响应面法优化金蝉花多糖提取工艺及抗氧化活性分析

金蝉花（Cordyceps cicadae）亦称蝉花、蝉蛹草、蝉茸草，为麦角菌科真菌蝉草及其寄主山蝉的幼体干燥体，属虫草类药食两用真菌，主要分布于浙江、安徽、四川、福建等地。据报道，金蝉花作为优质虫草，其活性成分与冬虫夏草相似[1]，有望成为冬虫夏草的替代品，近年来受到许多学者的关注。金蝉花主要活性成分为多糖、核苷、甘露醇、麦角甾醇等[2-3]，其中多糖为其主要有效成分。

多糖类化合物广泛存在于动植物细胞膜和细胞壁中，主要由醛基和酮基通过苷键连接的高分子聚合物，被称为构成生命的四大基本物质[4]。研究发现，金蝉花多糖具有抗肿瘤[5]、降血糖[6]、免疫调节[7-9]和抗惊厥[10]等重要作用。采用水提法探索金蝉花多糖较适宜的提取工艺条件，并研究金蝉花多糖的抗氧化活性，为金蝉花多糖的开发及综合利用提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金蝉花产自浙江绍兴。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）、浓硫酸（均为分析纯） 和光纯药工业株式会社；羟甲基氨基甲烷（Tris） 台湾生工有限公司；茯苓多糖口服液（国药准字B20050015） 湖南补天药业有限公司；蒽酮、葡聚糖、无水乙醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三氯乙酸、三氯化铁、铁氢化钾、硫酸亚铁、水杨酸、邻苯三酚（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Cary 50 Scan紫外分光光度计 美国瓦里安技术（中国）有限公司；WK-200B高速药物粉碎机 山东青州市精诚机械有限公司；H1650型高速台式离心机长沙湘仪离心机设备有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循环水真空泵 巩义市英峪予华仪器厂；FD-ID-80冷冻干燥机北京博医康实验仪器有限公司；UH-S2超声波仪 天津奥特赛恩斯仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 金蝉花多糖的提取

参考杨娜等[11]方法：金蝉花→烘干→粉碎过筛（40目）→加水搅匀→超声波辅助处理→热水浸提→过滤→浓缩→Sevag法去蛋白[12]→醇沉→冷冻干燥→金蝉花粗多糖。

1.3.2 金蝉花多糖含量测定

参考张惟杰等[13]硫酸-蒽酮法，以葡聚糖为标准品，绘制标准曲线，并测定样品多糖含量。

1.3.2.1 标准曲线的绘制

配制质量浓度为10、20、30、40、50 μg/mL的葡萄糖溶液，分别取1 mL于各试管中，加4 mL硫酸蒽酮溶液反应，迅速放入冰水中冷却，沸水浴10 min，取出放入自来水中冷却10 min，以蒸馏水代替葡萄糖溶液为空白对照，在620 nm波长处测定其吸光度。绘制标准曲线得回归方程y=0.007 9x＋0.008 2，R2=0.998 3。

1.3.2.2 金蝉花多糖含量的测定

准确称取按1.3.1节方法得到的金蝉花粗多糖粉末，配得质量浓度为1 mg/mL的粗多糖溶液，取1.0 mL样品溶液加入4 mL硫酸蒽酮溶液，按1.3.2.1节方法测得吸光度，根据公式（1）计算金蝉花多糖含量：

式中：W为金蝉花多糖含量/（mg/g）；C为样品溶液多糖质量浓度/（μg/mL）；V为样品定容体积/mL；m为原料质量/g。

1.3.3 单因素试验

按照1.3.1节的方法分别考察超声功率（60、90、120、150、180、200 W）、超声时间（10、20、30、40、50、60 min）、浸提温度（50、60、70、80、90、100 ℃）、浸提时间（30、60、90、120、150、180 min）以及液料比（20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1（mL/g））5 个因素对金蝉花多糖提取的影响。

1.3.4 响应面试验

在单因素试验的基础上，确定超声波辅助处理的功率和时间，对其余3 个因素利用响应面分析法对提取工艺条件进行进一步的优化。根据Box-Behnken试验设计原理[14]，选取浸提时间（A）、浸提温度（B）、液料比（C）3 个因素为自变量，以金蝉花多糖含量为响应值（Y），进行三因素三水平的响应面试验分析，得到金蝉花多糖提取的适宜工艺参数。试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面分析因素与水平
Table1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used for Box-Behnken design

?

1.3.5 金蝉花多糖抗氧化活性实验

1.3.5.1 金蝉花多糖还原力的测定

样品还原能力的测定采用普鲁士蓝法[15]，具体操作参照Pan Yingming等[16]方法：准确吸取1.0 mL不同质量浓度多糖溶液，分别加入2.5 mL磷酸盐缓冲溶液（pH 6.6，0.2 mol/L）和2.5 mL 1%铁氰化钾溶液，50 ℃反应20 min，随后加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液终止反应。3 000 r/min离心10 min，取上清液2.5 mL，加2.5 mL无水乙醇和0.5 mL 0.1% FeCl3溶液，混匀，于700 nm波长处测定吸光度，平行测定3 次，以VC和茯苓多糖作为对照。测得吸光度越大说明样品还原力越强。

1.3.5.2 金蝉花多糖清除DPPH自由基能力的测定[17]

分别在不同质量浓度的多糖溶液中加入2 mL DPPH-乙醇溶液（0.2 mmol/L），振荡混匀，避光静置30 min，于517 nm波长处测定吸光度Ai。同时，用无水乙醇代替DPPH-乙醇溶液，测得吸光度Aj，并测得2 mL DPPH-乙醇溶液和2 mL无水乙醇混合液的吸光度A0。以无水乙醇为参比，以VC和茯苓多糖作为对照，DPPH自由基清除率按公式（2）计算：

式中：A0为2 mL DPPH-乙醇溶液＋2 mL无水乙醇吸光度；Ai为2 mL DPPH-乙醇溶液＋2 mL样品溶液吸光度；Aj为2 mL无水乙醇＋2 mL样品溶液吸光度。

1.3.5.3 金蝉花多糖清除·OH能力的测定

采用Fenton反应体系法[18-19]：分别往试管中加入不同浓度的多糖溶液1.0 mL，再分别加入1 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液，1 mL 6 mmol/L的H2O2溶液和1 mL 6 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液，37 ℃水浴1 h，在510 nm波长处测定其吸光度Ai。用蒸馏水代替样品溶液测得A0，用蒸馏水代替双氧水溶液测得吸光度Aj，按照公式（3）计算·OH清除率：

式中：A0为1 mL FeSO4溶液＋1mL蒸馏水＋1mL H2O2溶液＋1mL水杨酸-乙醇溶液吸光度；Ai为1 mL FeSO4溶液＋1 mL样品溶液＋1 mL H2O2溶液＋1 mL水杨酸-乙醇溶液吸光度；Aj为1 mL FeSO4溶液＋1 mL样品溶液＋1 mL蒸馏水＋1 mL水杨酸-乙醇溶液吸光度。

1.3.5.4 金蝉花多糖清除·能力的测定

参考朱月等[20-21]使用的邻苯三酚自氧化法：取4.5 mL的Tris-HCl缓冲溶液（pH 8.2，50 mmol/L）于试管中37 ℃水浴预热20 min，加入4 mL蒸馏水，37 ℃水浴20 min，取出加入0.5 mL 3 mmol/L的邻苯三酚溶液37 ℃水浴预热20 min，计时1 min后迅速摇匀倒入比色皿，以10 mmol/L的HCl溶液作为对照，利用US-Vis Analyst软件，设置波长为325 nm，测定时间间隔为30 s，测定其吸光度，以时间、吸光度为坐标作图，斜率即为邻苯三酚自氧化速率v0。用4 mL多糖溶液代替4 mL蒸馏水，按上述同样方法进行实验，以VC和茯苓多糖作对照，斜率为加有相应浓度样品溶液的邻苯三酚氧化速率v1，按公式（4）计算·清除率：

式中：v0为邻苯三酚自氧化速率；v1为加入样品溶液作为抑制剂后邻苯三酚氧化速率。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 超声时间对金蝉花多糖含量的影响

在液料比50∶1（mL/g）、超声功率150 W、浸提温度80 ℃、浸提时间90 min条件下，考察超声时间对金蝉花多糖提取的影响，如图1所示。

图1 超声时间对金蝉花多糖含量的影响
Fig. 1 Effect of ultrasonic treatment time on polysaccharide yield

由图1可以看出，在超声时间小于20 min时，金蝉花多糖含量随着超声时间的延长而增加；在20 min时，多糖含量较高，此时多糖含量为26.77 mg/g。在超声时间大于20 min时，金蝉花多糖含量呈现下降，这可能是随着超声时间的延长，多糖降解所致[22]。

2.1.2 超声功率对金蝉花多糖含量的影响

在超声时间20 min、浸提温度80 ℃、浸提时间90 min、液料比50∶1（mL/g）条件下，考察超声功率对金蝉花多糖提取的影响。由图2可知，超声功率在60～120 W时，多糖含量随功率的增加而增加；当超过120 W时，多糖含量随着超声功率的增加而下降。当超声功率为120 W时，多糖含量较高，可达26.72 mg/g。

图2 超声功率对金蝉花多糖含量的影响
Fig. 2 Effect of ultrasonic power on polysaccharide yield

2.1.3 浸提时间对金蝉花多糖含量的影响

在超声时间20 min、超声功率120 W、浸提温度80 ℃、液料比50∶1（mL/g）的条件下，考察浸提时间对金蝉花多糖提取的影响。由图3可知，当浸提时间达到120 min时，金蝉花多糖含量较高，为27.15 mg/g；随后随着时间延长多糖含量开始下降，这可能是多糖在水中浸提时间过长后结构遭到破坏导致的[23]。

图3 浸提时间对金蝉花多糖含量的影响
Fig. 3 Effect of extraction time on polysaccharide yield

2.1.4 浸提温度对金蝉花多糖含量的影响

在超声时间20 min、超声功率120 W、浸提时间120 min、液料比50∶1（mL/g）的条件下，考察浸提温度对金蝉花多糖含量的影响。从图4可看出，当浸提温度小于80 ℃，随着浸提温度升高，金蝉花多糖含量不断的增加；但当浸提温度大于80 ℃时，随着浸提温度的升高金蝉花多糖含量反而明显下降，这一现象可能是由于温度不断升高，从而使得多糖部分水解[24]。因此，金蝉花多糖提取温度可控制在80 ℃左右。

图4 浸提温度对金蝉花多糖含量的影响
Fig. 4 Effect of extraction temperature on polysaccharide yield

2.1.5 液料比对金蝉花多糖含量的影响

当超声时间20 min、超声功率120 W、浸提温度80 ℃、浸提时间120 min条件下，考察液料比对金蝉花多糖提取的影响。由图5可知，液料比对金蝉花多糖浸提有一定的影响，金蝉花多糖含量随着液料比的增大呈现出先增加后降低的趋势。当液料比达到50∶1（mL/g）时，金蝉花多糖含量较高，达27.32 mg/g。

图5 液料比对金蝉花多糖含量的影响
Fig. 5 Effect of solvent-to-solid ratio on polysaccharide yield

2.2 金蝉花多糖提取工艺条件的优化

2.2.1 模型方程建立与显著性检验

在单因素试验基础上，选用响应面分析法对金蝉花多糖的提取工艺条件进行优化。试验方案设计及结果见表2。

表2 响应面优化试验设计与结果
Table2 Experimental design with experimental values of polysaccharide yield for response surface analysis

?

利用Design-Expert 8.0软件，建立浸提时间、浸提温度及液料比三因子数学回归模型为：Y=27.54-1.06A-0.072B-0.36C-0.24AB-0.19AC-0.035BC-1.12A2-0.45B2-1.0C2。

表3 回归模型的方差分析
Table3 Analysis of variance of regression model

注：**. P＜0.001，差异极显著；*. P＜0.05，差异显著。

?

从表3可看出，一次项中，A（浸提时间）对多糖含量的线性效应极显著（P＜0.001），C（液料比）对多糖含量的线性效应显著（P＜0.05），B（浸提温度）对多糖含量的线性效应不显著（P＞0.05），二次项中，A2、C2影响均极显著（P＜0.001），B2影响显著（P＜0.05），AB、AC、BC影响不显著（P＞0.05）。此模型显著性检测P值为0.000 4，极显著，失拟项P值为0.055 3，不显著，校正模型的相关系数R2值为0.962 0，决定系数值为0.913 1，说明选用的模型与实际情况拟合较好、误差小，能较好反应出各因素与金蝉花多糖含量之间关系。由F值可知，在试验范围内各因素对多糖含量的影响大小依次为A（浸提时间）＞C（液料比）＞B（浸提温度）。

2.2.2 交互作用影响结果

图6 各因素交互作用对多糖含量影响的响应面图
Fig. 6 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on polysaccharide yield

由图6可知，浸提时间、浸提温度和液料比对金蝉花多糖的提取都有着显著的影响。其中，浸提时间影响最为显著，图中曲面陡峭，随着浸提时间延长金蝉花多糖含量增加；液料比的影响相对显著，曲面较为陡峭；浸提温度影响次之，表现为曲面平缓。

通过回归模型的分析，以多糖含量为评价指标，金蝉花多糖适宜的提取工艺参数为浸提时间136.33 min、浸提温度77.80 ℃、液料比47.84∶1（mL/g）。在此条件下，模型预测金蝉花多糖含量为26.71 mg/g。考虑到实际应用过程中操作简便，将工艺条件修正为浸提时间130 min、浸提温度80 ℃、液料比50∶1（mL/g）；在此条件下，得到金蝉花多糖含量为26.14 mg/g，误差为0.57 mg/g，实际值与理论值基本相符，说明模型对金蝉花多糖提取工艺条件参数优化可靠可行，具有一定的实用价值。

2.3 金蝉花多糖抗氧化活性的测定结果

2.3.1 总还原能力

图7 不同质量浓度多糖的总还原能力
Fig. 7 Total reducing capacity of WSP as a function of its concentration

如图7所示，在质量浓度0.2～1.2 mg/mL范围内，金蝉花多糖和VC还原能力均随着质量浓度增加而增强，两者还原能力相近，而茯苓多糖还原力明显低于金蝉花多糖和VC。表明金蝉花多糖具有良好的还原能力，此结果与封燕等[25]的研究结果相一致。

2.3.2 清除DPPH自由基的能力

图8 多糖对DPPH自由基清除能力
Fig. 8 Scavenging effect of WSP on DPPH

由图8可知，金蝉花多糖清除DPPH自由基能力较强。在质量浓度10～100 μg/mL范围内，金蝉花多糖和VC随着溶液质量浓度的增加，对DPPH自由基的清除能力先增强后趋于稳定，其中当质量浓度大于60 μg/mL，金蝉花多糖对DPPH自由基的清除率趋于平缓，基本保持在82%以上，而此质量浓度范围内，茯苓多糖对DPPH自由基的清除率基本在10%以下，明显低于金蝉花多糖。经线性拟合，金蝉花多糖对DPPH自由基的IC50值为28.99 μg/mL。

2.3.3 对·OH的清除作用

图9 多糖对·OH的清除能力
Fig. 9 Scavenging effect of WPS on ·OH

由图9可知，在质量浓度0.1～0.6 mg/mL范围内，金蝉花多糖随着质量浓度的增加，对·OH的清除能力逐渐增强；金蝉花多糖溶液质量浓度从0.1 mg/mL增加到0.6 mg/mL，对·OH的清除率从29.02%增加到87.56%；此时，VC的清除率基本保持在96%以上，较金蝉花多糖清除能力强，但茯苓多糖的清除率基本保持在10%以下，明显低于金蝉花多糖。根据清除率拟合曲线y=1.228 7x＋0.223 2，R2=0.922 9，经线性拟合，金蝉花多糖对·OH的IC50值为0.19 mg/mL。

2.3.4 清除·的能力

由图10可知，在质量浓度0.1～0.5 mg/mL范围内，蝉花多糖对·清除能力随着溶液质量浓度的增加而增强，金蝉花多糖质量浓度从0.1 mg/mL增加到0.5 mg/mL，清除率从18.78%增加到67.40%。经线性拟合，金蝉花多糖对·的IC50值为0.30 mg/mL。

图10 多糖对·的清除能力
Fig. 10 Scavenging effect of WSP on

3 结 论

采用超声波辅助水提醇沉法提取了金蝉花多糖，并利用响应面分析法进行优化，得到金蝉花多糖提取工艺参数为浸提时间130 min、浸提温度80 ℃、液料比50∶1（mL/g），在此条件下金蝉花多糖含量实际值为26.14 mg/g。

通过测定金蝉花多糖总还原力、清除DPPH自由基、·OH、·能力等多项指标评价金蝉花多糖抗氧化活性，结果显示金蝉花多糖对DPPH自由基、·OH、·的IC50分别为28.99 μg/mL、0.19 mg/mL、0.30 mg/mL，表明金蝉花多糖具有较强的抗氧化能力。研究结果与鲁吉珂[26]、Zhu Zhenyuan[27]等相一致。此外，金蝉花多糖对DPPH等自由基的清除能力与文献[28-29]对冬虫夏草多糖抗氧化活性的研究结果相似，这也说明金蝉花多糖具有较好的抗氧化活性。

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