牛乳是一种高营养食品，被公认为最完善的食物之一，一直以来备受人们青睐[1]。随着人们生活水平的不断提高以及食品工业的迅速发展，人们对乳品品质的要求越来越高，而乳脂肪含量是衡量牛乳品质的一项重要指标，会引起乳制品理化特性和感官特征发生改变[2-3]。有研究表明，含脂量高的乳制品具有更浓郁的香气和更醇厚的口感，含脂量低的乳制品在色泽上更加白亮[4-5]。
乳脂肪是化学组成最为复杂的油脂之一，以非极性的甘油三酯为主，有400 种以上的脂肪酸和甘油三酯相结合，其中很大一部分是瘤胃酯类代谢的中间体物质[6-7]。另外，一般天然脂肪中含有的脂肪酸绝大多数是偶数碳直链结构，而牛乳脂肪中已证实含有C9～C23的奇数碳脂肪酸，并发现了带侧链的脂肪酸[8]。牛乳脂肪含有脂肪酸、甘油酯、甾醇、磷脂、类胡萝卜素和脂溶性维生素等，96%～98%的乳脂肪为甘油三酯，以一种微小的球状或液滴状分散在牛乳体系中，直径为0.2～15 μm，平均直径约为4 μm，每个脂肪球外围都包裹着一层薄膜，其中有少量的磷脂、胆固醇和胆固醇酯，它起着乳化剂的作用，并且阻止乳脂肪球的聚合和酶退化[9-11]。乳脂肪相对于大多数植物油在结构上来说更加饱和，过量摄入饱和脂肪酸会影响健康，这就导致了消费者对含脂量高的乳制品产生负面看法[12]。另外，含脂量过高的牛乳体系较不稳定，在加工过程中易出现脂肪上浮现象[13]。
牛乳营养丰富，成分复杂，基于组学系统和整体分析，乳脂肪含量对牛乳理化性质的研究尤为重要[14]。本实验分析了不同乳脂肪含量对牛乳成分、色度、粒径、稳定性等理化特性的影响。旨在为牛乳制品的研发及生产工艺优化提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鲜牛奶样品按不同批次（n=12）均采自北京三元食品有限公司所属牧场泌乳期荷斯坦乳牛，将样品转移至避光容器中并置于手提式冷藏盒中。于2 h之内运回实验室置于（4±1）℃冰箱，备用。
尼罗红、低熔点琼脂糖 美国Sigma公司；丙酮（色谱级） 国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
Zeiss LSM 700 Meta共聚焦激光扫描电镜 德国卡尔蔡司公司；CR22N型高速离心机 日本Hitachi公司；DF-101S型恒温水浴锅 巩义市予华仪器有限责任公司；ZETASIZER NANO 2000S粒径仪 马尔文仪器有限公司；CR400型色度仪 日本柯尼卡美能达有限公司；MilkoScan FT120乳成分分析仪 福斯华（北京）科贸有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品的制备
采用离心分离的方式制备含脂量为0.5%、1.5%、2.5%、3.5%的牛乳样品。制备所得样品置于（4±1）℃冰箱保存，备用。
1.3.2 牛乳成分的测定
使用乳成分分析仪对不同含脂量牛乳样品进行成分分析时，首先配制Foss Clean清洗剂、S-470清洗液以及S-6060调零液。配好的S-470清洗液和S-6060调零液，均保存在（4±1）℃的环境中，一星期内用完。开机后，进行仪器清洗，强力清洗剂清洗之后，用S-6060调零清洗，然后用S-470清洗液清洗，再用S-6060调零液清洗。如果结果在程序设计范围内，仪器将完成调零，如果超出范围，须再次清洗仪器，重新调零校准。每次实验前后均需要用S-470清洗液清洗。
要求待测牛乳样品未变质，无结块或分层，无灰尘或其他外来颗粒。取20 mL样品于离心管中，加热至（40±1）℃，加热后开盖前振荡样品，将样品牛乳中可能存在的固体溶解，将吸管置于液面以下测出样品成分。
1.3.3 乳脂肪球的显微结构测定
质量浓度42 μg/mL的尼罗红荧光探针的制备：取420 μg尼罗红染料溶于1 mL丙酮中配制成420 μg/mL的尼罗红染料，再稀释10 倍所得。取100 μL配制并稀释好的尼罗红染液与1 mL已稀释好的乳样混合、染色，并将低熔点琼脂糖按5 g/L的质量浓度准备，并在使用前45 ℃储存；样品在被观察前须在室温条件下保持至少2 h；然后取5 μL染色样品（已被荧光染料染色）滴到载玻片上，迅速取20 μL低熔点琼脂糖与其缓慢混匀，盖上盖玻片；最后通过激光共聚焦对制备好的样品进行微观结构观察分析。采用氩激光器在波长488 nm处激发荧光探针，激发光通过500～600 nm滤波器后捕获。选取视野范围内脂肪球均匀分布的位置进行拍照处理。
1.3.4 粒径的测定
采用马尔文粒径分析仪对不同脂肪含量的牛乳样品进行粒径分析，样品需要经超纯水稀释至合适浓度，并设置聚合物选项为：milk，折光指数为1.347 0～1.351 5，测试温度设置为25 ℃，实验重复3 次。
将待测乳液倒入石英皿中，液面保持在石英皿高度的1/3处。把样品放入样品池中（加盖），置于测量室内。调节仪器温度与室温一致，调节孔径使液面处于合理位置。启动主机即可自动测出胶乳粒径。
1.3.5 色度的测定
使用色度仪进行颜色测定，比较不同脂肪含量的牛乳样品颜色差异。打开分光测色仪和电脑，在测色仪预热30 min后，打开颜色管理软件，采用CIELAB系统，进行颜色校准。先进行黑板校准，目标罩为φ 30 mm CMA123；再进行白板校准，目标罩为φ 8 mm CM-A122。采用石英比色皿CM-A97（2 mm）装入3/4容积的蒸馏水进行白板校准。校正完毕后，按含脂量0.5%、1.5%、2.5%、3.5%的顺序测量样品L*、a*、b*值，每一个含脂量测量3 组平行值。数据收集由色度仪自带软件处理。按公式（1）计算总色差：
式中：L*为白度；a*为红度；b*为黄度；ΔE*为总色差。
1.3.6 稳定性的测定
稳定性的测试方法参考杭锋等[15-17]的方法并优化修正，用稳定性分析测试仪比较分析不同样品的稳定性。取样品20 mL，置于稳定性分析仪样品池内，将样品池放入稳定性分析测试仪内进行测量。工作参数：温度25 ℃，每30 min扫描1 次，时间周期9 h。通过仪器自带软件进行分析，得到背散射光强变化曲线。
1.4 数据处理与统计学分析
实验所有结果采用单因素方差分析，P值小于0.05为差异显著，P值大于0.05为差异不显著（version 17，SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）。所有数据以
s表示。每一批次实验重复3 次。
2 结果与分析
2.1 牛乳脂肪含量对牛乳成分的影响
表1 不同含脂量牛乳样品成分分析（n=12）
Table1 Chemical composition of milk samples with different fat contents (n= 12)
注：同列不同上标小写字母表示差异显著（P＜0.05），表2、3同。
由表1可知，4 种样品游离脂肪酸含量和蛋白质含量没有显著差异（P＞0.05），乳脂肪含量、乳中总固形物含量、乳中非脂固形物含量、酸度、酪蛋白含量均表现出显著性差异（P＜0.05）。
牛乳蛋白质营养价值非常高，是乳制品品质的重要指标之一。分析结果显示，随着脂肪含量的增加，样品牛乳中蛋白质所占的含量相对减少，但是降低并不显著（P＞0.05）。引起蛋白质含量不同的因素较多，可能是由于饲养管理，即粗饲料和精料在日粮中所占比例、饲料加工方法及奶牛生产阶段的不同，导致的奶牛产奶性能及乳品质产生差异，另外，在环境和饲养状态相同的情况下，奶牛的品种，即遗传因素也可能影响乳的品质。
牛乳蛋白质中，约80%的蛋白质是酪蛋白，其余为乳清蛋白、乳球蛋白、脂肪球膜蛋白等。酪蛋白又称乳酪素，通常和钙及磷酸盐以络合物的形式存在于牛乳中，它是在20 ℃条件下，调节脱脂乳pH值为4.6时沉淀的一类两性蛋白质，是乳品中特有的一组含有大量磷和钙的蛋白，不溶于水，是乳品中重要的蛋白组分[18]。样品牛乳中除脱脂牛乳外酪蛋白含量占比均和文献[18]相一致，含脂量0.5%的样品酪蛋白含量在蛋白质中的比例稍低于80%，但总体来看，酪蛋白在蛋白质中的占比还是较稳定的。随着含脂量增加，样品中酪蛋白含量显著增加（P＜0.05）。
牛乳中酪蛋白含量在一定程度上影响乳的酸度[19-20]。由表1可知，含脂量为0.5%、1.5%、2.5%的各实验样品酸度值差异显著（P＜0.05），牛乳的滴定酸度是反映牛乳新鲜程度的一个重要指标，新鲜牛乳的固有酸度为16～18 °T，实验所用的原料牛乳均是新鲜采集，由此制备的不同含脂量样品牛乳的酸度均在标准范围内。牛乳的酸度通常是酪蛋白、白蛋白、磷酸盐、柠檬酸盐及碳酸盐等酸性成分共同作用的最终结果[19]。随着含脂量的增加，样品牛乳的酸度表现出一定的正相关，这可能是由于脂肪含量增加以及酪蛋白含量的相应增加，对酸度产生了一定影响，有研究[20]指出，酪蛋白酸钙粒子在乳中可能会以胶粒的状态存在，受到乳浆中pH值影响使得钙离子、镁离子等与粒子的结合变疏松且不稳定，进而增大滴定酸度。另外，原料乳在存贮过程中，由于细菌繁殖，在乳酸菌的作用下乳糖分解产生的乳酸也会一定程度上增大酸度值，由于本实验样品均是新鲜采集并且及时处理，因此发酵酸度对总酸度的影响较小。赵瑞生等[21]认为，正常牛乳酸度与牛乳中干物质含量正相关，本实验结果和文献报道一致，即，随着含脂量增加，样品牛乳中的总固形物含量显著增加（P＜0.05）。
乳中的游离脂肪酸是甘油三酯脂解释放出来的产物，它是乳脂肪的重要组成。王风梅等[22]研究指出，乳中含脂量越高，产生的游离脂肪酸越多。乳中广泛存在一种脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase，LPL）糖蛋白，在牛乳中与酪蛋白结合以酪蛋白胶束形式存在，LPL特异性水解sn-1和sn-3位置的脂肪酸，而乳中短链脂肪酸主要集中这2 个位置[23-24]。牛乳的含脂量越高，为脂解反应提供充足的底物，产生的游离脂肪酸含量可能会相应增加。El-Zeini等[25]指出，含脂量越高的乳，脂肪球的粒径越大。随着脂肪球粒径增大，脂肪球表面张力增大，乳脂肪球变得不稳定从而易被脂解。通过对不同含脂量牛乳样品成分进行分析，含脂量0.5%、1.5%、2.5%、3.5%的牛乳游离脂肪酸含量无显著性差异（P＞0.05），出现这个结果，可能是由于样品牛乳均是人工制备，通过离心、过滤等物理手段分离乳脂肪，一定程度上影响了牛乳体系中游离脂肪酸的含量。另外，游离脂肪酸是乳LPL脂解甘油三酯释放的产物，除了含脂量、脂肪球粒径的影响之外，LPL的作为一种糖蛋白在乳中的含量及分布也是影响游离脂肪酸形成的原因。
2.2 牛乳含脂量对粒径的影响
观察脂肪球微观结构时选用的显微镜标尺为5.0 μm，可以观察到绝大多数脂肪球。乳脂肪以一种微小的球状或液滴状分散在牛乳体系中，脂肪球的平均直径为4～5 μm，在牛乳样品中作布朗运动。如图1所示，4 个牛乳样品中脂肪球个数变化存在显著性差异（P＜0.05），随着含脂量的升高，乳脂肪球的分布更加密集。
图1 不同含脂量牛乳样品显微结构图
Fig. 1 Microstructure of milk samples with different fat contents
表2 不同含脂量牛乳样品粒径分析结果（n=12）
Table2 Particle size characteristics of milk sample particle size analysis results(n= 12)
由表2可知，含脂量0.5%、1.5%的样品牛乳和含脂量2.5%、3.5%的比表面积具有显著性差异（P＜0.05），而含脂量2.5%、3.5%的样品牛乳之间差异不显著（P＞0.05）。通过对比粒度值D3,2和D4,3，随着含脂量的增加，乳脂肪球的直径有增大的趋势，这一趋势与乳脂肪球的显微结构（图1）结果相符合。这可能是由于随着含脂量升高，乳脂肪球分布密集，布朗运动过程中相互碰撞的几率增加，脂肪球更加容易聚集并从乳体系中分离出来[22,26-28]。另外，乳脂肪球粒径增加也会对整个体系的稳定性造成一定的影响。
2.3 牛乳含脂量对牛乳色度的影响
表3 不同含脂量牛乳样品色度分析结果（n=12）
Table3 Color parameters of milk samples with different fat contents(n= 12)
产品的颜色是消费者选择食品时考虑的主要因素之一，通常食品的颜色能直观地反映出食品的成熟和新鲜程度，也是食品安全性和吸引力的重要指标。加工后乳制品的颜色特征受原料乳的影响，与原料乳的含脂量密切相关。由表3可知，不同含脂量的牛乳，在色泽上有不同程度的变化。
通过使用CIE-L*、a*、b*色度系统对样品牛乳进行测定，其中L*代表白度，L*值越大，牛乳越白（亮）；a*代表红度，正a*值越大，牛乳越红；b*代表黄度，b*值越大，牛乳越黄。样品牛乳在白（亮）度上表现出显著差异（P＜0.05），含脂量越低，样品的白（亮）程度越明显。牛乳的白色是牛乳的物理特征一个重要参数，牛乳中酪蛋白胶束和脂肪球的分散是入射光扩散的主要原因，对牛乳的亮度有一定影响。牛乳的白色还与蛋白质、核黄素以及来自类胡萝卜素等天然色素相关，低类胡萝卜素含量、高蛋白质含量和高核黄素含量的牛乳通常会更加白（亮）一些，即具有更大的L*值[29]。牛乳样品在红度上差异显著，随着含脂量的增加，红度降低。含脂量为3.5%牛乳样品在b*值显著高于含脂量2.5%的样品（P＜0.05），牛乳的黄度通过与脂肪含量密切相关，高含脂量会导致牛奶b*值的增加，即牛乳具有更黄的颜色。样品牛乳红度以及黄度的变化都一定程度上影响着其整体色泽。
含脂量为0.5%的样品牛乳总色差显著高于1.5%的样品牛乳（P＜0.05），而含脂量2.5%、3.5%的样品牛乳之间差异不显著（P＞0.05）。样品牛乳总色差的变化除了受脂肪含量的影响之外，牛乳中蛋白质含量、类胡萝卜素含量以及奶牛饲养条件差异等因素也会在一定程度上影响牛乳的总色差[5,29]。
2.4 牛乳含脂量对稳定性的影响
图2 不同含脂量牛乳样品背散射光强变化曲线
Fig. 2 Curves of backscattered light intensity of milk samples with different fat contents
通过稳定性分析测试仪分析比较不同含脂量牛乳样品的稳定性。如图2所示，扫描曲线给出了不同扫描时间透射光和反射光随样品高度的变化关系，通过背散射光的平均变化率直观反映体系的稳定性，放大了样品在测定时间内微观特性变化。稳定性分析结果表明，由于样品的不稳定性，随着时间的变化，透射光和背散射光都会发生变化，这也一定程度上说明样品颗粒的粒径发生了变化。由图2可知，在9 h的观察时间内，底部0～2 mm高度处，4 个样品均有一个向上凸的峰，随着时间的推移，背散射光强度增加，说明体积分数是增加的。根据反射物理模型，这个峰可能是由于蛋白质沉淀引起的。中间段2～32 mm（图2A）、2～35 mm（图2B）、2～36.5 mm（图2C）、2～37.5 mm（图2D）高度处，随着时间的推移，背散射光强度增加，含脂量越高，样品的背散射光强度变化越明显。这可能是因为脂肪颗粒主要以聚集为主并伴随少量上浮现象，造成体积分数减小，即含脂量越大，测试室中间段的样品体积分数变化越大，中间段范围内体系越不稳定。在测试室顶部32～44 mm（图2A）、35～44 mm（图2B）、36.5～44 mm（图2C）、37.5～44 mm（图2D）高度处，背散射光强度逐渐增加。这可能是由于底部及中间段粒径较大的脂肪颗粒上浮至顶部，使测试样品顶部的体积浓度增大，导致观察时间内的背散射光强度逐渐增加。可以得出，接近测试室顶部的样品随着含脂量增加，背散射光强度越大，脂肪上浮越明显，体系越不稳定。
乳液粒子处于连续运动并不断与其他粒子发生碰撞，碰撞频率归功于布朗运动和重力作用下的迁移，进而导致的浮油、沉淀、絮凝或聚集可能是导致分析体系失稳的主要原因[30-31]。另外，酪蛋白含量的增加也可能会对体系的稳定性产生一定的影响。
3 结 论
通过测定含脂量为0.5%、1.5%、2.5%、3.5%的新鲜牛乳样品成分、色度、粒径、稳定性等理化指标，同时结合牛乳样品的微观结构进行对比分析，研究结果表明，含脂量对牛乳成分中蛋白质含量、总固形物含量、酸度、酪蛋白含量等均有不同程度的影响。随着含脂量增加，牛乳中蛋白质所占比例相对降低，总固形物含量、酪蛋白含量以及酸度显著增加（P＜0.05）。另外，含脂量越高，牛乳中脂肪球粒径越大，体系越不稳定。含脂量低的牛乳通常在色泽上表现为更加白（亮），而含脂量越高，牛乳色泽越黄。
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