黄鳝（Monopterus albus），俗称鳝鱼、罗鱼、长鱼、无鳞公子，是典型的高蛋白、低脂肪经济鱼类，具有味道鲜美、营养价值高等优点，深受消费者喜爱[1]。据统计，2015年全国总产量达36.8万 t，较2014年增长了2.67%[2-3]。目前很多超市都有冷藏调制鳝鱼肉制品流通售卖，很多餐饮店也直接买入鳝鱼肉冷藏待加工。众所周知，鱼肉宰杀后，在微生物和内源酶的作用下易发生劣变，导致其食用价值降低[4]。因此，研究鳝鱼肉在货架期贮藏过程中的品质变化规律具有重要意义。
蛋白质是鱼类肌肉组织的重要组成部分，决定鱼类肌肉质量的好坏，其在贮藏过程中的降解、聚集或变性都会引起鱼肉品质的改变[5]。任丽娜[6]通过研究白鲢鱼肉在-18 ℃和-50 ℃下冻藏过程中的品质、肌原纤维蛋白理化特性和结构的变化，发现了蛋白变性是引起鱼肉营养缺失、功能性质下降以及结构改变等的重要原因。Lu Han等[7]通过测定4 ℃和-3 ℃条件下的蛋白质氧化参数、持水性（water-holding capacity，WHC）和质构特性等，发现蛋白质氧化是导致鳙鱼WHC和质构变化的主要因素。Masniyom[8]通过加入延缓微生物生长及酶活性的物质，发现可明显抑制鱼肉蛋白质降解等现象，从而延长鱼类产品的保质期。
近年来，对鳝鱼的研究主要集中在生物胺和保鲜方面。尤娟等[9]发现贮藏温度和时间对鳝鱼肉鲜度和生物胺含量成正相关，为鳝鱼肉的鲜度控制、微生物生长及货架期的确定提供了一定的理论依据。吕凯波[10]以生鲜鳝片为原料，研究了贮藏温度和气调包装方式对贮藏过程中鳝片品质变化和菌相生长的影响，结果显示温度越高，鳝鱼货架期越短，腐败菌含量越高，且包装方式对冰温贮藏鳝片的品质和菌相有明显影响。但目前关于鳝鱼肉货架期冷藏过程中理化指标以及其中蛋白质变化方面研究鲜见报道。近年来，越来越多的超市出现了鳝鱼冷藏调制食品，该类产品都是建议尽快食用，未明确标注保质期。其原因之一在于鳝鱼货架期冷藏过程中理化指标及其蛋白质变化方面研究数据缺失。
本实验以新鲜鳝鱼为原料，研究货架期内鳝鱼肉理化指标和蛋白质变化规律，旨在从蛋白质变化角度探讨鳝鱼肉品质变化机理，研究其蛋白质结构特征的变化规律，为冷藏调制鳝鱼制品的贮存、保质及其他新鲜鳝鱼产品研发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鳝鱼肉，采购于北碚区天生菜市场，体长25～35 cm，体质量60～70 g。
盐酸、氯化钠、硫酸、硫化钠、氢氧化钠、正丙醇、异丙醇、石油醚（30～60 ℃）、硫酸铜、硫酸钾、硼酸、无水乙醇、高氯酸、溴化钾、磷酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾氯仿、尿素 成都市科龙化工试剂厂；羟脯氨酸 上海楷洋生物技术有限公司；ATP等标准品 美国Sigma公司；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA） 天津市鑫源化工有限公司；2-硫代巴比妥酸（2-thiobarbituric acid，TBA） 上海科丰实业有限公司；过硫酸铵（ammonium persulfate，APS）、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、Tris、β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol，β-ME）、四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）、考马斯亮蓝R-250 美国Bio Basic公司；30 g/100 mL的丙烯酰胺工作液 北京索莱宝科技有限公司；标准蛋白（分子质量10～200 kDa） 赛默飞世尔科技公司。其中Tris、ATP等标准品、考马斯亮蓝R-250、30%丙烯酰胺为优级纯，溴化钾为光谱纯，其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
JA3003B电子天平 上海精天电子仪器有限公司；QL 901 Vortex旋涡混合器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；UV-2450紫外分光光度计、LC-20A高效液相色谱仪 日本岛津公司；PHS-25型数显酸度计 杭州雷磁分析仪器厂；4-6型马弗炉、8002型温控水浴锅北京永光明医疗仪器厂；DGG-9140A电热恒温鼓风干燥箱 上海齐欣科学仪器有限公司；UltraScan PRO测色仪 美国HunterLab公司；SHZ-B水浴恒温振荡器 上海将任实验设备有限公司；5810型台式高速离心机 德国Eppendorf公司；Spectrun100傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）仪美国Perkin Elmer公司；Power PacTM基础电泳仪美国Bio-Rad公司；G:BOX EF型凝胶成像系统 英国Syngene公司。
1.3 方法
1.3.1 鱼肉处理
鲜活鳝鱼去头、骨和内脏，纯水洗净后，置于（4±1）℃条件下保鲜贮藏。
1.3.2 TVB-N含量的测定
挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量参照SC/T 3032—2007《水产品中挥发性盐基氮的测定》半微量定氮法测定[11]。
1.3.3 K值的测定
K值参照SC/T 3048—2014《鱼类鲜度指标K值的测定高效液相色谱法》测定[12]。
1.3.4 TBARS值的测定
硫代巴比妥酸反应产物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值参照Vyncke[13]的方法测定。取10 g鳝鱼肉于烧杯中，加入25 mL水，匀浆，再加入25 mL、体积分数7.5% TCA溶液，充分搅拌均匀，静置30 min后过滤。准确移取上述滤液5 mL于试管中，加入5 mL 0.02 mol/L TBA溶液，于80 ℃水浴加热40 min，冷却至室温，加入5 mL氯仿，摇匀，静置，分层，分别在532 nm和600 nm波长处测定吸光度。结果以丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量计，TBARS值的单位为mg MDA/kg。
1.3.5 pH值的测定
参照 GB/T 9695.5—2008《肉与肉制品 pH测定》规定的方法[14]。准确称取10.0 g鱼肉置于烧杯，加入50 mL预先煮沸冷却的蒸馏水，匀浆，静置30 min，用酸度计直接测定pH值。
1.3.6 持水率的测定
参照刘大松等[15]14的方法进行测定。称取一定质量鱼肉于离心管中，记录离心管和鱼肉的质量（m1/g），在离心管中加入几片滤纸，4 ℃、210×g离心15 min。取出滤纸，记录离心管和鱼肉的质量（m2/g）。持水率按式（1）进行计算。
式中：w为鳝鱼的水分质量分数/%；m为鳝鱼的质量/g。
1.3.7 色泽的测定
取出鳝鱼，剔出骨刺，取其脊背处肌肉，切成约30 mm长度，在空气中放置20 min后，采用LAB色差仪测定鳝鱼肉颜色变化，其中，L*表示亮度，a*表示红（+）绿（-），b*表示黄（+）蓝（-）。
1.3.8 TCA-可溶性氮含量的测定
参照Benjakul等[16]的方法并略作修改。3.0 g鱼肉中加入27 mL、体积分数5% TCA溶液，均质2 min，匀浆液在冰浴中放置1 h后，5 000×g、4 ℃离心5 min，取上清液。采用Lowry法测定TCA-可溶性氮含量。
1.3.9 电泳分析
参照杨晖等[17]的方法并略作修改。称50 mg鱼肉溶解于5 mL蛋白变性剂中，振荡均匀，于（4±1）℃条件下贮存。离心5 min取上清液，按照4∶1（V/V）与上样缓冲液进行混合，沸水浴5 min，冷却后上样，上样量为15 μL（Marker上样量为10 μL）。其中分离胶质量分数为10%，浓缩胶质量分数为5%。15 mA恒流电泳，待样品跑到分离胶后，电流调至25 mA，电泳时间约30 min。电泳结束后用考马斯亮蓝R-250进行染色，2 h后用脱色液于30 ℃条件下振荡脱色，每30 min换一次脱色液，直至背景蓝色脱净后用凝胶成像系统拍摄电泳图谱，再用Gene Tools数据处理软件进行分析。
1.3.10 化学作用力测定
参照Gómez-Guillén等[18]方法。分别取2.0 g鱼肉分别与10 mL A、B、C、D、E 5 种溶液混合。A为0.05 mol/L NaCl，B为0.6 mol/L NaCl，C为0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素，D为0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素，E为0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素+0.5 mol/L β-巯基乙醇。混合后均质，于4 ℃静置1 h，然后10 000 r/min离心15 min，用Lowry法测定上清液中蛋白质的含量。离子键的贡献以溶解于A与B溶液中蛋白质含量之差来表示；氢键的贡献以溶解于B与C溶液中蛋白质含量之差来表示；疏水性相互作用的贡献以溶解于C与D溶液中蛋白质含量之差来表示；二硫键的贡献以溶解于D与E溶液中蛋白质含量之差来表示。
1.3.11 红外光谱分析
将绞碎的鱼肉真空冷冻干燥备用。样品与KBr（1∶100，m/m）混合后研磨，45 ℃下烘干后压片，用FTIR进行检测。室内温度为25 ℃，扫描范围400～4 000 cm-1；扫描次数64 次；分辨率4 cm-1。
1.4 数据分析
数据分析处理采用Microsoft Excel 2013和Origin8.6软件。每次实验设置3 个平行，数据以 ±s表示。
2 结果与分析
2.1 鳝鱼在冷藏过程中的生化性质变化
TVB-N含量可以反映蛋白质的分解程度，常作为评价鱼肉初期腐败的重要指标。由图1可知，TVB-N含量随贮藏时间延长而增加；说明在微生物和酶的作用下，蛋白质分解产生胺类及碱性含氮物，使得TVB-N含量增加[19]。在第6天，鳝鱼的TVB-N含量增加幅度明显升高，已经超过我国淡水鱼卫生标准GB 2733—2015《食品安全国家标准 鲜、冻动物性水产品》（TVB-N含量≤20 mg/100 g）[20]。周娇娇等[21]实验结果表明，鳝鱼在冷藏后期TVB-N含量迅速增加，新鲜度显著下降，与本实验结果基本一致。
图1 冷藏过程中鳝鱼肉TVB-N含量、TBARS值、K值的变化
Fig. 1 Changes in TVB-N content, TBARS and K value of Monopterus albus during cold storage
K值能反映鱼体死后降解反应进行的程度，适合鱼类早期鲜度的评定。由图1可知，随着贮藏时间的延长，K值不断增加，在第5天，K值大于40%。da Costa Silva Andrade等[22]研究发现鱼肉的K值小于20%时适合生吃，K值大于40%即已初期腐败。因此，从K值的角度分析，鳝鱼的货架期为4 d。
TBARS值可以反映鱼肉的脂质氧化情况，是评价肉类和水产品品质变化的良好指标。如图1所示，随着贮藏时间的延长，TBARS值逐渐增加；表明脂肪氧化产物MDA增多，氧化程度增加。第6天，TBARS值大于1.0 mg MDA/kg，超过Yu Dawei等[23]规定的可接受限度（TBARS值≤1.0 mg MDA/kg）。
综合各项评价指标，确定鳝鱼在冷藏条件（4 ℃）下的货架期为4 d。
2.2 鳝鱼在冷藏过程中的物理性质变化
2.2.1 鳝鱼在冷藏过程中的pH值变化
图2 冷藏过程中鳝鱼肉pH值的变化
Fig. 2 Change in pH of Monopterus albus during cold storage
由图2可知，冷藏过程中，随着冷藏时间的延长，鱼肉的pH值呈先降低后上升趋势。冷藏初期，糖原和ATP等物质降解，使得pH值下降；随着贮藏时间的延长，鱼体内蛋白质等含氮物质不断分解，生成氨基酸及一些含氮的小分子等碱性物质，导致pH值上升，符合动物死后肉类僵直与解僵规律[15]17-18[24]。
2.2.2 鳝鱼在冷藏过程中的持水率变化
图3 冷藏过程中鳝鱼肉持水率的变化
Fig. 3 Change in water-holding capacity of Monopterus albus during cold storage
由图3可知，随着贮藏时间的延长，鳝鱼的持水率呈现下降趋势。鱼肉持水力的变化与其质构品质密切相关；持水力降低，致使肉的嫩度降低，肉质变硬，表明鱼肉质构品质有所下降。此外，水分渗出还会导致可溶性成分随之损失，造成肌肉营养品质下降[25]。贮藏期间鳝鱼持水力下降，可能和贮藏过程中蛋白质降解有关。
2.2.3 鳝鱼在冷藏过程中的色泽变化
图4 冷藏过程中鳝鱼肉色泽的变化
Fig. 4 Change in color of Monopterus albus during cold storage
由图4可知，随着贮藏时间的延长，鱼肉的L*值和a*值整体呈下降趋势，b*值则呈现先下降后上升的趋势。新鲜鳝鱼肉色泽鲜亮，L*值下降说明随着贮藏时间的延长，鳝鱼肉的光泽度降低；主要是由于肌肉组织间自由水含量降低，导致鱼肉表面光线反射率下降，颜色逐渐变暗。a*值下降表明鱼肉红度值降低，这可能是由于脂质氧化产生大量羟自由基、H2O2及一些氧化产物（如MDA等），这些物质会促使肌红蛋白中的Fe2+氧化，加快肉色的褐变[26]。b*值的变化也与肌红蛋白的含量有关。Lan Yang等[27]研究证明，TBARS的增加与L*和a*值的降低表明脂质的氧化会加速肌红蛋白的氧化，与本实验结果基本一致。
2.3 鳝鱼在冷藏过程中的蛋白质降解
由图5A可知，在冷藏过程中，TCA-可溶性氮含量随贮藏时间延长而增加；说明鱼肉蛋白质在内源酶及微生物作用下发生了降解。由图5B可知，鳝鱼肉的蛋白条带主要包括肌球蛋白的重链和肌动蛋白。鳝鱼肉蛋白图谱中，肌球蛋白的重链和肌动蛋白的条带逐渐变淡，说明肌球蛋白和肌动蛋白发生了降解，此外，胶原蛋白的条带也逐渐变淡，说明胶原蛋白也可能发生了部分降解。在电泳图中小分子条带未出现明显变化，可能是因为蛋白降解组分的分子质量较低未被电泳检测出[28]。
图5 冷藏过程中鳝鱼肉TCA-可溶性氮含量（A）和全蛋白的SDS-PAGE图（B）
Fig. 5 Change in TCA-soluble nitrogen content (A) and SDS-PAGE analysis of total proteins (B) in Monopterus albus during cold storage
2.4 鳝鱼在冷藏过程中的化学作用力变化
图6 冷藏过程中鳝鱼肉化学作用力的变化
Fig. 6 Change in chemical forces of proteins in Monopterus albus during cold storage
离子键、氢键、疏水相互作用和二硫键是维持蛋白质三维网络结构的主要作用力。由图6可知，货架期内（4 d）随着贮藏时间的延长，离子键和氢键总体呈下降趋势，二硫键和疏水作用呈现逐渐增加趋势，这些价键的变化可以反映出蛋白质原有的结构发生变化。冷藏期间，埋藏于分子内部的巯基氧化成二硫键，二硫键的形成引起肌球蛋白重链的聚合，进而降低肌原纤维蛋白的盐溶性，这可能导致离子键被破坏，与Benjakul等[29]的实验结果一致。而前期蛋白质的去折叠及疏水性脂肪族和芳香族氨基酸的暴露，造成疏水相互作用增加，在贮藏第5天，离子键和二硫键保持原有变化趋势，氢键有所增加，而疏水作用有所下降。这可能是因为后期鳝鱼肉在内源酶及微生物作用下，蛋白降解达到一定程度，肽段的构象发生变化，导致蛋白之间氢键和疏水作用模式发生改变[30-31]。总体而言，随着价键的破坏，蛋白原有的构象发生改变，结构变松散，蛋白质无序程度增加。
2.5 冷藏过程中鳝鱼肉的红外光谱分析
图7 冷藏过程中鳝鱼肉的FTIR图谱
Fig. 7 FTIR spectra of Monopterus albus during cold storage
表1 冷藏过程中鳝鱼肉红外光谱特征峰吸收波长
Table 1 Absorption wavelength of infrared (IR) characteristic peaks of Monopterus albus during cold storage
酰胺A带（3 400～3 440 cm-1）是N-H或O-H伸缩振动的吸收峰，当含有N—H基团的分子肽段参与氢键形成时，N—H伸缩振动向低波数移动[32]；酰胺I带（1600～1700 cm-1）表示C＝O伸缩振动，其振动频率主要取决于C＝O和N-H之间的氢键性质[33]，通过二者可以综合判断肽链间氢键的变化情况。由表1可知，1～4 d，酰胺I带的吸收峰向高波数移动，酰胺A带从第2天开始吸收峰也向高波数移动，总体说明前4 d冷藏过程中鱼肉蛋白质间的氢键遭到破坏。4～5 d，酰胺A带和酰胺I带的吸收峰向低波数移动，说明有C＝O基团或N-H基团的分子肽段参与氢键形成。与前面氢键变化趋势一致。
表2 冷藏过程中鳝鱼肉的蛋白二级结构含量
Table 2 Changes in secondary structure contents of proteins in Monopterus albus during cold storage
对酰胺I带的计算结果进行去卷积和高斯拟合，得到各二级结构含量变化情况。由表2可知，蛋白二级结构含量发生变化，结合价键分析表明离子键和氢键可能是贮藏初期维系鳝鱼蛋白二级结构的主要作用力，二者的破坏导致蛋白构象改变。
冷藏初期主要是β-组分间的转化，α-螺旋和无规卷曲总体变化趋势不明显，冷藏后期，β-折叠和β-转角转化为无规卷曲和α-螺旋。1～4 d，维持蛋白空间结构的氢键断裂，蛋白质伸展，同时疏水残基暴露，疏水相互作用增加，巯基在冷藏过程中被氧化成二硫键，使得多肽特有的折叠结构发生改变，引起β-组分间的转化。4～5 d，蛋白质变性导致网络结构破坏，结构变松散，蛋白质无序程度增加，导致β-折叠和β-转角转化为α-螺旋和无规卷曲。同时蛋白质分子被酶解生成小分子物质，α-螺旋含量增加的原因可能是降解产生的小分子组分相互作用所致。
3 结 论
首先明确了4 ℃条件下鳝鱼货架期是4 d，且随着冷藏时间的延长，鳝鱼的品质逐渐劣化。
通过TCA-可溶性氮含量和SDS-PAGE分析表明，货架期内随着冷藏时间的延长，肌球蛋白和肌动蛋白逐渐发生降解。
价键分析表明冷藏货架期内离子键和氢键呈减少的趋势，二硫键和疏水作用呈现逐渐增加的趋势。FTIR分析结果表明冷藏货架期内，酰胺A带吸收峰总体向高波数移动，这与氢键变化趋势一致。酰胺I带曲线拟合结果表明，冷藏前期主要是β-组分间的相互转化，后期则由β-组分向α-螺旋和无规卷曲转化，蛋白质无序程度增加，蛋白质构象发生改变。综上所述，货架期冷藏过程中氢键和离子键可能是贮藏初期维系鳝鱼蛋白二级结构的主要作用力，二者的改变会导致蛋白空间结构发生相应变化，使得鳝鱼肉理化性质的变化，最终导致鳝鱼肉品质持续下降。
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