基于宏基因组和宏转录组的发酵食品微生物研究进展

微生物的新陈代谢在发酵食品的色、香、味、态等特征及食品安全等方面发挥着重要作用。但是由于发酵食品中微生物种类繁多、群落演替变化复杂、代谢通路多样、功能基因丰富多变，迄今为止很多传统发酵食品中微生物群落结构特征、演替变化规律和功能基因依旧是谜团，科学研究和工业生产都急需揭开这层神秘的面纱。传统发酵食品种类繁多，如发酵乳制品、发酵谷物类（酒、醋）、发酵蔬菜（泡菜）、发酵豆制品（豆豉、酱油、腐乳）、发酵植物根或块茎、发酵肉制品（火腿）、发酵海产品等[1]。在发酵过程中，原料中的糖类、脂类、蛋白质等营养物质在各种微生物的参与下，降解为小分子的单糖、脂肪酸、氨基酸，并与微生物代谢产物一起决定最终产品的品质风味、安全性、稳定性等特征[2-3]。但是，由于发酵过程中微生物体系复杂，其中包括大量的益生菌和部分有害微生物，而某些杂菌会产生有害代谢产物如生物胺等[4-5]。为了保证发酵食品安全、提高其品质、减少有害物质的产生，必须了解发酵过程中的微生物群落构成、群落演替以及各种微生物的代谢特性和它们对产品品质的影响，从而使发酵过程可控化、现代化，进而提升发酵产品品质，保障产品安全[6]。但因参与发酵的微生物种类繁多、相互作用关系复杂，全面解析发酵食品中微生物群落结构及其群落演替变化规律依旧极具挑战[7]。

随着分子生物学技术的快速发展，发酵食品微生物群落结构研究已不再完全依赖于传统的微生物分离培养技术。因测序技术不断更新，测序费用大大降低，测序通量急速扩大，从而应用直接测序可以对群落中所有微生物的DNA或RNA进行微生物群落组成、分布及其动态演替的分析[3]。近年来，主要基于细菌16S rRNA基因及真菌rRNA基因间隔区（internal transcribed spacer，ITS）区域高通量测序的微生物多样性分析，不仅省去了传统分离培养法的繁琐过程，而且为大量不可培养微生物的研究提供了契机，使得在传统发酵食品微生物多样性研究中有了许多新的发现，成为发酵食品微生物研究的主要方法之一[1,3,8]。但是，基于rRNA基因片段或ITS区域高通量测序进行微生物多样性分析的方法本身的局限性，一方面只能依赖于基因库中已知基因序列做出推断，另一方面由于核糖体RNA基因片段的保守性较高，许多未知微生物往往只能鉴定到所在属，因而只能在门、纲、目、科、属这些级别进行微生物群落进化和种属亲缘关系分析；同时由于缺乏功能基因的具体信息，使进一步深入研究面临瓶颈。相比之下，基因组、宏基因组测序以及转录组、宏转录组测序技术在一定程度上弥补了这些缺陷[9]，使得人们可以更系统深入地研究微生物群落结构及其功能基因，全面分析其组成、变化规律、亲缘进化并挖掘出潜力丰富的功能基因，从而得以进一步揭开发酵食品微生物群落的神秘面纱。

1 宏基因组与宏转录组

1.1 宏基因组

宏基因组（metagenome）一词由Handelsman等[10]于1998年研究土壤微生物群落时首次提出。宏基因组技术通过收集环境样品，提取样品微生物（包括全部的可培养与不可培养的微生物）的总DNA，构建宏基因组文库，从基因组文库中筛选功能基因或直接进行高通量测序分析，来研究群落中物种多样性并挖掘功能基因[9]。早期的宏基因组研究以从基因组文库中筛选获得功能基因为主要策略，随着高通量测序技术、生物信息学工具以及大数据分析平台的日渐发展，主要基于测序的宏基因组广泛应用在微生物群落研究中，成为空气、土壤、水、植物以及人体（如皮肤、消化道）等微生物群落研究的强有力工具[9,11-16]。例如在研究动物性膳食与植物性膳食对人肠道微生物群落结构实时影响并重现因短期摄入营养素的改变而引发的肠道微生物群落结构变化时，揭示了动物性膳食引发肠道炎症疾病的机制[16]。借由宏基因组，大量不可培养的微生物得以被发现，新的功能基因或新基因簇得以被认知，极大地增加了人类对微生物群落组成、演替及其互作的认识，同时对于开发具有应用潜力的新基因也具有重要意义。近年来宏基因组开始应用于食品微生物的研究[14,17-19]，但是，目前大量文献报道是基于扩增rRNA基因测序进行的生物多样性分析，而本文则主要侧重于分析rRNA基因测序之外的宏基因组和宏转录组报道。

第二代测序技术依托的高通量测序平台，包括Illumina公司的Solexa Genoma Analyzer测序平台、罗氏公司的454GS FlX测序平台和ABI公司的SOLiD测序平台[20]。这些测序平台可以实现对DNA的高通量快速测序，极大地方便了对某一物种基因组的深度测序，也方便了对微生物群落中所有DNA的分析。基于这些测序平台，宏基因组既可以分析特定环境微生物基因，基于序列筛选或基于功能筛选分析某种功能基因，并进一步对筛选到的基因进行深度测序；又可以针对环境群落微生物中全部的DNA进行深度测序，分析该群落中微生物的组成、演替及特定功能基因[9]。但是，宏基因组的局限在于不能揭示特定时空条件下微生物群落基因的动态表达与调控等问题，这部分的研究有赖于宏转录组。

1.2 宏转录组

基于RNA数据分析的转录组学，主要用来揭示生物在特定生理阶段或胁迫下，基因的动态表达与调控以及胁迫响应，分析差异表达基因[21]。宏转录组是指在某个特定条件或特定时空，群落中所有微生物基因转录本的总和，可用于原位衡量微生物群落宏基因组的表达水平，筛选出高表达活性功能基因和微生物[22-23]。它以微生物群落的总RNA为研究对象，提取样品总RNA，将mRNA反转录为cDNA，进而对cDNA分析来反映特定时空下基因的表达情况。早期转录组研究主要运用微阵列芯片技术，但是设计和构建微阵列芯片费用高且费时，还不能检测到设计模板之外的基因的表达水平[24]。而测序技术较好地解决了这一困境，它针对转录产物mRNA进行高通量测序，可全面快速地获取特定样品在某一特定状态下的完整表达信息，普遍应用于差异表达基因分析、功能基因挖掘、低丰度转录本的发现、转录图谱绘制、可变剪接预测等各个方面。

近年来基于测序的宏转录组学在各种环境和人体微生物群落研究中被广泛应用[12,16,25-28]，不仅可以鉴定群落中微生物基因表达水平，比较不同微生物转录表达谱，进而了解群落的演替变化；还可以分析群落中微生物的胁迫响应，研究优势菌群的代谢途径和筛选特定功能的基因。例如，关联人体消化道微生物群落的宏基因组与宏转录组数据，发现虽然有部分口腔优势微生物存在消化道末端，但它们的转录活性很低；不同的个体间，41%的消化道微生物转录本不受其基因组丰度影响，而转录受包括表达下调的孢子形成、氨基酸合成通路，以及表达上调的核糖体合成和甲烷生成通路[12]等的影响。又如Jiang Yue等[26]应用宏转录组分析了来自小鼠大肠、奶牛瘤胃、泡菜、深海热井和冻土的微生物群落，确定了参与氨基酸、能量、核苷酸代谢的592 种核心酶基因的表达，同时也鉴定了微生物的特定代谢途径，如磷酸代谢途径和多聚糖降解途径等。近年来，宏转录组开始应用于发酵食品[29-31]，用于探索各种微生物在发酵过程中的代谢途径，并揭示它们特定的功能和对风味的贡献。

2 宏基因组与宏转录组在发酵食品微生物群落研究中的应用

2.1 奶酪

奶酪是一种重要的发酵乳制品，世界各地有多种风味独特的奶酪成品。奶酪的微生物群落是由各种细菌、酵母菌和霉菌等组成，它们相互作用并经一系列生化反应后形成奶酪独特的感官性能和风味。Wolfe等[32]应用宏基因组揭示了3 类（新鲜奶酪、花皮奶酪、洗浸奶酪）共137 种不同奶酪表皮的微生物群落结构及其在发酵中的功能，他们从中分离培养出24 株优势菌株（包括细菌和真菌），并研究了它们之间的相互作用。这是首次如此多种类的奶酪微生物被同时研究，并且该研究揭示出部分微生物的某些特殊功能与奶酪的表皮特性形成相关，假交替单胞菌（Pseudoalteromonas spp.）可产生参与奶酪表皮硫化物形成的甲硫氨酸γ-裂解酶。作者还通过原位和体外重构重现了奶酪发酵的过程，提供了一种简单的模型来研究奶酪发酵过程中真菌和细菌间的作用机制[33]。Almeida等[34]则是对从奶酪制品中分离出的142 株细菌（分属于137 个不同的种和67 个属）进行了大规模的基因组和宏基因组测序，通过大规模测序，他们获得了117 个基因组草图，使奶酪中已知细菌的基因组序列增加了1 倍，并建立了1 个奶酪细菌功能基因组数据库。他们还依据新测序建立的基因组数据库，分析了不同传统奶酪表面上存在的微生物群落结构，观察到一些微生物物种大量存在，表明一些微生物如静止嗜冷杆菌（Psychrobacter immobilis）和假单胞菌（Pseudoalteromonas haloplanktis）最初并没有被接种，却是发酵过程中的优势菌种。Escobar-Zepeda等[35]利用宏基因组学揭示了Cotija奶酪中独特的微生物群落组成。Cotija奶酪在墨西哥当地独特的地理环境中自然发酵成熟，其独特的感官特性及其安全性由微生物及其代谢产物共同影响。高通量测序结果揭示了微生物的多样性、优势菌群以及代谢潜力，结果表明乳杆菌、明串珠菌和魏斯菌属是3 个主要的优势菌群，另外还有属于31 个门，共达500多种的细菌和古细菌；致病菌如沙门氏菌、单增李斯特菌、布鲁氏杆菌、分枝杆菌均未发现。结果表明与Cotija奶酪多种风味形成有关的微生物代谢活动主要涉及支链氨基酸和游离脂肪酸的代谢，同时还发现了一些与细菌素的产生及免疫相关的基因。这些基于宏基因组数据的发现可以解释微生物群落在发酵奶酪感官特性及安全性中的作用，同时也提供了寻找新的酶应用于生物技术的可能性。

目前奶酪表皮微生物群落的参考基因组序列较为丰富，为宏转录组分析奶酪成熟过程中表皮微生物群落提供了更大的可能性，奶酪持续成为发酵食品微生物研究对象的热点。Monnet等[36]应用宏转录组分析探究奶酪表皮的微生物活动，被研究的奶酪是由2 种乳酸菌（嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种）、1 种陈化细菌（金橙黄短杆菌）和2 种酵母（汉逊德巴利酵母和假丝地霉酵母）参与发酵而成熟。从第5、14、19、35天的奶酪表皮提取RNA进行测序，结果显示除金橙黄短杆菌转录本读数极低外，其他菌种均被检测到。宏转录组数据显示，5～35 d假丝地霉酵母最活跃，乳酸菌的转录水平只发生了轻微的变化。作者分析比较了两株酵母参与乳糖、半乳糖、乳酸、氨基酸以及游离脂肪酸分解代谢相关基因的表达水平，结果显示在成熟过程中氨同化相关基因和半乳糖代谢相关基因下调；在假丝地霉酵母的转录组数据中，参与氨基酸代谢的基因在14～35 d上调，而在汉逊德巴利酵母中上调主要发生在第35天，这表明汉逊德巴利酵母比假丝地霉酵母更晚参与氨基酸的代谢。此外，在第35天涉及电子传递链的基因表达普遍下调，表明成熟后期细胞活性较低。de Filippis等[37]应用宏转录组学分析了不同温度和湿度条件下意大利奶酪成熟过程中微生物群落的演替和相关基因的表达，结果显示提高奶酪成熟温度会促进蛋白质水解、氨基酸和脂类分解代谢相关基因的表达，并显著加速奶酪的成熟速率；此外温度升高导致的微生物代谢途径变化与奶酪中蛋白质和挥发性有机物的代谢谱变化一致；在奶酪成熟过程中表皮中糖代谢（磷酸戊糖途径和糖酵解）和细胞分裂相关的转录本丰度较高，而在奶酪中心氨基酸和脂类代谢显著上调。这些宏转录组数据分析结果对工业生产中通过合理调控温度来调节微生物的代谢，从而优化生产效率并提高产品质量具有重要指导意义。

随着组学技术的成熟和成本的降低，研究者们正试图用多种组学数据结合分析来更好地揭示发酵过程中微生物的功能及其相互作用机制，以期获得突破性的研究成果。如Dugat-Bony等[38]应用宏基因组、宏转录组和生化分析，研究9 种微生物组成的奶酪表皮在为期4 周的成熟过程中的变化。在发酵早期乳酸球菌和乳酸克鲁维酵母快速消耗乳糖产生大量乳酸，随后检测到汉逊德巴利酵母和假丝地霉酵母高水平的乳酸脱氢酶转录本，表明随后乳酸被它们利用。大多数的RNA测序片段匹配到假丝地霉酵母的基因，这表明假丝地霉酵母与酪氨酸和脂肪降解密切相关。在奶酪成熟末期，测序数据表明与氨基酸降解相关的转录本源于假丝地霉酵母、对酸敏感的干酪棒杆菌和蜂房哈夫尼亚菌，这一数据结果与假丝地霉酵母、干酪棒杆菌和蜂房哈夫尼亚菌在后期奶酪表皮旺盛生长相符。在这篇报道中作者结合不同的数据分析，获得了奶酪成熟过程中各种微生物的代谢产物及其可能的相互作用机制；此外，采用差异表达分析选择出的一组生物标志物基因，为监控奶酪制作过程提供了有价值的工具。

2.2 发酵蔬菜

作为一种传统的发酵蔬菜产品，泡菜发酵过程中微生物种类复杂，近年来宏基因组、宏转录组已应用于泡菜发酵过程中微生物群落的研究。Jung等[17]研究泡菜29 d发酵过程的宏基因组，其中源自宏基因组的16S rRNA基因数据构建的系统发育树分析表明泡菜中优势菌属为明串珠菌属（Leuconostoc）、乳杆菌属（Lactobacillus）和魏斯氏菌属（Weissella）。在基因功能注释方面，采用宏基因组快速注释技术，揭示了一系列碳水化合物异养乳酸发酵的相关基因，这与检测到发酵产物甘露醇、乳酸、乙酸乙酯、乙醇等相吻合。将宏基因组序列与不同菌属微生物基因组序列比较发现，大部分的宏基因组序列数据与肠明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）和沙克乳杆菌（Lactobacillus sakei）的基因序列具有高度相似性，表明泡菜发酵过程中这两种菌很可能发挥了重要作用。从宏基因组数据中还发现了大量噬菌体DNA序列，这表明泡菜发酵过程中许多细菌受到了噬菌体感染。这些结果不仅深入揭示泡菜发酵微生物的功能，也揭示了复杂的微生物群落对发酵过程的影响。

宏转录组学在泡菜发酵微生物研究中亦有应用，如Jung等[29]对泡菜中6 种主要微生物在发酵过程中的宏转录组基因表达图谱进行了研究。在为期29 d的发酵过程中，来自其中5 个时间点样本中提取的总RNA中，97.7%的基因序列与GenBank中已知的6 个菌属一致。研究结果表明，在前期发酵过程中肠明串珠菌是最活跃的菌株，而在之后的过程中沙克乳杆菌和韩国魏斯氏菌（Weissella Koreensis）基因呈高表达；在第25天时沙克乳杆菌的基因表达急剧下降，可能与乳酸杆菌噬菌体感染有关。大量与碳水化合物运输、水解及乳酸发酵相关的基因表达活跃，呈现出典型的异养乳酸发酵。所有的明串珠菌属都含有甘露醇脱氢酶编码基因（mannitol dehydrogenase，mdh），尤其是肠明串珠菌，它具有3 个mdh拷贝，其中2 个在染色体上，1 个在质粒上，它们具有不同的表达模式。这些结果有助于人们更好地认识各种微生物在泡菜发酵过程中发挥的重要作用。

中国各地有丰富多样的传统发酵蔬菜，近年来的研究报道有不少基于rRNA基因片段或ITS区测序的微生物多样性分析。如佟婷婷等[39]发现四川老坛泡菜发酵中魏斯氏菌属是启动菌，关键菌是乳杆菌属，同时还有乳球菌属、片球菌属和明串珠菌属等；Chen Peng等[40-41]报道甘肃浆水菜中除了乳酸菌外，还有子囊菌和担子菌等真菌；Wu Rina等[42]发现乳杆菌属、明串菌属、芽孢杆菌、假单胞菌、酵母、念珠菌、展青霉菌等与东北酸菜特殊风味形成相关。未来对宏基因组和宏转录组的深入研究将有利于我们对中国传统发酵蔬菜更多的了解和进一步的开发利用。

2.3 发酵普洱茶

普洱熟茶属典型的发酵茶，它区别于普洱生茶是在于其经“渥堆”工艺制作而成。“渥堆”是多种微生物参与的以茶叶为基质的固态发酵过程，参与发酵的微生物种群结构对普洱熟茶品质的形成发挥着至关重要的作用。有不少基于分离培养或基于rRNA基因测序的“渥堆”过程微生物多样性的报道除发现黑曲霉等优势菌株[43-45]外，还发现了其他优势菌株。Lü Changyong等[46]首次应用宏基因组测序研究了普洱茶渥堆发酵过程中微生物的群落结构为3 个优势的细菌门（变形菌门、放线菌门和厚壁菌门）和1个处于主导地位的真菌门即子囊菌门；功能基因注释表明与该过程萜类、酮类化合物代谢以及其他次生代谢产物合成相关的69 种酶基因分布于16 个代谢途径中。这些宏基因组数据表明普洱茶发酵的主要微生物包含细菌和酵母，功能基因的挖掘和代谢途径的分析有利于在分子水平上对普洱茶发酵机理作进一步研究。

姜姝等[47]提取普洱茶发酵前期和中期样本中微生物菌群的总mRNA，对其进行宏转录组对比分析。测序结果注释表明黑曲霉（Aspergillus niger）在发酵前期和中期两个阶段都占有绝对优势；对前期和中期转录本中的差异表达基因进行基因的本体论（gene ontology，GO）功能注释聚类分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，结果表明适应“渥堆”发酵环境变化的微生物（如黑曲霉等）对普洱茶发酵过程起到了决定性的作用。

2.4 发酵可可豆

可可豆是生产巧克力的重要原材料，采收后的可可豆经发酵、干燥和焙烤形成巧克力特有的风味和口感，其中发酵阶段主要是由酵母菌、乳酸菌、醋酸菌将糖转化为酸的一系列生化过程。近年来已有采用宏基因组学对可可豆发酵过程中微生物群落结构及功能的研究，宏基因组学被Illeghems等[48]于2012年首次应用于可可豆发酵过程中微生物的研究，相对于仅依赖于个别基因序列的分析，宏基因组数据揭示了更丰富的微生物多样性。此次发现的细菌和真菌的种类比之前多，优势菌株包括葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、仙人掌有孢汉逊酵母（Hanseniaspora opuntiae）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）和巴氏醋酸杆菌（Acetobacter pasteurianus）；病毒主要包括肌尾噬菌体（Myoviridae）和长尾噬菌体（Siphoviridae），且乳杆菌是它们主要的宿主。随后Illeghems等[49]基于宏基因组数据构建的多通路分析拓展了人们对可可豆发酵过程中主要微生物功能特性的认知，揭示了群落微生物间的代谢通路的分布。其中与乳酸菌代谢关系最密切的是乳酸发酵和柠檬酸同化途径；而肠杆菌（Enterobacteriaceae）通过混合酸发酵和丙酮醛解毒途径参与底物转化，具有降解果胶和同化柠檬酸的潜在功能。基于宏基因组数据重构了醋酸菌的部分代谢途径，尤其是胁迫应激响应，在酸胁迫下醋酸菌细胞内乙醇同化和乙酸过氧化通路活跃使得醋酸菌得以继续生存。Illeghems所在的团队还陆续对可可豆发酵过程中分离到的特定菌株（如巴氏醋酸杆菌386B[50]、发酵乳杆菌222、植物乳杆菌80[51]、加纳假尾孢醋酸杆菌（Acetobacter ghanensis）、塞内加尔醋酸杆菌（Acetobacter senegalensis）[52]等）进行基因组和功能比较基因组的分析。这些研究深入剖析了可可豆发酵过程中微生物群落结构以及多种优势微生物的基因组和代谢途径特性，为今后可可豆发酵选取更优的发酵菌剂提供了有效的依据。

2.5 其他

宏基因组和宏转录组还应用在其他多种发酵食品研究中，如酱油、酒类。酱油是亚洲食品中的一种重要的酿造调味品，其质量取决于发酵过程中微生物的种群结构及相互代谢调控。传统酱油的浓厚风味依赖于天然微生物发酵，而非大规模工业生产中使用的特定发酵菌剂，因而明确传统酱油生产过程中微生物的种类及其群落演替和代谢机理对于中国传统酿造酱油工业的发展具有重要意义。在对酱油卤水发酵过程中微生物的演替及其功能的研究中，Sulaiman等[53]通过宏基因组研究传统酱油发酵过程的微生物群落演替和基因功能，并分析了优势菌群代谢与卤水特性变化的关联。该研究发现卤水在0～6 个月的发酵过程中以魏斯菌属为主，后期的优势真菌为念珠菌属；通过宏基因组序列的代谢重建，揭示了蛋白质和碳水化合物异养发酵的特征，与检测到乙醇和pH值下降相符。在印度米酒酒曲的研究中，Bora等[54]首次应用宏基因组学揭示了更为全面的微生物群落特征，其中微生物包括以乳酸菌为主的细菌、根霉、毛霉和曲霉等产淀粉酶菌株，季也蒙毕赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）、威克汉姆西弗酵母（Wickerhamomyces ciferrii）、酿酒酵母等产乙醇菌株；但对于所获宏基因组数据，作者仅报道了分类学研究的结果，并没有进一步分析功能基因组和重构代谢途径。

目前，对传统酿造酱油、酒类和醋的深入研究（如通过整合代谢组与微生物多样性分析对镇江香醋、山西陈醋等食醋的研究[55-58]；对酿酒酵母和酒球菌不同株系的基因组和比较基因组研究分析[59-64]）中，大多是通过rRNA基因片段测序分析发酵过程中微生物群落结构的变化，而采用宏基因组或宏转录组系统研究的报道还较少。宏基因组学和宏转录组学技术的应用将有助于人类进一步了解这些食品发酵过程中微生物的具体种系和功能基因，将该技术与代谢组数据整合，可以加深人们对传统酿造酱油、醋和酒类中微生物的群落演替和风味物质形成机制的认识，也将有利于挖掘出更多的有益菌株和潜在的功能基因应用于未来的工业生产。

3 结 语

如上所述，近年来主要基于高通量测序技术的宏基因组和宏转录组在发酵食品微生物研究中取得了一些进展，但仍存在许多局限：1）二代测序的读长较短，对宏基因组和宏转录组数据的组装仅能达到Scaffold水平，尤其是对复杂的基因组，高含量的重复序列使得基因组大小出现“缩水”现象；2）测序数据的拼接很大程度上依赖现有数据库中已知的微生物序列，这不利于微生物新品种的及时发现，并会浪费部分测序的数据[9,65]；3）宏基因组和宏转录组测序数据量较大，分析有一定的难度，且生物信息分析对数据处理系统要求较高，不同的算法可能结果差异甚大[3]；4）对低丰度基因的检测较困难[3,24]；5）费用较高导致目前测序所使用的重复样本较少，降低了结果的可靠性和再现性。

随着测序技术不断进步，具有更多优势的三代测序技术应运而生，如PacBio RS具有超长读取长度（10 kb）和极低的鸟嘌呤核酸和胞嘧啶核酸（guanylic acid and cytidylic acid，GC）偏好性，有利于基因组的组装；二代测序和光学图谱技术的结合使用在高等动植物基因组和

转录组研究中已有应用[66-68]，为发酵食品微生物群落结构的研究提供了更加准确的方法。日益完善的微生物特别是发酵食品微生物物种的基因组数据库，为宏基因组和宏转录组数据拼接和注释提供了越来越多坚实的支撑。宏基因组学、宏转录组学与代谢组学、蛋白质组学等技术的交叉运用将有助于我们更清晰地了解发酵食品中微生物的群落结构演替、相互作用以及各菌株对风味的贡献，并挖掘出新的功能基因。未来微生物学、食品化学、生物信息学、分子生物学等多学科理论知识以及新的测序技术、更加完善的基因数据库、先进的数据分析工具以及多种组学方法的结合必将给发酵食品微生物的研究带来新的曙光。

参考文献：

[1] TAMANG J P, WATANABE K, HOLZAPFEL W H. Review: diversity of microorganisms in global fermented foods and beverages[J]. Frontiers in Microbiology, 2016, 7: 377. DOI:10.3389/fmicb.2016.00377.

[2] VAN HIJUM S A F T, VAUGHAN E E, VOGEL R F. Application of state-of-art sequencing technologies to indigenous food fermentations[J].Current Opinion in Biotechnology, 2013, 24: 178-186. DOI:10.1016/j.copbio.2012.08.004.

[3] BOKULICH N A, LEWIS Z T, BOUNDY-MILLS K, et al. A new perspective on microbial landscapes within food production[J].Current Opinion in Biotechnology, 2016, 37: 182-189. DOI:10.1016/j.copbio.2015.12.008.

[4] KANTACHOTE D, RATANABUREE A, SUKHOOM A, et al. Use of γ-aminobutyric acid producing lactic acid bacteria as starters to reduce biogenic amines and cholesterol in Thai fermented pork sausage (Nham)and their distribution during fermentation[J]. LWT-Food Science and Technology, 2016, 70: 171-177. DOI:10.1016/j.lwt.2016.02.041.

[5] LIU S P, YU J X, WEI X L, et al. Sequencing-based screening of functional microorganism to decrease the formation of biogenic amines in Chinese rice wine[J]. Food Control, 2016, 64: 98-104. DOI:10.1016/j.foodcont.2015.12.013.

[6] SMID E J, HUGENHOLTZ J. Functional genomics for food fermentation processes[J]. Annual Review of Food Science and Technology, 2010, 1: 497-519. DOI:10.1146/annurev.food.102308.124143.

[7] SMID E J, LACROIX C. Microbe-microbe interactions in mixed culture food fermentations[J]. Current Opinion in Biotechnology, 2013, 24: 148-154. DOI:10.1016/j.copbio.2012.11.007.

[8] GIBBONS J G, RINKER D C. The genomics of microbial domestication in the fermented food environment[J]. Current Opinion in Genetics and Development, 2015, 35: 1-8. DOI:10.1016/j.gde.2015.07.003.

[9] FRANZOSA E A, HSU T, SIROTA-MADI A, et al. Sequencing and beyond: integrating molecular ‘omics’ for microbial community profiling[J]. Nature Reviews Microbiology, 2015, 13: 360-372.DOI:10.1038/nrmicro3451.

[10] HANDELSMAN J, RONDON M R, BRADY S F, et al. Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes: a new frontier for natural products[J]. Chemistry & Biology, 1998, 5(10): 245-249.

[11] FERGUSON J F, ALLAYEE H, GERSZTEN R E, et al.Nutrigenomics, the microbiome, and gene-environment interactions:new directions in cardiovascular disease research, prevention, and treatment: a scientiベc statement from the american heart association[J].Circulation-Cardiovascular Genetics, 2016, 9(3): 291-313. DOI:10.1161/HCG.0000000000000030.

[12] FRANZOSA E A, MORGAN X C, SEGATA N, et al. Relating the metatranscriptome and metagenome of the human gut[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2014,111(22): 2329-2338. DOI:10.1073/pnas.1319284111.

[13] SILES J A, MARGESIN R. Abundance and diversity of bacterial,archaeal, and fungal communities along an altitudinal gradient in alpine forest soils: what are the driving factors?[J]. Microbial Ecology, 2016,72(1): 207-220. DOI:10.1007/s00248-016-0748-2.

[14] FAUST K, LAHTI L, GONZE D, et al. Metagenomics meets time series analysis: unraveling microbial community dynamics[J]. Current Opinion in Microbiology, 2015, 25: 56-66. DOI:10.1016/j.mib.2015.04.004.

[15] DE CÁRCER D A, LÓPEZ-BUENO A, ALONSO-LOBO J M, et al. Metagenomic analysis of lacustrine viral diversity along a latitudinal transect of the Antarctic Peninsula[J]. FEMS Microbiology Ecology,2016, 92(6): 1-10. DOI:10.1093/femsec/ベw074.

[16] DAVID L A, MAURICE C F, CARMODY R N, et al. Diet rapidly and reproducibly alters the human gut microbiome[J]. Nature, 2014, 505: 559-563. DOI:10.1038/nature12820.

[17] JUNG J Y, LEE S H, KIM J M, et al. Metagenomic analysis of kimchi,a traditional Korean fermented food[J]. Appllied and Environmental Microbiology, 2011, 77(7): 2264-2274. DOI:10.1128/AEM.02157-10.

[18] KERGOURLAY G, TAMINIAU B, DAUBE G, et al. Metagenomic insights into the dynamics of microbial communities in food[J].International Journal of Food Microbiology, 2015, 213: 31-39.DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2015.09.010.

[19] PARK E J, KIM K H, ABELL G C J, et al. Metagenomic analysis of the viral communities in fermented foods[J]. Appllied and Environmental Microbiology, 2011, 77(4): 1284-1291. DOI:10.1128/AEM.01859-10.

[20] SHENDURE J, JI H. Next-generation DNA sequencing[J]. Nature Biotechnology, 2008, 26(10): 1135-1145. DOI:10.1038/nbt1486.

[21] BLAZEWICZ S J, BARNARD R L, DALY R A, et al. Evaluating rRNA as an indicator of microbial activity in environmental communities:limitations and uses[J]. The International Society for Microbial Ecology Journal, 2013, 7: 2061-2068. DOI:10.1038/ismej.2013.102.

[22] CARVALHAIS L C, DENNIS P G, TYSON G W, et al. Application of metatranscriptomics to soil environments[J]. Journal of Microbiological Methods, 2012, 91(2): 246-251. DOI:10.1016/j.mimet.2012.08.011.

[23] PORETSKY R S, BANO N, BUCHAN A, et al. Analysis of microbial gene transcripts in environmental samples[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(7): 4121-4126. DOI:10.1128/AEM.71.7.4121-4126.2005.

[24] ROH S W, ABELL G C, KIM K H, et al. Comparing microarrays and next-generation sequencing technologies for microbial ecology research[J]. Trends in Biotechnology, 2010, 28(6): 291-299. DOI:10.1016/j.tibtech.2010.03.001.

[25] BASHIARDES S, ZILBERMAN-SCHAPIRA G, ELINAV E. Use of metatranscriptomics in microbiome research[J]. Bioinformatics and Biology Insights, 2016, 10: 19-25. DOI:10.4137/bbi.s34610.

[26] JIANG Yue, XIONG Xuejian, DANSKA J, et al. Metatranscriptomic analysis of diverse microbial communities reveals core metabolic pathways and microbiome-speciベc functionality[J]. Microbiome, 2016, 4:2. DOI:10.1186/s40168-015-0146-x.

[27] JIN H M, JEONG H I, KIM K H, et al. Genome-wide transcriptional responses of Alteromonas naphthalenivorans SN2 to contaminated seawater and marine tidal flat sediment[J]. Scientific Reports, 2016, 6:21796. DOI:10.1038/srep21796.

[28] VILA-COSTA M, RINTA-KANTO J M, SUN S L, et al.Transcriptomic analysis of a marine bacterial community enriched with dimethylsulfoniopropionate[J]. The International Society for Microbial Ecology Journal, 2010, 4: 1410-1420. DOI:10.1038/ismej.2010.62.

[29] JUNG J Y, LEE S H, JIN H M, et al. Metatranscriptomic analysis of lactic acid bacterial gene expression during kimchi fermentation[J].International Journal of Food Microbiology, 2013, 163(2/3): 171-179.DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2013.02.022.

[30] WECKX S, ALLEMEERSCH J, VAN DER MEULEN R, et al. Metatranscriptome analysis for insight into whole-ecosystem gene expression during spontaneous wheat and spelt sourdough fermentations[J]. Appllied and Environmental Microbiology, 2011, 77(2):618-626. DOI:10.1128/AEM.02028-10.

[31] WECKX S, VAN DER MEULEN R, ALLEMEERSCH J, et al.Community dynamics of bacteria in sourdough fermentations as revealed by their metatranscriptome[J]. Applied and Environmental Microbiology,2010, 76(16): 5402-5408. DOI:10.1128/AEM.00570-10.

[32] WOLFE B E, BUTTON J E, SANTARELLI M, et al. Cheese rind communities provide tractable systems for in situ and in vitro studies of microbial diversity[J]. Cell, 2014, 158: 422-33. DOI:10.1016/j.cell.2014.05.041.

[33] WOLFE B E, DUTTON R J. Fermented foods as experimentally tractable microbial ecosystems[J]. Cell, 2015, 161(1): 49-55. DOI:10.1016/j.cell.2015.02.034.

[34] ALMEIDA M, HEBERT A, ABRAHAM A L, et al. Construction of a dairy microbial genome catalog opens new perspectives for the metagenomic analysis of dairy fermented products[J]. BMC Genomics,2014, 15: 16. DOI:10.1186/1471-2164-15-1101.

[35] ESCOBAR-ZEPEDA A, SANCHEZ-FLORES A, BARUCH M Q.Metagenomic analysis of a mexican ripened cheese reveals a unique complex microbiota[J]. Food Microbiology, 2016, 57: 116-127.DOI:10.1016/j.fm.2016.02.004.

[36] MONNET C, DUGAT-BONY E, SWENNEN D, et al. Investigation of the activity of the microorganisms in a reblochon-style cheese by metatranscriptomic analysis[J]. Frontiers in Microbiology, 2016, 7: 536.DOI:10.3389/fmicb.2016.00536.

[37] DE FILIPPIS F, GENOVESE A, FERRANTI P, et al.Metatranscriptomics reveals temperature-driven functional changes in microbiome impacting cheese maturation rate[J]. Scientiベc Reports, 2016,6: 21871. DOI:10.1038/srep21871.

[38] DUGAT-BONY E, STRAUB C, TEISSANDIER A, et al. Overview of a surface-ripened cheese community functioning by meta-omics analyses[J].PLoS ONE, 2015, 10: e0124360. DOI:10.1371/journal.pone.0124360.

[39] 佟婷婷, 田丰伟, 王刚, 等. 基于宏基因组分析四川泡菜母水作引子的泡菜发酵过程中细菌多样性变化[J]. 食品工业科技, 2015, 36(21):173-177. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.027.

[40] CHEN Peng, WU Zhengrong, ZHAO Yang, et al. Cultivationindependent comprehensive investigations on bacterial communities in seroぼuid dish, a traditional Chinese fermented food[J]. Genomics Data,2016, 7: 127-128. DOI:10.1016/j.gdata.2015.12.019.

[41] CHEN Peng, ZHAO Yang, WU Zhengrong, et al. Metagenomic data of fungal internal transcribed spacer from serofluid dish, a traditional chinese fermented food[J]. Genomics Data, 2016, 7: 134-136.DOI:10.1016/j.gdata.2015.12.028.

[42] WU Rina, YU Meiling, LIU Xiaoyu, et al. Changes in flavour and microbial diversity during natural fermentation of suan-cai, a traditional food made in Northeast China[J]. International Journal of Food Microbiology, 2015, 211: 23-31. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2015.06.028.

[43] ZHAO M, ZHANG D L, SU X Q, et al. An integrated metagenomics/metaproteomics investigation of the microbial communities and enzymes in solid-state fermentation of pu-erh tea[J]. Scientiベc Reports, 2015, 5:10117. DOI:10.1038/srep10117.

[44] 杨晓苹, 罗剑飞, 刘昕, 等. 普洱茶固态发酵过程中微生物群落结构及变化[J]. 食品科学, 2013, 34(19): 142-147. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201319031.

[45] 张阳, 赵树欣, 梁慧珍, 等. 普洱茶发酵过程中真菌群落结构的变化分析[J]. 中国酿造, 2012, 31(1): 122-125.

[46] LÜ Changyong, CHEN Chaoyin, GE feng, et al. A preliminary metagenomic study of puer tea during pile fermentation[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2013, 93(11): 3165-3174. DOI:10.1002/jsfa.6149.

[47] 姜姝, 吕杰, 李灏. 普洱茶不同发酵时期微生物群落宏转录组学研究[J]. 北京化工大学学报, 2012, 39(6): 84-89. DOI:10.13543/j.cnki.bhxbzr.2012.06.022.

[48] ILLEGHEMS K, DE VUYST L, PAPALEXANDRATOU Z, et al. Phylogenetic analysis of a spontaneous cocoa bean fermentation metagenome reveals new insights into its bacterial and fungal community diversity[J]. PLoS ONE, 2012, 7(5): 38040. DOI:10.1371/journal.pone.0038040.

[49] ILLEGHEMS K, WECKX S, DE VUYST L. Applying meta-pathway analyses through metagenomics to identify the functional properties of the major bacterial communities of a single spontaneous cocoa bean fermentation process sample[J]. Food Microbiology, 2015, 50: 54-63.DOI:10.1016/j.fm.2015.03.005.

[50] ILLEGHEMS K, DE VUYST L, WECKX S. Complete genome sequence and comparative analysis of Acetobacter pasteurianus 386b,a strain well-adapted to the cocoa bean fermentation ecosystem[J]. BMC Genomics, 2013, 14(1): 526.

[51] ILLEGHEMS K, DE VUYST L, WECKX S. Comparative genome analysis of the candidate functional starter culture strains Lactobacillus fermentum 222 and Lactobacillus plantarum 80 for controlled cocoa bean fermentation processes[J]. BMC Genomics, 2015, 16: 766.DOI:10.1186/s12864-015-1927-0.

[52] ILLEGHEMS K, PELICAEN R, DE VUYST L, et al. Assessment of the contribution of cocoa-derived strains of acetobacter ghanensis and acetobacter senegalensis to the cocoa bean fermentation process through a genomic approach[J]. Food Microbiology, 2016, 58: 68-78.DOI:10.1016/j.fm.2016.03.013.

[53] SULAIMAN J, GAN H M, YIN W F, et al. Microbial succession and the functional potential during the fermentation of chinese soy sauce brine[J].Frontiers in Microbiology, 2014, 5: 556. DOI:10.3389/fmicb.2014.00556.

[54] BORA S S, KEOT J, DAS S, et al. Metagenomics analysis of microbial communities associated with a traditional rice wine starter culture (Xajpitha) of Assam, India[J]. Biotech, 2016, 6(2): 1-13. DOI:10.1007/s13205-016-0471-1.

[55] LI S, LI P, LIU X, et al. Bacterial dynamics and metabolite changes in solid-state acetic acid fermentation of Shanxi aged vinegar[J].Applied Microbiology and Biotechnology, 2016, 100(10): 4395-4411.DOI:10.1007/s00253-016-7284-3.

[56] TRČEK J, MAHNIČ A, RUPNIK M. Diversity of the microbiota involved in wine and organic apple cider submerged vinegar production as revealed by DHPLC analysis and next-generation sequencing[J].International Journal of Food Microbiology, 2016, 223: 57-62.DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2016.02.007.

[57] WANG Z M, LU Z M, YU Y J, et al. Batch-to-batch uniformity of bacterial community succession and ぼavor formation in the fermentation of Zhenjiang aromatic vinegar[J]. Food Microbiol, 2015, 50: 64-69.DOI:10.1016/j.fm.2015.03.012.

[58] WANG Zongmin, LU Zhenming, SHI Jinsong, et al. Exploring ぼavourproducing core microbiota in multispecies solid-state fermentation of traditional Chinese vinegar[J]. Scientific Reports, 2016, 6: 26818.DOI:10.1038/srep26818.

[59] LU X W, WU Q, ZHANG Y, et al. Genomic and transcriptomic analyses of the Chinese Maotai-ぼavored liquor yeast MT1 revealed its unique multi-carbon co-utilization[J]. BMC Genomics, 2015, 16: 1064.DOI:10.1186/s12864-015-2263-0.

[60] SONG G, DICKINS B J A, DEMETER J, et al. Agape (automated genome analysis pipeline) for pan-genome analysis of Saccharomyces cerevisiae[J]. PLoS ONE, 2015, 10: e0120671. DOI:10.1371/journal.pone.0120671.

[61] SONG G T, BALAKRISHNAN R, BINKLEY G, et al. Integration of new alternative reference strain genome sequences into the Saccharomyces genome database[J]. Database-the Journal of Biological Databases and Curation, 2016, 2016: 1-7. DOI:10.1093/database/baw074.

[62] STERNES P R, BORNEMAN A R. Consensus pan-genome assembly of the specialised wine bacterium Oenococcus oeni[J]. BMC Genomics,2016, 17(1): 308. DOI:10.1186/s12864-016-2604-7.

[63] IBÁNEZ C, PÉREZ-TORRADO R, CHIVA R, et al. Comparative genomic analysis of Saccharomyces cerevisiae yeasts isolated from fermentations of traditional beverages unveils different adaptive strategies[J]. International Journal of Food Microbiology, 2014, 171: 129-135. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2013.10.023.

[64] LI Y, ZHANG W, ZHENG D, et al. Genomic evolution of Saccharomyces cerevisiae under Chinese rice wine fermentation[J].Genome Biology and Evolution, 2014, 6: 2516-2526. DOI:10.1093/gbe/evu201.

[65] NALBANTOGLU U, CAKAR A, DOGAN H, et al. Metagenomic analysis of the microbial community in keベr grains[J]. Food Microbiol,2014, 41: 42-51. DOI:10.1016/j.fm.2014.01.014.

[66] ZHANG G Q, XU Q, BIAN C, et al. The Dendrobium catenatum Lindl. genome sequence provides insights into polysaccharide synthase,ぼoral development and adaptive evolution[J]. Scientiベc Reports, 2016, 6:19029. DOI:10.1038/srep19029.

[67] MENG Y, YU D, XUE J, et al. A transcriptome-wide, organ-specific regulatory map of dendrobium officinale, an important traditional Chinese orchid herb[J]. Scientiベc Reports, 2016, 6: 18864. DOI:10.1038/srep18864.

[68] APPELS R, NYSTROM J, WEBSTER H, et al. Discoveries and advances in plant and animal genomics[J]. Functional & Integrative Genomics, 2015, 15: 121-129. DOI:10.1007/s10142-015-0434-3.