宏基因组文库新型β-葡萄糖苷酶的筛选、克隆及酶学性质分析

唐乐丽,王晓萌,吴秀玲,黄 庆,李 荷*

(广东药科大学药学院,广东 广州 510006)

摘 要:利用宏基因组文库方法,通过功能筛选法从文库中筛选到一个新型β-葡萄糖苷酶基因bgl2238(GenBank:KU320675.1),对新基因进行生物信息学分析和原核表达,并研究其酶学性质。结果表明,该基因全长2 238 bp,可编码745个氨基酸,通过氨基酸序列分析,预测bgl2238蛋白分子质量为80.67 kDa,pI值为4.95,是一种结构较稳定、疏水性高且无信号肽序列的酸性蛋白质;经同源性分析,发现其与来源于Bacteroides thetaiotaomicron的β-葡萄糖苷酶具有58%的相似性,属于GH3超家族和GH3C超家族酶。将重组质粒pET-32a(+)-bgl2238转化入Escherichia coli BL2l(DE3)细胞进行异源表达,酶学性质测定结果显示,以对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside,pNPG)为底物,β-葡萄糖苷酶bgl2238最适反应pH值和温度分别为6.10、44 ℃,此时该酶最大比活力达到29.1 U/mg;且在4~50 ℃范围内,热处理β-葡萄糖苷酶bgl2238 4 h后仍保留70%以上的酶活力,热稳定性较好;其动力学参数Vmax为576 μmoL/(L·min),Km为0.296 mmol/L;不同浓度的K、Na、Fe2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+、Co2+和Ni2+对酶活力均有较大促进作用,其中Fe2+对bgl2238酶活力的促进作用最大,10 mmol/L Fe2+使相对酶活力高达260%,而重金属离子Ag、Hg2+及Cu2+对酶活力有抑制作用。bgl2238具有良好的酶学性质,可以尝试应用于工业上纤维素降解的生产。

关键词:宏基因组文库;β-葡萄糖苷酶;克隆表达;酶学性质

微生物资源在地球上的含量十分丰富,其中原核细胞数量和种类高达到6×1030~8×1030[1],微生物具有的多样性特质,为挖掘新酶、新的代谢物质和生物活性物质提供了一种新来源[2]。然而Bakken等[3]研究发现,自然界中高达99%的微生物是未培养微生物,即在目前的实验环境下是不能被培养生长的,如果利用传统培养微生物学的方法,只能获得地球上极少数微生物的活性物质,从而兴起了宏基因组技术,1985年,Pace等通过提取环境微生物总DNA法,成功研究了大量未培养微生物所携带的遗传学信息,这之后,许多研究者都通过此方法对未培养微生物进行了研究[4-5]

β-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase,EC3.2.1.21),属于纤维素酶类,是3 种纤维素分解酶中的重要组成成分之一,它能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖键,同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。β-葡萄糖苷酶有较广泛的工业应用,可用来降解纤维素[6-8]生产生物乙醇、改善食品风味、转化大豆异黄酮糖苷化合物、制备低聚龙胆糖、防治病虫害[9-11]等。但目前工业用β-葡萄糖苷酶多数来源于木霉等真菌及茶树类植物[12-13],反应条件(如温度、pH值)适应范围相对较窄,且酶活力偏低,造成经济成本较高,制约β-葡萄糖苷酶的广泛应用[14-15]。而且生物酶应用于工业生产的条件比较苛刻,要求生物酶具有良好的热稳定性、有机溶剂耐受性、金属离子耐受性以及在特定pH值、温度条件下的高酶活力,因此需要发掘酶学性质更加优良的β-葡萄糖苷酶来提高工业生产效率,降低生产成本。宏基因组技术研究对象是微生物总DNA并独立于宿主之外进行研究,所获得的新基因一般都较完整,相似度也较低,可以用来大量筛选新的有开发前景的工业酶[16-18]。黑龙江玉米秸秆还田土壤中纤维素资源丰富,可能含有能够产生酶活力较高的β-葡萄糖苷酶微生物。本研究以黑龙江玉米秸秆还田土壤微生物为对象,构建其宏基因组文库,利用功能筛选方法,拟从文库中筛选具有酶活力较高的新型β-葡萄糖苷酶基因并对其酶学性质进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

土样采自黑龙江省牡丹江市郊区玉米秸秆还田土壤,采集表层下10~20 cm的土样,-20 ℃保存。Escherichia coli DH5α、E. coli BL21由本实验室保存。建库所用载体质粒pUC118、pET-32a(+)购自大连TaKaRa公司。

XhoⅠ、EcoRⅠ等限制性内切酶、T4 DNA连接酶以及各种DNA MarkerPrime、STARTMMax Premix、蛋白质分子质量Marker 大连TaKaRa公司;DNA凝胶回收试剂盒(E.Z.N.A®Gel Extraction Kit)、质粒提取试剂盒(E.Z.N.A®Plasmid Mini Kit)、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)产物回收试剂盒(E.Z.N.A®Cycle-Pure Kit) 美国Omega公司;氨苄青霉素(ampicillin,Amp)、5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-α-D-galactopyranoside,X-gal)、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG) 美国Sigma公司;七叶苷、对硝基苯酚(p-nitrophenol,pNP),对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside,pNPG) 生工生物工程(上海)有限公司;其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

凝胶成像系统 美国BioTek公司;电泳仪 北京六一仪器公司;PCR仪 美国AB公司;恒温水浴锅上海精密实验设备公司;电击仪 美国Bio-Rad公司;Nanodrop2000c超微量紫外-可见光分光光度计 赛默飞世尔科技公司;PB-10型pH计 德国Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米秸秆还田土壤基因组总DNA的提取[19]及纯化

取4 个高压灭菌后的50 mL离心管,称取玉米土壤样品,每管6 g,各加DNA 提取缓冲液13.5 mL,涡旋振荡混匀后,放摇床220 r/min、37 ℃活化30 min。各管加1.5 mL质量浓度20 g/100 mL 的十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS),使其终质量浓度达到2 g/100 mL。在65 ℃水浴锅中水浴2 h,每隔30 min上下轻轻颠倒数次混匀。25 ℃、6 000 r/min离心10 min。将上清液转移至高压灭菌的50 mL高速离心管,加入等体积的氯仿-异戊醇(24∶1)混合液,上下轻轻颠倒混匀。25 ℃、11 000 r/min离心30 min。收集上清液,加入0.6 倍体积的异丙醇上下轻轻颠倒混匀,室温静置3 h以上。25 ℃、11 000 r/min离心30 min。弃上清液,用4 ℃预冷的75%乙醇溶液洗涤沉淀1 次。4 ℃、8 000 r/min离心10 min,弃上清液,放入60 ℃烘箱烘干。每管加0.2 mL 65 ℃预热的ddH2O,并65 ℃温浴5 min,溶解基因组DNA。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组DNA,并立即纯化回收基因组DNA。提取的粗基因组DNA用1.0%的琼脂糖进行琼脂糖凝胶电泳,使用Omega的DNA Extraction Kit回收并纯化所提取的玉米土壤基因组DNA。

1.3.2 玉米秸秆还田土壤宏基因组文库的构建

选择EcoRⅠ酶对提取纯化的玉米土壤DNA进行不完全酶切80 min,回收2.3~8 kb的DNA片段。将回收的酶切DNA片段连接到线性化的经EcoRⅠ酶切的克隆载体上,用TaKaRa T4 DNA Ligase于16 ℃连接12~16 h。对连接产物进行纯化:取出DNA酶切片段与载体的连接产物,加入2.5 倍体积-20 ℃提前预冷的无水乙醇和0.05 倍体积的3 mol/L乙酸钠轻轻混匀,-20 ℃沉淀1 h以上;4 ℃、12 000 r/min离心20 min;弃上清液,用-20 ℃预冷的70%乙醇溶液轻轻洗涤沉淀2 次。4 ℃、12 000 r/min离心20 min,收集管中沉淀,60 ℃烘箱中烘干;加入10 μL 65 ℃预热的dd H2O重悬连接的载体DNA。将纯化的连接产物的电击转化法转入大肠杆菌E. coli DH5α感受态细胞。取适量培养物涂布于LAXI培养基(100 mg/L Amp、20% IPTG和20 mg/L X-gal),37 ℃培养过夜,即得玉米土壤宏基因组文库。

1.3.3 土壤宏基因组文库β-葡萄糖苷酶的筛选

挑选白色菌落,剔除蓝色菌落,点到β-葡萄糖苷酶筛选培养(100 μg/mL Amp、0.25%柠檬酸铁铵、0.1%七叶苷)平板上,37 ℃培养24 h,观察菌落周围是否有黑色水解圈,有黑色水解圈的菌落为β-葡萄糖苷酶阳性克隆子[20]

1.3.4 测序及序列的生物信息学分析

1.3.4.1 ORF Finder

挑选转化后仍然具有黑色透明圈的克隆子,提取质粒,EcoRⅠ单酶切,若仍旧能够切出载体和目的DNA条带,则将重组质粒送到Invitrogen公司进行序列测定。将测序得到的目的DNA序列用NCBI的ORF Finder在线工具查找该序列的开放阅读框(open reading frame,ORF),再将ORF序列经pBlast逐一比对,得到序列与已报道的功能蛋白的相似度等信息。

1.3.4.2 系统发育树和氨基酸保守性分析[21-22]

将疑似功能蛋白的基因与已报道的该蛋白各家族成员序列先用Clustal W软件比对序列并导出序列对比结果,再用MEGA 4.0软件中Unrooted Neighbor-Joining Method,the Bootstrap Test选择(1000 replicates)构建系统发育树,得到基因的种属信息和与已报道基因的亲缘关系。

1.3.4.3 等电点、信号肽等性质分析

用在线分析软件ExPASy ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)分析氨基酸等电点、半衰期、分子质量、不稳定系数和亲疏水性等。用TMHMM 2.0和SignalP 4.1 servers,分析氨基酸的跨膜区和信号肽序列。用SOPMA预测蛋白的二级结构。

1.3.5 bgl2238基因的PCR扩增与重组菌株的表达

根据测序结果设计一对引物:bgl2238-F和bgl2238-R,引物两端引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点,引物序列如下:bgl2238-fw:5′-CCGGAATTCATGAAAC ACATCCTAAACCTATGCC-3′(下划线部分为EcoRⅠ酶切位点);bgl2238-rv:5′-CCGCTCGAGTTATCGTACG CTAAAAGTAAGGGCTTC-3′(下划线部分为XhoⅠ酶切位点)。引物由Invitrogen公司合成;以包含pUC118-bgl2238的质粒为模板,采用Prime STARTMMax Premix进行PCR扩增,PCR回收试剂盒对扩增产物进行纯化回收。

分别用XhoⅠ和EcoRⅠ将纯化后的PCR产物和载体pET-32a(+)进行双酶切,用PCR回收试剂盒纯化双酶切产物,采用T4 DNA Ligase对双酶切处理的pET-32a(+)及PCR产物16 ℃连接12~16 h,直接转化E. coli BL21(DE3)。随机挑取转化子经培养后,提取其质粒并双酶切验证。挑取酶切验证正确的转化子于37 ℃摇床中培养,当OD值达到0.8左右时,加入IPTG,使其终浓度为1.0 mmol/L,25 ℃诱导表达11 h,收集菌体,超声破碎菌体后得粗酶液。粗酶液采用His·Bind®Resin试剂盒进行纯化。

1.3.6 β-葡萄糖苷酶活力的测定

将重组菌株接种于装有20 mL LB液体培养基中,25 ℃、220 r/min培养11 h,取菌液3 mL,6 000 r/min离心20 min,弃上清液,用冰预冷的无菌dd H2O洗涤沉淀两次,再用4 mL dd H2O重悬细胞沉淀,超声波破碎菌液直至变清,即为粗酶液。取10 μL一定稀释倍数的粗酶液、80 µL最适pH值的B-R缓冲液、50 mmol/L的pNPG 10 µL混合,最适温度下水浴20 min,取200 µL 1 mol/L Na2CO3溶液终止酶促反应,取上述混合物200 µL,测定OD405nm。一个酶活力单位(U)定义为每分钟分解pNPG产生1 µmol pNP所需的酶量。

2 结果与分析

2.1 玉米秸秆还田土壤总DNA的提取及纯化

图1 土壤基因组DNA的琼脂糖电泳分析
Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of soil genomic DNA

通过直接提取法获得玉米秸秆还田土壤基因组DNA,结果如图1所示,基因大小片段集中在15 kb以上,大约是23~30 kb之间,拖尾现象不明显,只有极少量DNA被降解,表明直接提取法获得的基因组DNA质量非常好,满足建库的需要。

2.2 土壤宏基因组文库的评估

将扩大酶切后的土壤基因组DNA与载体连接,电击转化入大肠杆菌E. coli DH5α,构建宏基因组文库,随机挑取16 个白色克隆子,EcoRⅠ酶切验证插入片段的大小,有14 个克隆子含有不同插入片段,文库阳性克隆率较高,重组率为87.5%,文库插入片段大小0.8~8.0 kb,该文库含有大约5 500 个阳性克隆子,其插入片段平均长度在4.5 kb左右,片段特异性较好。

2.3 土壤宏基因组文库中β-葡萄糖苷酶的筛选

利用底物七叶苷功能筛选法,对宏基因组文库进行初步筛选,从构建的宏基因组文库5 500 个克隆子中,发现1 个克隆子在七叶苷平板上有黑色水解圈,初步确定其具有β-葡萄糖苷酶活性,编号为44号克隆子,如图2所示。后期通过提质粒、酶切验证后送Invitrogen公司测序。

图 2β-葡萄糖苷酶阳性克隆子的筛选
Fig. 2 Screening of positive clones with β-glucosidase activity

2.4 测序及生物信息学分析

2.4.1 NCBI的ORF Finder

将44号克隆子的质粒送交Invitrogen公司进行测序,测序结果显示44号克隆子基因序列全长为2 470 bp。利用NCBI网站中Sequence Analysis的在线查找工具ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)对此序列进行ORF查找,从2 470 bp的插入片段中发现一个β-葡萄糖苷酶编码基因的ORF序列,该ORF基因序列全长2 238 bp,编码745 个氨基酸,基因命名为bgl2238,预测其蛋白分子质量为80.67 kDa,序列已提交至NCBI核酸数据库(GenBank),登录号为KU320675。经NCBI的BlastP在线序列比对分析,发现bgl2238基因序列所编码的蛋白bgl2238含有GH3超家族和GH3C超家族的结构域(图3),其与来源于Bacteroides thetaiotaomicron的β-葡萄糖苷酶(GenBank:WP_048691945.1)具有58%的相似性。

图3 推测的bgl2238的保守序列区域
Fig. 3 Putative conserved domains of bgl2238

2.4.2 系统发育树

使用生物信息学软件Clustal W和MEGA 4.0对bgl2238与亲源性较近的蛋白质进行系统发育树的构建,结果如图4所示,可以看出,bgl2238与来源于Alistipes CAG: 435和未培养微生物(登录号:AAZ32298.1)的β-葡萄糖苷酶亲缘关系较近,与其他来源的β-葡萄糖苷酶亲缘关系都较远。

图4 bgl2238与亲缘性较近蛋白的系统发育分析
Fig. 4 Phylogenetic analysis of bgl2238

2.4.3 bgl2238的氨基酸序列、二级结构分析

用生物信息学方法预测bgl2238的蛋白分子质量、等电点PI、半衰期、不稳定系数和亲疏水性等基本理化性质、氨基酸跨膜结构域和信号肽序列见表1,信号肽序列分析结果见图5,二级结构见图6。

表1 bgl2238的氨基酸性质分析
Table1 Amino acid properties of bgl2238

注:亲水性平均系数(grand average of hydropathicity,GRAVY),绝对值越小疏水性越高;TMHMM指蛋白在细胞膜可能的位置(包括横跨膜、内部和外部);SignalP指基因是否具有信号肽序列。

由表1可知,bgl2238的pI值为4.95,属酸性蛋白质,蛋白结构较稳定,疏水性高,位于细胞膜外且无信号肽序列。

图5 预测的蛋白bgl2238信号肽分析
Fig. 5 Signal peptide analysis prediction of protein bgl2238

图6 预测蛋白bgl2238的二级结构
Fig. 6 Secondary structure prediction of protein bgl2238

不同的mRNA结构可能编码不同的蛋白质二级结构,翻译慢的mRNA区域倾向于编码β折叠、无规则卷曲结构,翻译快的mRNA区域更倾向于编码α螺旋结构。由图6可知,bgl2238的二级结构中,α螺旋结构占37.05%,无规卷曲结构为49.93%,延伸片层结构占13.02%,说明蛋白bgl2238的mRNA翻译较快。

2.5 bgl2238基因克隆与表达

图7 基因bgl2238的PCR扩增产物
Fig. 7 Amplified products of gene bgl2238

以pUC118-bgl2238重组质粒为模板,以bgl2238-F和bgl2238-R为引物进行PCR扩增,得到一条非常明显的DNA条带,大小位于2 000~3 000 bp之间,与预期基因大小2 238 bp一致(图7)。重组质粒pET-32a(+)-bgl2238直接化转E .coli BL21(DE3)感受态细胞,对重组菌株诱导表达得粗酶液。对粗酶液进行纯化,进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,在大约100 kDa处出现了目标条带(图8),与理论计算得到β-葡萄糖苷酶分子质量大小(80.67 kDa)加上分子标签(18.15 kDa)相符合。

图8 bgl2238蛋白纯化SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图
Fig. 8 SDS-PAGE analysis of recombinant bgl2238

2.6 β-葡萄糖苷酶bgl2238酶学性质分析

2.6.1 pH值对酶活力及稳定性的影响

图9 pH值对β-葡萄糖苷酶bgl2238活力及稳定性的影响
Fig. 9 Effect of pH value on the activity and stability of β-glucosidase bgl2238

保持反应温度为44℃,不同pH值缓冲液中(1.98、2.87、4.10、5.02、6.09、6.59、7.0、7.54、7.96、8.95、9.91、10.88、11.82),测定β-葡萄糖苷酶bgl2238活力,获得一级pH值梯度下的最适pH值范围后,将pH值梯度进一步缩小,以最终获得酶最适反应pH值。将经pH 2.0~12.0缓冲液稀释的粗酶液4 ℃放置4 h后,测定剩余酶活力。将最适pH值下未经4 h孵育的最高酶活力定义为100%。结果如图9所示,bgl2238酶的最适反应pH值为6.10,用pH 6.09~6.59缓冲液处理粗酶液4 h后仍能保持60%以上的酶活力,酶促反应的pH值范围较窄,在偏酸和偏碱性环境下bgl2238的酶活性和稳定性都很低,表明bgl2238属于一种偏中性酶。

2.6.2 温度对酶活力及稳定性的影响

于最适pH值的B-R缓冲液中,分别置于4、15、30、40、45、50、60、70 ℃和80 ℃水浴中进行酶活力测定,获得一级温度梯度下的最适温度范围,再将温度梯度进一步缩小,以获得酶最适反应温度。将适当稀释的粗酶液分别放于4~80 ℃不同水浴中保温4 h,测定剩余酶活力。以未经热处理(4 ℃)的酶液的酶活力定为100%。结果如图10所示,bgl2238酶促反应的最适温度为44 ℃,在32~44 ℃范围内,酶活力随温度的升高而增大,44 ℃后,酶活力随温度上升而急剧下降,至60 ℃时bgl2238完全失活;在4~50 ℃之间不同温度下热处理bgl2238 4 h,发现bgl2238仍保留70%以上的酶活力,表明β-葡萄糖苷酶活力在50 ℃以下稳定性良好。在44 ℃、pH 6.10时bgl2238酶活力最高,计算其酶活力为29.1 U/mg。

图10 温度对β-葡萄糖苷酶bgl2238活力及稳定性的影响
Fig. 10 Effect of temperature on the activity and stability of β-glucosidase bgl2238

2.6.3 金属离子对酶活力的影响

在80 μL含金属离子终浓度分别为1 mmol/L或10 mmol/L的最适pH值缓冲液中加入10 μL经稀释的粗酶液,4 ℃放置4 h后,于最适温度条件下测定剩余酶活力。将未加金属离子的酶促反应中酶活力定义为100%。如图11所示,不同浓度的K、Na、Fe2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+、Co2+和Ni2+对酶活力均有促进作用,其中Fe2+对bgl2238酶活力的促进作用最大,10 mmol/L Fe2+使相对酶活力高达260%,增加至酶的原始活性的2 倍多,而重金属离子Ag、Hg2+及Cu2+对酶活力有强烈抑制作用。

图11 金属离子对β-葡萄糖苷酶bgl2238活性的影响
Fig. 11 Effect of metal ions on the activity of β-glucosidase bgl2238

2.6.4 β-葡萄糖苷酶bgl2238酶促动力学分析

以pNPG为底物,将粗酶液稀释50 倍,利用Lineweaver-Burk双倒数法测定bgl2238的米氏常数,以1/V为纵坐标、1/[S]为横坐标作图,曲线与x轴相交的点为-1/Km,与y轴相交的点为1/Vmax。结果如图12所示,β-葡萄糖苷酶bgl2238以pNPG为底物时,Vmax=576 μmoL/(L·min),Km= 0.296 mmol/L。

图12 β-葡萄糖苷酶bgl2238以pNPG为底物的动力学参数
Fig. 12 Lineweaver-Burk plot for β-glucosidase bgl2238 with pNPG as substrate

3 结 论

宏基因组技术通过基因克隆、序列筛选或者功能筛选法、基因表达等手段,避开了绝大多数微生物难以分离培养的问题,为挖掘新型生物催化剂开辟了新途径[23-29]。本研究筛选到的β-葡萄糖苷酶bgl2238经测定,最适pH值为6.10,用pH 6.09~6.59缓冲液处理粗酶液4 h后仍能保持60%以上的酶活力,表明bgl2238属于一种偏中性酶,在生产过程中只需保持酶促反应的pH值在中性附近即可,对生产设备的酸碱度耐受性要求低,节约成本。β-葡萄糖苷酶bgl2238最适温度为44 ℃,当酶促反应温度升高到50 ℃时,相对酶活力不足40%,说明此酶不耐高温。不同的金属离子影响酶的活性,目前大约35%已知酶在金属离子存在下活性增加[30-31],金属离子通过与带负电的氨基酸残基结合而增加酶结构的稳定性。本研究中不同浓度的几种金属离子对β-葡萄糖苷酶bgl2238活力均有激活作用,其中Fe2+对酶活力的促进作用最大,10 mmol/L Fe2+使相对酶活力高达260%,增加至酶的原始活性的2 倍多,利用β-葡萄糖苷酶bgl2238这一特性,向酶促反应体系中加入适当浓度的K、Na、Fe2+可以明显提升bgl2238的酶活力,从而避免某些酶因严重依赖一些金属离子(如Mg2+、Mn2+、Cu2+、Ca2+、Co2+、Zn2+和Ni2+等)而造成的金属环境污染。为使得bgl2238能够更好、更广泛地应用于工业生产,后期可通过易错PCR对β-葡萄糖苷酶bgl2238进行改造并构建突变文库,以期获得对温度和pH值耐受性更好的酶。

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Screening, Cloning and Characterization of a Novel β-Glucosidase from Soil Metagenomic Library

TANG Leli, WANG Xiaomeng, WU Xiuling, HUANG Qing, LI He*
(College of Pharmacy, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China)

Abstract:A novel β-glucosidase gene, bgl2238, was isolated from a metagenomic library by functional screening (GenBank:KU320675.1). The bgl2238 gene was sequenced and expressed in Escherichia coli BL21(DE3). The biochemical properties of the resulting protein were further examined. Amino acid sequence analysis showed that the full length of the gene was 2 238 bp, which encoded a protein of 745 amino acids. The β-glucosidase had a molecular mass of 80.67 kDa with an isoelectric point (pI) of 4.95, and it was identified as an acidic protein with stable structure and high hydrophobicity and without signal peptide sequence. Phylogenetic analysis of the bgl2238 gene indicated 58% similarity to the β-glucosidase from Bacteroides thetaiotaomicron, and it belonged to the GH3 and GH3C superfamily. bgl2238 was ligated into the vector pET-32a(+) and then transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) for heterologous expression. The maximal activity(29.1 U/mg) of the enzyme was observed at 44 ℃ and pH 6.10 with 4-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (pNPG) as the substrate; furthermore it retained 70% of its activity within the temperature range of 4‒50 ℃ for 4 h. The Kmand Vmaxvalues of bgl2238 were 0.296 mmol/L and 576 μmoL/(L·min), respectively. Its activity was enhanced significantly by K+, Na+,Fe2+, Mg2+, Mn2+, Ca2+, Co2+and Ni2+at various concentrations; among these metal ions, Fe2+was found to have the biggest promoting effect and a relative activity up to 260% was attained at a Fe2+concentration of 10 mmol/L. On the other hand, the presence of heavy metal ions (Ag+, Hg2+and Cu2+) inhibited its activity. To sum up, these characteristics were beneficial for the potential application of bgl2238 in industrial cellulose degradation.

Keywords:metagenome library; β-glucosidase; cloning and expression; enzymatic properties

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201804018

中图分类号:Q939.9

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2018)04-0118-07

引文格式:唐乐丽, 王晓萌, 吴秀玲, 等. 宏基因组文库新型β-葡萄糖苷酶的筛选、克隆及酶学性质分析[J]. 食品科学, 2018, 39(4):118-124.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201804018. http://www.spkx.net.cn

TANG Leli, WANG Xiaomeng, WU Xiuling, et al. Screening, cloning and characterization of a novel β-glucosidase from soil metagenomic library[J]. Food Science, 2018, 39(4): 118-124. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201804018. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2017-02-28

基金项目:广东省科技厅项目(2013B010404044;2017A010105011);国家自然科学基金青年科学基金项目(3140068);广东省教育厅项目(2013KJCX0107;2016KTSCX067);广东省攀登计划项目(pdjh2017b0262)

第一作者简介:唐乐丽(1993—),女,硕士研究生,研究方向为应用微生物与生物工程。E-mail:tangleli@163.com

*通信作者简介:李荷(1968—),女,教授,博士,研究方向为应用微生物与生物工程。E-mail:lihe32@163.com