/min离心5 min，弃上清液，沉淀出来的细胞加以重悬。以2×106cells/孔、2×105cells/孔接种于6 孔或 96 孔培养板中，差速贴壁培养4 h后[14]，吸去培养基，加入NB培养液，继续培养，观察细胞生长状态，3 d后半量换液。
1.3.2 实验分组与处理方法
空白对照组：3 d细胞更换培养基后，于培养箱中再孵育2 d，在第5天加入复氧液，放置二氧化碳培养箱（37 ℃，5% CO2、95%空气）3 h，更换复氧液后继续培养2 h。
A/R组：建立A/R损伤模型，细胞更换培养基后，换上模拟缺氧液，缺氧密闭容器置换成以95% N2、5% CO2持续通气的环境（37 ℃），把细胞置于此缺氧密闭容器内3 h，处理结束后取出培养板，换上模拟复氧液，缺氧密闭容器置换成以95% O2、5% CO2持续通气的环境（37 ℃），把细胞置于此缺氧密闭容器内，复氧培养2 h[15]。
DBSP＋A/R组：根据前期实验结果[16]，本实验选择1.0 mg/mL作为DBSP的作用质量浓度，在缺氧处理前加入1.0 mg/mL DBSP，其他同A/R组且全程给予DBSP。
LY294002＋DBSP＋A/R组（LY＋DBSP＋A/R组）：即在DBSP＋A/R处理组中加入PI3K-Akt信号通路抑制剂LY294002（20 μmol/L）后，培养细胞0.5 h，其他与DBSP＋A/R组相同。
1.3.3 检测指标
神经细胞活性检测：于96 孔培养板细胞中每孔加入20 μL 5 g/mL的MTT溶液，在5% CO2、37 ℃的细胞培养箱中孵育4 h后弃每孔的上清液[17]，每孔加150 μL裂解液二甲基亚砜溶解，振荡10 min后于酶联免疫检测仪中测定490 nm波长处的各孔光密度值。细胞活性测定工作原理即一定细胞数范围内，MTT结晶的形成量与细胞数成正比，光密度值越大则细胞活性越强。
细胞LDH的测定：实验处理后各组分别取孵育液200 μL，送往南昌大学第一附属医院检验科检测，使用生化自动分析仪测定LDH。
细胞凋亡的测定：弃6 孔培养板培养上清液，用1.25 mg/mL胰酶进行消化[18]，然后使用完全培养基终止消化，收集神经细胞于离心管，设置2 000 r/min离心5 min，弃培养液后收集沉淀，用磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤细胞2 次，加结合缓冲液100 μL进行悬浮，加入AnnexinV-FITC 5 μL标记，最后加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）5 μL标记染色，混匀，在室温下进行避光反应10 min，再加入结合缓冲液400 μL，立即使用流式细胞仪进行检测。其中，在双变量流式细胞仪的散点图上[19]，左上限（FITC-/PI＋）对应机械损伤所致死亡的细胞，左下限（FITC-/PI-）对应活细胞，右上限（FITC＋/PI＋）对应晚期凋亡细胞[20]，右下限对应早期凋亡细胞（FITC＋/PI－），此实验数据采用右下限的早期凋亡细胞数据。
Ca2＋相对浓度的测定：用20 μmol/L Fluo-3/AM分子探针来装载细胞，用标准Tyrode溶液在37 ℃条件下反应50 min，1 000×g离心收集细胞，10 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸重悬，上样，在流式细胞仪中检测[21]，以Fluo-3/AM的荧光强度表示Ca2＋相对浓度。
细胞ROS相对含量的测定：收集神经细胞（细胞数约2×106个），3 000 r/min离心10 min，PBS清洗2 次后以0.5 mL DCFH-DA溶液（20 µmol/L）重悬。37 ℃孵育20 min，3 000 r/min离心3 min，弃上清液，PBS洗2 次细胞，在流式细胞仪中检测细胞内2’,7’-二氯荧光素（2’,7’-dichlorofluorescein，DCF）的荧光强度[22]，以DCF的荧光强度来表示细胞内ROS的相对含量，荧光强度越强表明ROS相对含量越高。
细胞线粒体膜电位的测定：收集神经细胞，调整细胞浓度为2×105～5×105mL－1，1 000×g离心5 min，100 μL PBS重悬细胞，加入Rho123储存液5 μL[23]，37 ℃孵育30 min，1 000×g离心5 min，弃上清液，500 μL PBS洗涤2 次，重悬细胞后用FACScan进行流式细胞仪定量检测[24]，设置一个阴性对照组即不加Rho123的细胞。流式细胞仪激发和发射波长分别为488 nm和530 nm，测定Rho123的荧光强度以表示线粒体膜电位。
Western blot法检测蛋白质量浓度：神经细胞弃去上清液，继而用预冷PBS除去残留的培养基；6 孔板以80 μL/孔添加细胞裂解液、60 mm培养皿以300 μL/块添加细胞裂解液（50 mmol/L Tris（pH 8.0）、150 mmol/L NaCl、1%（体积分数，下同）脱氧胆酸钠、0.1%十二烷基硫酸钠、1%乙基苯基聚乙二醇、1 mmol/L苯甲基 磺酰氟、10 μg/mL胰蛋白酶抑制剂、10 μg/mL亮抑酶酞）。4 ℃孵育20 min后，将细胞及其碎片连同裂解液集中一侧，继续4 ℃孵育40 min，4 ℃、12 000×g离心5 min；收集上清液，即为本实验制备的蛋白样本；将上清液一部分用来测蛋白质量浓度外，其余用于后续实验或置于-80 ℃冰箱储备。制备12%分离胶和5%积层胶，取等量蛋白上样，电泳。电泳结束后，电转移，取出聚偏二氟乙烯膜，封闭2 h，结合一抗：磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）（一抗稀释1 000 倍）和总蛋白激酶B（total protein kinase B，T-Akt）（一抗稀释300 倍），4 ℃过夜或室温平摇3 h。TBST缓冲液清洗膜上残余一抗。结合二抗：将二抗稀释2 000 倍后溶于封闭液中，室温平摇2 h后，用TBST缓冲液清洗膜上残余二抗；ECL检测、曝光、显影、定影[25]。
1.4 数据统计分析
本实验各组数据均以
表示，应用SPSS 11.5分析软件进行单因素方差分析，组间比较用LSD法，P＜0.05为显著性差异，P＜0.01为差异极显著。
2 结果与分析
2.1 DBSP对神经细胞活力的影响
表1 DBSP对神经细胞活力的影响
Table 1 Effect of DBSP on the viability of neurons
注：##.与对照组相比差异极显著（P＜0.01）；**.与A/R组相比差异极显著（P＜0.01）；&.与DBSP＋A/R组相比差异显著（P＜0.05）。下同。
如表1所示，与对照组相比，A/R组中神经细胞活力由1.270下降到0.850，极显著下降，表明神经细胞A/R损伤明显。与A/R组相比，DBSP＋A/R中神经细胞活力由0.850
上升到1.120，极显著增加，表明DBSP对神经细胞A/R损伤具有明显的保护作用。
2.2 DBSP对神经细胞LDH释放的影响
表2 DBSP对神经细胞LDH释放的影响
Table 2 Effect of DBSP on the release of LDH from nerve cells
如表2所示，与对照组相比，A/R组中LDH的释放由17.21 U/L上升到27.52 U/L，极显著增加，表明神经细胞损伤。与A/R组相比，DBSP＋A/R组中LDH的释放水平由27.52 U/L下降到17.33 U/L，极显著下降，表明DBSP对受A/R损伤的神经细胞具有保护作用。
2.3 DBSP对神经细胞Ca2＋相对浓度的影响
如图1所示，与对照组相比，A/R组中神经细胞Ca2＋相对浓度由19.30上升到194.91，极显著增加。而DBSP＋A/R组与A/R组相比，细胞中的Ca2＋相对浓度由194.91下降至22.37，极显著降低，表明DBSP可抑制A/R介导的Ca2＋相对浓度增加。
图1 DBSP对神经细胞Ca2＋相对浓度的影响
Fig. 1 Effect of DBSP on neuronal Ca2+relative concentration
##.与对照组相比差异极显著（P＜0.01）；**.与A/R组相比差异极显著（P＜0.01）；&.与DBSP＋A/R组相比差异显著（P＜0.05）。下同。
2.4 DBSP对神经细胞凋亡的影响
DBSP对神经细胞凋亡影响如图2所示，与对照组相比，A/R组中细胞凋亡率由5.03%增至46.68%，细胞凋亡率极显著增加，表明A/R可促进神经细胞的凋亡。而与A/R组相比，DBSP＋A/R组细胞凋亡率由46.68%下降至18.17%，表明DBSP处理神经细胞后，A/R介导的细胞凋亡显著减少。
图2 各实验分组对神经细胞凋亡的影响
Fig. 2 Effect of DBSP on neuronal apoptosis
A1～A4.分别为对照组、A/R组、DBSP＋A/R组、LY＋DBSP＋A/P组细胞凋亡流式图；B.细胞凋亡率柱状图。&&.与DBSP＋A/R组相比差异极显著（P＜0.01）。下同。
2.5 DBSP对神经细胞ROS相对含量的影响
图3 各实验组对胎鼠神经细胞ROS相对含量的影响
Fig. 3 Effect of DBSP on ROS of nerve cells from fetal rats
如图3所示，与对照组相比，A/R组中神经细胞ROS相对含量由94.69上升至154.88，极显著增加，而DBSP＋A/R组与A/R组相比，细胞中的ROS相对含量由154.88下降至110.76，极明显减少，表明DBSP可抑制A/R介导的神经细胞ROS相对含量的增加。
2.6 DBSP对神经细胞线粒体膜电位的影响
图4 各实验分组对胎鼠神经细胞线粒体膜电位的影响
Fig. 4 Effect of DBSP on mitochondrial membrane potential in nerve cells from fetal rats
A. Rho123荧光强度曲线图；B. Rho123荧光强度柱状图。
如图4所示，与对照组相比，A/R组中神经细胞的线粒体膜电位由138.81下降至91.73，极明显降低，表明神经细胞受A/R损伤，与A/R组相比，DBSP+A/R组中线粒体膜电位由91.73上升至126.84，极显著增加。结果表明DBSP对A/R介导的神经细胞损伤具有保护作用。
2.7 DBSP对神经细胞中T-Akt和p-Akt的蛋白表达影响
图5 DBSP对神经细胞中T-Akt和p-Akt的蛋白表达影响
Fig. 5 Effect of DBSP on the expression of T-Akt and p-Akt protein in nerve cells
A. p-Akt和T-Akt蛋白印记图；B. T-Akt柱状统计图；C. p-Akt柱状统计图；图A中1～4.分别为对照组、A/R组、DBSP＋A/R组、LY＋DBSP＋A/P组。
应用PI3K-Akt信号通路抑制剂LY294002，研究神经细胞中p-Akt和T-Akt的蛋白表达。结果如图5所示，与对照组相比，各组之间T-Akt的蛋白表达无显著差异（P＞0.05）。神经细胞经DBSP处理后，与A/R组相比，p-Akt蛋白表达上调，给予PI3K-Akt信号转导通路阻断剂LY294002后抑制了DBSP介导的p-Akt蛋白表达。
3 讨 论
神经细胞是组成神经系统的基本功能单位，脑部血流正常供应才能保障其正常代谢活动，当脑缺血时，神经细胞将发生坏死和凋亡[26]。由于大脑皮层神经细胞对缺氧复氧环境敏感，本研究通过体外培养胎鼠大脑皮层神经细胞，模拟体内环境，来探究外源物质DBSP对胎鼠神经细胞的保护作用及机制。选取培养时间为16～18 d胎鼠大脑皮层神经细胞作为原代培养的神经细胞建立A/R损伤模型。
实验发现，A/R处理大脑皮层神经细胞后，其细胞活性降低，神经细胞凋亡增加，LDH和ROS释放量增加，表明A/R导致了神经细胞损伤。给予A/R损伤的神经细胞DBSP后，能抑制神经细胞的凋亡和LDH、ROS的释放，提高了神经细胞的存活率，表明DBSP对神经细胞具有保护作用。
研究表明，细胞凋亡过程中，先出现线粒体膜电位的下降，再发生胞膜磷脂酰丝氨酸由内而外的转变，导致某些细胞形态发生改变，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3被激活等变化。线粒体膜电位的下降可作为细胞凋亡的早期表现，且当发生膜电位下降时，细胞凋亡不可逆转，因此线粒体膜电位下降也是细胞凋亡的特征表现。当发生A/R诱导时，线粒体通透性发生改变[27]，非特异性增加，基质内流入大量具有负电荷的蛋白质，内膜两侧离子梯度发生改变，线粒体膜电位崩溃，引起线粒体内大量的正离子如Ca2＋外流等一系列变化，导致细胞凋亡。本实验中利用流式细胞仪来检测Rho123的荧光强度，定量神经细胞线粒体膜电位变化[28]。实验结果显示，A/R组线粒体膜电位极显著降低（P＜0.01），促进细胞凋亡，DBSP能抑制A/R介导的线粒体膜电位下降。与对照组相比，A/R组中神经细胞Ca2＋相对浓度由19.30上升到194.91，极显著增加（P＜0.01），表明A/R介导的神经细胞损伤与Ca2＋相对浓度的大量增加有关，而DBSP＋A/R组与A/R组相比，细胞中的Ca2＋相对浓度由194.91下降至22.37，极显著降低（P＜0.01），表明DBSP可显著抑制A/R介导的Ca2＋相对浓度增加，促进内环境稳定，对神经细胞产生保护作用。
研究表明，PI3K-Akt信号通路是细胞内重要的信号转导通路[29]，该通路的激活在细胞最终存活中起关键性作用。既有抗细胞凋亡作用，又可以促进细胞凋亡，其中以抗细胞凋亡为主[30]。根据LY294002对PI3-Akt信号转导通路的抑制作用，实验中使用LY294002处理神经细胞，与DBSP＋A/R组相比，LY＋DBSP＋A/R组细胞活性以及线粒体膜电位显著降低，细胞凋亡率显著升高，LDH释放水平、ROS相对含量、Ca2＋相对浓度均显著升高（P＜0.05），表明受到LY294002的阻断作用，DBSP＋A/R预处理组对神经细胞产生的保护作用被削弱，实验证明DBSP＋A/R预处理组转导PI3K-Akt信号通路对受A/R损伤的神经细胞具有保护作用。
综上讨论可知，DBSP可显著抑制A/R介导的神经细胞损伤，导致LDH的释放水平、ROS相对含量、Ca2＋相对浓度和细胞凋亡降低，线粒体膜电位和细胞活性显著增加，即DBSP对A/R损伤的神经细胞具有保护作用。通过PI3K-Akt通路抑制剂LY294002阻断DBSP对神经细胞保护作用得出，PI3K-Akt信号通路介导了DBSP的神经保护作用。
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