响应面试验优化酶解法制备海洋微藻微拟球藻抗氧化肽工艺

吕小京1,操德群1,2,徐年军1,2,*

(1.宁波大学海洋学院,浙江省海洋生物工程重点实验室,浙江 宁波 315211;2.宁波大学 应用海洋生物技术教育部重点实验室,浙江 宁波 315211)

摘 要:以海洋微藻饵料微拟球藻蛋白为原料,采用胃蛋白酶酶解制备微拟球藻抗氧化肽。以酶解产物的水解度和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除活性为评价指标,研究酶底比(质量百分比)、底物质量浓度、酶解温度和pH值对酶解产物的影响。在单因素试验的基础上,利用响应面法优化制备高抗氧化活性抗氧化肽的工艺条件,确定最佳酶解工艺条件为:底物质量浓度5.0 mg/mL、酶解温度32 ℃、pH 1.36、酶底比6%。在最佳酶解条件下实际测得微拟球藻抗氧化肽的DPPH自由基清除率为51.85%。

关键词:微拟球藻;抗氧化肽;DPPH自由基清除活性;水解度;响应面法

自从Harman[1]提出自由基理论以来,人们认识到食物氧化变质及人体内氧化代谢产生的自由基与人的衰老和很多疾病有关。自由基会对细胞核组织造成严重氧化损伤,加速人体衰老,也会诱发动脉硬化、老年痴呆症、癌症等疾病[2]。抗氧化剂具有清除自由基和抑制脂质过氧化的功能,可用于含脂肪食品的抗氧化及保健食品、化妆品的开发,因此抗氧化剂近些年在国内外发展很快[3-4]。目前使用的多为化学合成抗氧化剂,如丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯等,其本身具有毒副作用,所以各国政府对其添加量进行了严格控制[5]。生物体由于处于不同的生态环境,以及自然衰老等原因,体内会产生很多自由基,如羟自由基、氧自由基等。生物体在长期的进化过程中,产生了多种抗逆机制,为了提高自身的抗逆性,生物体在逆境条件下应激性产生抗氧化肽类生物活性物质。于是人们把目光逐步转向从各种动植物组织中提取天然抗氧化剂。国内外研究人员已从大米[6]、小麦[7]、玉米[8]、鹰嘴豆[9]、鸭肉[10]、鸡蛋清[11]、草鱼[12]、贻贝[13]、轮虫[14]、螺旋藻[15]等动植物来源的蛋白质中提取出了具有抗氧化活性的肽类物质。天然抗氧化肽具有安全性高、抗氧化性强、易被人体吸收等特点,作为食品和机体的抗氧化剂,是近年来热门的研究课题。

微拟球藻(Nannochloropsis)是一种海洋来源的饵料微藻,目前已经被批准为新资源食品。微拟球藻生长周期短,营养价值高,并且可以实现大规模养殖,具有很大的开发潜力和商业化应用前景[16]。微拟球藻含有丰富的二十碳五稀酸、蛋白质及矿物质,具有很高的营养价值[17],在美国、智利等国家倍受欢迎。目前,该藻种主要应用于水产养殖、食品、保健食品、生物制药、化妆品和生物柴油等领域[18],对微拟球藻中生物活性物质的研究还很少。本研究以微拟球藻为原料制备微拟球藻蛋白,通过酶解法制备微拟球藻抗氧化肽,以水解度及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除活性为评价指标,经单因素试验和响应面法分析确定了最佳酶解工艺条件,以期为微拟球藻抗氧化肽的开发及综合利用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

微拟球藻(Nannochloropsis sp.)藻粉 烟台海融生物技术有限公司。

胃蛋白酶、考马斯亮蓝G-250、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、透析袋(截留分子质量为3 500 Da) 北京索莱宝科技有限公司;DPPH、邻苯二甲醛(o-phthaldialdehyde,OPA)、2-巯基乙醇、L-还原型谷胱甘肽(L-glutathione reduced,GSH)、四硼酸钠、十二烷基硫酸钠 美国Sigma公司;其他试剂均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

FD-1C-80冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司;Sorvall ST 16R冷冻离心机 赛默飞世尔科技公司;SpectraMax 190全波段酶标仪 美国Molecular Devices公司;Vortex-2旋涡混合器 艾卡(广州)仪器设备有限公司;BSA224S电子分析天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;DK-8D电热恒温水槽 上海精宏实验设备有限公司;DHG-9070A(S)电热恒温鼓风干燥箱 宁波江南仪器厂;SevenEasy pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 微拟球藻蛋白的制备

微拟球藻藻粉→超纯水(固液比1∶10)→反复冻融→合并上层提取液→低温离心(8 ℃,16 000×g,10 min)→上清液→减压抽滤(0.45 μm水系滤膜)→滤液→盐析(50%饱和度硫酸铵溶液)→低温离心(8 ℃,10 000×g,10 min)→分别收集沉淀物和上清液→上清液进行二次盐析(80%饱和度硫酸铵溶液)→低温离心(8 ℃,10 000×g,10 min)→合并沉淀物→少量超纯水溶解→透析(截留分子质量为3.5 kDa,4 ℃,36 h)→冷冻干燥→微拟球藻蛋白(于-40 ℃棕色样品瓶避光保存)。

1.3.2 蛋白质量浓度标准曲线及可溶性蛋白含量测定

蛋白质量浓度标准曲线的绘制采用考马斯亮蓝法,以BSA作为标准物,用考马斯亮蓝G-250测定蛋白质量浓度,测定波长为595 nm,以吸光度对蛋白质量浓度绘制标准曲线[19]。根据蛋白质量浓度标准曲线即可求出微拟球藻蛋白溶液中可溶性蛋白含量。

1.3.3 酶解实验

选用胃蛋白酶做酶解实验。将微拟球藻蛋白用一定pH值的1.0 mmol/L磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)溶解,配制成一定质量浓度的微拟球藻蛋白溶液,然后按一定比例加入蛋白酶,用旋涡混合器混匀,置于水浴锅中在恒温条件下进行酶解实验。酶解8 h后,将酶解物于95 ℃水浴15 min灭酶活,室温下冷却后冰浴30 min,然后低温离心(4 ℃,16 000×g,10 min),上清液过0.45 μm水系过滤器,取100 μL用于测定水解度,剩余溶液冷冻干燥得到微拟球藻蛋白酶解物,于-40 ℃保存备用。

1.3.4 水解度的测定

水解度参照Vasquezvillanueva等[20]的OPA法进行测定。在96 孔酶标板中分别加入2.5 μL酶解液和100 μL OPA混合液,25 ℃孵化8 min,然后用酶标仪在340 nm波长下测定吸光度。用GSH(0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL,用pH 7.0、1.0 mmol/L PBS配制)作为标准品绘制多肽含量的标准曲线,求出样品中的多肽含量,蛋白含量用考马斯亮蓝法测定。水解度计算如式(1)所示:

1.3.5 DPPH自由基清除活性的测定

DPPH自由基清除率的测定参照Li Ke等[21]的方法并修改。将冷冻干燥后的酶解物(溶解于pH 7.0、1.0 mmol/L PBS)配制成2.0 mg/mL的样品溶液,同时将DPPH溶解于无水乙醇中配制成0.16 mmol/L的DPPH溶液。在96 孔酶标板中加入100 μL样品溶液和100 μL DPPH溶液,25 ℃避光反应30 min后,于517 nm波长处测定吸光度。同时以100 μL样品溶液和100 μL无水乙醇混合后的吸光度为对照组;以100 μL 1.0 mmol/L PBS和100 μL DPPH溶液混合后的吸光度为空白组。DPPH自由基清除率计算如式(2)所示:

式中:Ai为样品组溶液的吸光度;Aj为对照组溶液的吸光度;A0为空白组溶液的吸光度。

1.3.6 单因素试验设计

酶解步骤如1.3.3节,分别对酶底比(质量百分比1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%)、底物质量浓度(0.7、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0 mg/mL)、酶解温度(27、32、37、42、47、52 ℃)、pH值(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5)进行单因素试验,考察各因素对酶解产物水解度及DPPH自由基清除活性的影响。

1.3.7 响应面试验设计

在单因素试验的基础上,固定酶底比6.0%、酶解时间8 h,根据Box-Behnken试验设计原理,以底物质量浓度、酶解温度、pH值这3 个因素为自变量,DPPH自由基清除率为响应值,采用软件Design-Expert V8.0.6设计三因素三水平的响应面分析试验,确定微拟球藻蛋白酶解最佳工艺条件,试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验因素与水平
Table 1 Coded levels for independent variables used in response surface analysis

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 酶底比对酶解物水解度及抗氧化活性的影响

在底物质量浓度20.0 mg/mL、酶解温度37 ℃、pH 2.0、酶解8 h的条件下,由图1可知,随着酶底比的增加,蛋白水解度逐渐增加,说明酶质量分数的增加可以增加底物与酶的接触机率,从而加速酶解反应进程,水解度增大[22]。当酶底比达到5%时,蛋白水解度达到最大,继续增加酶底比反而使水解度略有下降,可能是因为随着产物浓度的提高,产物与酶形成复合物,阻碍了底物与酶的结合,从而减缓了水解进程,使水解度缓慢减小。观察酶解产物的抗氧化活性可以发现,不同酶底比对于酶解物的抗氧化活性影响不大,只在酶底比为6%时酶解物的DPPH自由基清除率略有增加。综合考虑水解度和抗氧化活性,选择最适酶底比为6%。

图1 酶底比对酶解物水解度及抗氧化活性的影响
Fig. 1 Effects of enzyme-to-substrate ratio on DH and antioxidant activity of hydrolysates

2.1.2 底物质量浓度对酶解物水解度及抗氧化活性的影响

图2 底物质量浓度对酶解物水解度及抗氧化活性的影响
Fig. 2 Effects of substrate concentrations on DH and antioxidant activity of hydrolysates

在酶底比6%、酶解温度37 ℃、pH 2.0、酶解8 h的条件下,如图2所示,水解度随底物质量浓度的增加而增加,说明增加底物质量浓度能增加底物与酶的接触几率,从而加速酶解反应进程[23]。本实验中酶解物的抗氧化活性未随底物质量浓度和水解度的增加而增加,而是呈现先增后减的趋势,这可能是由于过度酶解使一些活性多肽进一步被水解成小分子质量的短肽,而这些短肽不具有或有较弱的抗氧化活性[24]。因此为了得到抗氧化活性较强的酶解产物,必须严格控制蛋白的酶解程度。由图2可知,底物质量浓度为1.0 mg/mL和3.0 mg/mL时,酶解物的DPPH自由基清除率差异不大,考虑到底物质量浓度1.0 mg/mL时酶解物的水解度过低,且反应体系所需溶剂体积过大,故选择3.0 mg/mL为适宜底物质量浓度。

2.1.3 酶解温度对酶解物水解度及抗氧化活性的影响

图3 酶解温度对酶解物水解度及抗氧化活性的影响
Fig. 3 Effect of hydrolysis temperature on DH and antioxidant activity of hydrolysates

在酶底比6%、底物质量浓度3.0 mg/mL、pH 2.0、酶解8 h的条件下,由图3可知,当酶解温度小于47 ℃时,水解度逐渐增加,酶解温度超过47 ℃后水解度明显下降。这是因为一方面升高温度可使反应体系内的物质运动加快,从而提高底物与酶的接触几率,加速反应进程;另一方面,过高的温度使维持酶分子结构的次级键断裂,导致酶活性降低,延缓了酶解进程,水解度下降[25]。观察酶解产物的抗氧化活性发现,与其他温度相比,温度为42 ℃和47 ℃时的酶解产物的DPPH自由基清除率相对较低,结合水解度变化曲线分析,造成这一现象的原因是在这两个温度条件下,酶解产物的水解度较大,过度的水解造成抗氧化肽的结构被破坏,酶解产物的抗氧化活性降低。其他温度条件下,酶解物的水解度都在54.94%~56.98%之间,其抗氧化活性也相差不多,说明在一定的水解度下,酶解产物具有合适且稳定的肽段长度和氨基酸比例,从而具有良好的抗氧化活性。酶解温度为37 ℃时,酶解产物的抗氧化活性最大,且胃蛋白酶的最适温度为37 ℃,故选择37 ℃为最适酶解温度。

2.1.4 pH值对酶解物水解度及抗氧化活性的影响

图4 pH值对酶解物水解度及抗氧化活性的影响
Fig. 4 Effect of pH value on DH and antioxidant activity of hydrolysates

在酶底比6%、底物质量浓度3.0 mg/mL、酶解温度37 ℃、酶解8 h的条件下,如图4所示,酶解产物的水解度随pH值的变化呈现不规则波动,而酶解物的抗氧化活性则呈现先增后减的趋势。这是因为反应体系pH值的变化会直接影响酶分子及底物分子的解离状态、酶蛋白活性中心的构象,进而影响酶与底物的结合、酶稳定性及产物转化,最终影响酶解产物的性质[26-27]。从图4可以看出,pH值小于2.0时酶解产物的抗氧化活性较强,pH值大于2.0后酶解产物的抗氧化活性急剧下降,可能是由于胃蛋白酶的最适pH 1.0~2.0,在这一范围内,胃蛋白酶的活性高,酶解效果好。pH 1.5时,酶解产物的DPPH自由基清除率达到最大,所以确定最佳pH值为1.5。

2.2 酶解工艺响应面优化

2.2.1 响应面试验结果

综合单因素试验结果,固定酶底比6.0%、酶解时间8 h,以底物质量浓度、酶解温度、pH值这3 个因素为自变量,DPPH自由基清除率为响应值,根据Box-Behnken试验设计原理进行响应面试验,试验设计方案与结果如表2所示。

表2 响应面试验设计方案与结果
Table 2 Experimental design with response variable for response surface analysis

2.2.2 模型的建立与方差分析

表3 模型回归方程方差分析Table 3 Analysis of variance (ANOVA) of regression equation

注:**. P<0.01,极显著;*. P<0.05,显著。

利用软件Design-Expert V8.0.6进行多元回归拟合,得到回归模型方程:

Y=39.58+7.97A+0.41B+0.70C-1.88AB-6.03AC-0.80BC-0.95A2+4.44B2-8.00C2

回归方程的方差分析结果见表3。回归模型的决定系数(R2)为0.948 3,说明DPPH自由基清除率的实测值与预测值拟合较好;调整决定系数()为0.855 3,表明该模型能解释85.53%响应值变化。该模型的P值小于0.01,表明该回归模型极显著;模型失拟项P值为0.963 5,该模型失拟项不显著,说明方程拟合度高,可用此模型预测底物质量浓度、酶解温度和pH值对DPPH自由基清除活性的影响。模型中一次项A和二次项C2影响极显著,交互项AC和二次项B2影响显著,可判断出各因素对响应值的影响是一个复杂的过程,并非简单的线性关系。通过方差分析表中各因素的F值可评价各因素对试验指标的影响,F值越大,影响越显著。由表3可知,各因素对微拟球藻蛋白抗氧化活性的影响顺序为底物质量浓度>pH值>酶解温度。

2.2.3 响应面分析

分别固定各因素中的1 个因素在0水平,得其余2 个因素的交互作用对抗氧化活性影响的三维响应面图和等高线图,可以直观地反映各因素的交互作用对酶解产物抗氧化活性的影响[28],如图5所示。等高线是响应面中水平方向的投影,等高线的形状可反映出交互作用是否显著,椭圆等高线表示两因素交互作用显著,圆形等高线表示交互作用不显著[29]。图5a、b等高线表现为椭圆形,说明底物质量浓度和酶解温度、底物质量浓度和pH值的两因素交互作用明显。如果一个响应面坡度相对平缓,表明处理条件的变化对响应值的影响不大,相反,如果一个响应面坡度非常陡峭,表明响应值对于处理条件的改变非常敏感[30]。图5a、b显示,沿A轴方向的响应面的坡度明显比较陡峭,说明底物质量浓度的变化对DPPH自由基清除率的影响比另外两个因素对其的影响大。图5c显示,B轴方向的响应面坡度比C轴更为平缓,说明pH值的变化对响应值的影响比温度对响应值的影响大。该结论与方差分析结果一致:各因素对微拟球藻蛋白抗氧化活性的影响顺序为底物质量浓度>pH值>酶解温度。

图5 双因素交互影响DPPH自由基清除活性的响应面及等高线图
Fig. 5 Response surface and contour plots showing the interactive effects of variables on DPPH radical scavenging activity

2.2.4 最佳酶解条件的确定及验证

分析得到最佳酶解条件为底物质量浓度5.0 mg/mL、酶解温度32 ℃、pH 1.36,在此酶解条件下,DPPH自由基清除率的预测值为53.16%。按照该工艺条件进行3 次重复实验,测得最佳酶解条件下酶解产物的DPPH自由基清除率为(51.85±1.20)%,与预测值接近,其相对误差为2.5%,说明通过响应面法优化得到的回归模型方程及最佳条件可靠。

3 结 论

本研究在单因素试验的基础上,利用响应面法建立酶解法制备微拟球藻抗氧化肽工艺的二次多项回归方程,通过方差分析,该模型显著,所得回归方程拟合度高。最终确定最佳酶解条件为:底物质量浓度5.0 mg/mL、酶解温度32 ℃、pH 1.36、酶底比6%。在此酶解条件下DPPH自由基清除率达51.85%,与预测值接近,说明通过响应面法建立的回归模型方程准确可靠,这为进一步分离纯化微拟球藻抗氧化肽提供了参考。

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Optimization of Enzymatic Preparation of Antioxidant Peptides from Protein Hydrolysate of the Marine Microalgae Nannochloropsis by Response Surface Methodology

LÜ Xiaojing1, CAO Dequn1,2, XU Nianjun1,2,*
(1. Key Laboratory of Marine Biotechnology of Zhejiang Province, School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211,China; 2. Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology of Ministry of Education, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

Abstract:Protein from the marine microalga Nannochloropsis was extracted and hydrolyzed with pepsin to prepare antioxidant peptides. The eあects of enzyme-to-substrate ratio, substrate concentration, hydrolysis temperature and pH on the degree of hydrolysis (DH) and 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity of hydrolysates were investigated and the process conditions were optimized using one-factor-at-a-time (OFAT) method and response surface methodology (RSM). The optimal hydrolysis conditions were determined as follows: substrate concentration, 5.0 mg/mL;temperature, 32 ℃; pH, 1.36; and enzyme-to-substrate ratio, 6%. The hydrolysate prepared under these conditions could scavenge 51.85% of DPPH free radical.

Keywords:Nannochloropsis sp.; antioxidant peptides; DPPH free radical scavenging activity; degree of hydrolysis;response surface methodology

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201806029

中图分类号:TS201.1

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2018)06-0183-06引文格式:

吕小京, 操德群, 徐年军. 响应面试验优化酶解法制备海洋微藻微拟球藻抗氧化肽工艺[J]. 食品科学, 2018, 39(6):183-188.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201806029. http://www.spkx.net.cn

LÜ Xiaojing, CAO Dequn, XU Nianjun. Optimization of enzymatic preparation of antioxidant peptides from protein hydrolysate of the marine microalgae Nannochloropsis by response surface methodology[J]. Food Science, 2018, 39(6):183-188. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201806029. http://www.spkx.net.cn

收稿日期:2017-04-16

基金项目:宁波市科技局科技富民计划项目(2016C10034);浙江省教育厅科研项目(Y201432453)

第一作者简介:吕小京(1996—),女,本科生,研究方向为海洋藻类活性肽。E-mail:lvxiaojing96@126.com

*通信作者简介:徐年军(1973—),男,研究员,博士,研究方向为海洋生物活性物质。E-mail:xunianjun@nbu.edu.cn