铁皮石斛（Dendrobium oきcinale）是兰科石斛属类植物，全球共有约1 500 种，广泛分布在亚洲、欧洲、澳洲等地区[1]。在我国，其主要分布在广西、福建、安徽、四川、浙江、云南和贵州等西南和华南地区[2]。石斛是非常受大众喜爱的传统中药材之一[3]，在《神农本草经》中早有记载，被列为上品[4]，具有美容养胃、滋阴清热、提高人体免疫力、抗氧化和延缓衰老等功效，用于治疗不明发热、口干舌燥、目暗不明、阴虚火旺、阴伤津亏、胃阴不足、食少干呕、病后虚热不退、筋骨无力等病症[5-9]，药用历史悠久。
药理学研究表明，多糖在铁皮石斛的活性成分中含量最高，是其主要活性物质，具有多种药理活性[10-14]。近年来，铁皮石斛多糖的研究越来越深入。有研究表明多糖活性与多糖的单糖组成具有重要的关系，《药典》[15]对铁皮石斛多糖中甘露糖和葡萄糖的物质的量比例作出了相关规定，同时，有研究表明，多糖中的甘露糖与葡萄糖的比例越高，其抗癌活性越好，因为在人体的巨噬细胞中有对这两种糖有识别作用的多糖受体[16]。杨虹等[17]研究表明铁皮石斛多糖中主要含有葡萄糖、半乳糖、木糖及少量阿拉伯糖和甘露糖，何铁光等[18]从铁皮石斛原球茎中分离得到的多糖中甘露糖和葡萄糖物质的量比为7.015∶1，Xia Linjing等[19]分离得到2 个多糖D1和D2，主要单糖组成是半乳糖和葡萄糖，含有微量的阿拉伯糖。关于铁皮石斛多糖抗氧化活性的研究，Fan Yijun等[20]的研究表明，铁皮石斛组织培养物具有较强的清除活性氧的能力，尤其是对羟自由基的清除，通过显著提高超氧化物歧化酶水平，降低过氧化脂质作用，最终清除体内自由基。查学强等[21]的研究表明，铁皮石斛茎中多糖对超氧离子自由基和羟自由基有较强的清除能力。
目前市场上流通的铁皮石斛一般种植年限为2～4 a，2010版《药典》中虽然对采收季节做出了具体规定，即每年11月至翌年3月，但是关于种植年限问题却没有统一的规定。实验分析不同种植年限铁皮石斛中多糖的含量、单糖组成和多糖分子质量的变化情况，并且对其抗氧化活性进行分析，旨在为进一步深入探究铁皮石斛多糖的积累规律和药理活性奠定基础，为铁皮石斛的采收和开发利用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1～5 a生铁皮石斛样品由江西龙虎山道地药材自有基地提供，样品经80 ℃烘干，粉碎，过60 目筛备用。
葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖、核糖标准品（纯度≥98%） 北京化学试剂公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美国Sigma公司；总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）测定试剂盒南京建成生物工程研究所；其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
TG16-WS高速离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；TM-1901型双光束紫外-可见光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；RE52CS旋转蒸发仪 上海亚绒生化仪器厂；TYS-100高速多功能粉碎机 浙江省永康市红太阳机电有限公司；BS200S电子天平 北京赛多利斯天平公司；DHG-9240A鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；KQ3200DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；1200高效液相色谱仪 美国安捷伦公司；DZKW-C型恒温水浴锅 北京中科星宇商贸有限公司。
1.3 方法
1.3.1 铁皮石斛多糖的制备及测定
称取0.500 g粉碎过20 目的铁皮石斛样品，置于50 mL离心管中，用5 mL去离子水浸润样品，缓慢加入20 mL无水乙醇，使用涡旋振荡器振摇混匀，置超声提取器中（150 W）提取30 min。提取结束后，于6 000 r/min离心10 min，弃去上清液。不溶物用10 mL 80%乙醇溶液洗涤、离心。用去离子水将不溶物转移入圆底烧瓶，加入50 mL去离子水，于沸水浴中提取2 h。冷却至室温，离心、抽滤后取上清液，按体积比1∶4的比例加入无水乙醇，4 ℃保存过夜，于6 000 r/min离心10 min，取沉淀烘干即为铁皮石斛多糖样品。
标准曲线绘制方法：准确称取105 ℃干燥至质量恒定的葡萄糖1.000 g，用蒸馏水定容至100 mL，取出1 mL该溶液定容至100 mL，配成0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液。准确吸取标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分别置于试管中，各加蒸馏水使体积为2.0 mL。再各加入6%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0 mL，静置10 min后，摇匀，待反应液完全冷却后，于波长490 nm条件下测定其吸光度，以蒸馏水为空白实验[22]。以葡萄糖含量（x）为横坐标、吸光度（y）为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。取一定量多糖样品加蒸馏水复溶，测定样品多糖的吸光度，按照标准曲线计算多糖含量。
1.3.2 多糖分子质量的测定
采用凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）法测定多糖分子质量。将样品及系列标准多糖（不同分子质量的葡聚糖180 Da、9 kDa、30 kDa、300 kDa、2 000 kDa）分别流经Agilent PL aquageL-OH MIXED-M色谱柱，流动相为0.1 mol/L硝酸钠溶液，流速1.000 mL/min，示差折光检测器[23]。以保留时间（x）为横坐标，标准品的相对分子质量对数（y）为纵坐标绘制标准曲线，根据标准曲线及Agilent GPC软件计算多糖分子质量。
1.3.3 单糖组成分析
取铁皮石斛多糖样品10 mg置于5 mL消解管中，加2 mol/L三氟乙酸溶液2 mL，拧紧管口，105 ℃水解3 h，烘干溶液中的三氟乙酸，用少量无水甲醇洗涤使残留的三氟乙酸挥发。
加入3 mL蒸馏水复溶，取水解液1 mL置于10 mL离心管，依次加入0.3 mol/L的氢氧化钠溶液600 μL，0.5 mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）甲醇溶液600 μL，涡旋混匀，70 ℃水浴反应2 h，冷却至室温。加入0.3 mol/L的HCl溶液600 μL中和反应体系，并加入1 mL的氯仿溶液萃取，弃去下层有机相，重复操作5 次，去除体系中多余的PMP，取上层水相过0.22 μm的滤膜，进行液相色谱分析。以标准单糖的糖醇全乙酰化衍生物（制备方法同多糖样品，但无需进行三氟乙酸水解）作对照[24-25]。
色谱条件：1200高效液相色谱仪，色谱柱Agilent XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），G1314B可变波长检测器，检测波长250 nm，柱温30 ℃；流速1 mL/min；流动相为乙腈-20 mmol/L磷酸缓冲溶液（pH 6.7）体积比18∶82；进样量20 μL。
1.3.4 抗氧化能力分析
1.3.4.1 Fe3+还原力的测定
取铁皮石斛多糖样品复溶，进行抗氧化能力的分析。设置多糖质量浓度梯度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL。取不同质量浓度的多糖提取液200 μL，加入0.2 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.6）500 μL，加入1%铁氰化钾溶液500 μL，混合后50 ℃放置20 min，流水冷却，加入10%三氯乙酸溶液500 μL混合，4 000 r/min离心10 min后，取上清液600 μL，依次加入蒸馏水600 μL和0.1%三氯化铁溶液120 μL，混匀，静置10 min，以蒸馏水作为样品对照，于700 nm波长处测定吸光度[26]。Fe3+还原力按公式（1）计算：
式中：A1为样品溶液吸光度；A0为对照组加蒸馏水样液的吸光度。
1.3.4.2 DPPH自由基清除能力的测定
取不同质量浓度的多糖提取液500 μL与等体积的0.2 mg/mL的DPPH-无水乙醇溶液均匀混合，暗处理30 min后，以蒸馏水为参比，测定其517 nm波长处吸光度[27]。DPPH自由基清除率按公式（2）进行计算：
式中：A0为500 μL蒸馏水代替多糖提取液与500 μL DPPH反应后的吸光度；A1为500 μL DPPH+500 μL多糖提取液反应后的吸光度；A2为500 μL多糖提取液+500 μL无水乙醇反应后的吸光度。
1.3.4.3 羟自由基清除率的测定
在离心管中依次加入2 mg/mL硫酸亚铁溶液250 μL，1.5 mg/mL水杨酸-乙醇溶液250 μL，加入不同质量浓度的多糖提取液250 μL、1%的过氧化氢250 μL，混和振荡，37 ℃保温1 h，于526 nm波长处测定其吸光度[28]。羟自由基清除率按公式（3）进行计算：
式中：C1为样品组吸光度；C2为无水乙醇溶液代替水杨酸-乙醇溶液的吸光度；C0为蒸馏水代替样品溶液的吸光度。
1.3.4.4 T-AOC的测定
使用T-AOC试剂盒，按照T-AOC测定试剂盒中的操作方法测定不同质量浓度多糖提取液的T-AOC。
2 结果与分析
2.1 不同种植年限铁皮石斛多糖含量
图1 不同种植年限铁皮石斛多糖含量
Fig. 1 Polysaccharide contents of different aged Dendrobium oきcinale
如图1所示，不同种植年限铁皮石斛中多糖含量由高到低依次为5 a生＞3 a生＞4 a生＞2 a生＞1 a生，5 a生多糖含量为238.60 mg/g，3 a生为232.74 mg/g。通过统计分析可得，1 a生铁皮石斛中的多糖含量与其他4 种的多糖含量均存在显著性差异，3 a生样品中多糖含量与5 a生样品之间不存在显著性差异。诸燕等[29]研究结果表明，不同生长年限铁皮石斛中的多糖含量存在差异，2 a生和3 a生多糖的含量较高，但是对于3 a生后的铁皮石斛多糖含量的变化未做出相关研究。
2.2 不同种植年限铁皮石斛多糖分子质量
表1 不同种植年限铁皮石斛多糖分子质量
Table 1 Molecular weights of polysaccharides from different aged Dendrobium oきcinale
如表1所示，不同种植年限铁皮石斛中的多糖为非均一成分，2 种多糖组分在含量、分子质量上均存在差异，多糖组分1在铁皮石斛多糖中含量最高，分子质量也最大。其中4 a生铁皮石斛多糖组分的分子质量最大，主要多糖组分分子质量为1 383 kDa；其次是3 a生铁皮石斛多糖，主要多糖组分分子质量为1 046 kDa。
2.3 不同种植年限铁皮石斛多糖单糖组成
图2 不同种植年限铁皮石斛多糖单糖组成液相色谱图
Fig. 2 Monosaccharide composition of polysaccharides from different aged Dendrobium oきcinale
由图2可知，1 a生、2 a生、3 a生、4 a生、5 a生铁皮石斛多糖主要由甘露糖和葡萄糖组成，其物质的量比分别为4.3∶1、2.3∶1、3.1∶1、2.1∶1、1.8∶1。周桂芬等[30]研究表明，随着生长年限增加，甘露糖含量降低。《中国药典》规定铁皮石斛多糖色谱图中，甘露糖和葡萄糖的峰面积比应为2.4∶1～8.0∶1，1 a生和3 a生多糖符合此标准规定值。
2.4 不同种植年限铁皮石斛多糖体外抗氧化活性结果
图3 不同种植年限铁皮石斛多糖体外抗氧化活性
Fig. 3 Antioxidant activities in vitro of polysaccharides from different aged Dendrobium oきcinale
如图3所示，不同种植年限的铁皮石斛粗多糖均表现出较强的抗氧化活性，且随着多糖质量浓度的增大也逐渐增强。但不同种植年限铁皮石斛多糖在不同的抗氧化体系中，其抗氧化活性存在差异。当多糖质量浓度为2 mg/mL及以上时，3 a生铁皮石斛多糖对Fe3+还原能力和T-AOC最高，分别为0.23和1.18 U/mL（多糖质量浓度为3 mg/mL），多糖质量浓度高于1 mg/mL时，对羟自由基的清除能力最强，清除率为69.3%（多糖质量浓度为3 mg/mL）。就多糖对DPPH自由基的清除作用而言，5 a生多糖效果最好，清除率最高为50.63%（多糖质量浓度为3 mg/mL），3 a生多糖次之，为44.3%。
3 结 论
实验研究表明，不同种植年限铁皮石斛多糖的含量、分子质量、单糖组成以及抗氧化能力方面均存在差异。1～5 a生多糖含量依次为5 a生＞3 a生＞4 a生＞2 a生＞1 a生，含量最高的为5 a生铁皮石斛为238.60 mg/g，3 a生为232.74 mg/g。3 a生和4 a生多糖的分子质量最高，分别为1 046 kDa和1 383 kDa。1 a生多糖的甘露糖和葡萄糖的物质的量比最高，为4.3∶1，其次是3 a生多糖，为3.1∶1。在抗氧化能力方面，各种多糖均呈现出明显的量效正相关关系，总体上来看，3 a生多糖对Fe3+的还原、羟自由基的清除、T-AOC较强。综合各方面可得，铁皮石斛的最佳种植年限是3 a，为进一步探究铁皮石斛多糖的特性和积累规律提供了理论基础。
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