抗冻剂对鱼肉蛋白质冷冻变性的保护作用

鱼肉是一种营养丰富的食品原料，其高蛋白、低胆固醇及低脂肪等特质日益受到消费者的喜爱，近年来，中国渔业持续发展，鱼类产量不断升高。鱼的收获期相对集中，若鱼肉未进行合适的贮藏与及时的加工处理，蛋白质尤其是肌原纤维蛋白极易在微生物和酶的综合作用下发生降解，因而在鱼类的整个贮藏、加工、运输及销售过程中通常采用低温贮藏，其中，冻藏（-18～-23 ℃）几乎可以完全抑制酶活力及微生物生长[1]，从而使鱼肉得以长期保藏。但是，蛋白质尤其是肌原纤维蛋白在冻藏过程中极易发生冷冻变性[2]。鱼类肌肉蛋白质的稳定性与鱼肉的加工适宜性密切相关[3]，蛋白质的冷冻变性导致鱼肉品质的劣变及功能特性的减弱，例如汁液流失、肉质变硬及风味物质损失等[2]，并影响其后续加工性能[4]，无法达到消费者对营养价值、风味及口感的需求，因而商品价值大幅下降。为了抑制冻藏过程中鱼肉蛋白的冷冻变性，添加抗冻剂通常是最有效的方式[5]。

抗冻剂又称阻冻剂，是一类加入到其他液体（一般为水）中以降低其冰点、提高其抗冻能力的物质，具有溶解冰晶、阻止冰晶长大的作用。广义上说，任何可以与水或其他化学品组成共沸混合体而能有效降低其冰点的物质均有抗冻效果。鉴于鱼肉蛋白质冷冻变性对鱼肉品质的不利影响，蛋白抗冻剂的使用在食品冷冻行业已成为共识，并且非常普遍，目前使用的抗冻剂品种亦较多。因此，研究抗冻剂如低聚糖类、蛋白水解物、酶解物、糖醇和盐类等对冷冻鱼肉的抗冻作用已成为近年来的热点[6]。本文主要阐述了鱼肉蛋白的冷冻变性机理，并针对不同类型抗冻剂对鱼肉蛋白的冷冻保护机理进行论述，为提高鱼肉产品的冻藏品质提供参考依据。

1 蛋白质冷冻变性机理

对鱼肉及其制品而言，冻藏过程中蛋白质的冷冻变性是一个普遍存在的问题。鱼肉蛋白质的冷冻变性是指在冻藏过程中，鱼肉蛋白质因受到物理或化学因素的影响（如水分体积分数、冻藏温度、氧化三甲胺还原及脂肪氧化等[7]），丧失分子内部原有的高度规律性，引起空间结构的变化，导致理化性质和生物学性质的改变，如蛋白质溶解度降低、凝胶强度变弱及Ca2+-三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）酶活性降低[8]，其中，Ca2+-ATP酶活性的变化反映鱼肉肌球蛋白头部S1构型的改变，极有可能使巯基氧化形成二硫键，相互交联，从而导致蛋白质发生凝聚变性[9-10]。蛋白质的冷冻变性严重影响鱼肉及鱼肉制品的风味、口感，导致持水性、柔嫩性、胶凝特性及营养价值的劣变，造成鱼肉品质的剧烈下降[1]。近年来，鱼肉蛋白质冷冻变性机理成为研究热点，然而依旧存在不明之处。目前，在现有探索研究的基础上，已被广泛接纳的鱼肉蛋白质冷冻变性机理理论包括以下3 种学说。

第一，结合水脱离变性。在鱼肉冻藏初期，组织内自由水优先冻结为冰，而结合水与鱼肉组织蛋白保持原有结合状态。随着冻结的进一步深入，除了自由水冻结为冰以外，结合水也发生冻结，与鱼肉蛋白质脱离，蛋白质的疏水键及二硫键等化学键形成并聚集[11]，导致蛋白质分子侧链相互靠拢、聚集，最终蛋白质发生不可逆变性[12-14]。尤其是当采用缓慢冻结进行冻藏预处理时，冰晶体的形成干扰水分子的正常排布，解冻后自由水和结合水均无法回到原始位点，复水能力的减弱引起蛋白质的变性[12]。

第二，水和结合水的相互作用。冻藏过程中冰晶的形成改变蛋白质分子和结合水之间的结合状态，蛋白质分子内部化学键发生断裂，伴随二硫键、疏水相互作用、离子键及氢键等新键的形成，同时，冰晶体相互挤压，导致蛋白质分子空间结构的变化，如疏水基团的形成与暴露改变蛋白质原有的高度水化状态，水化程度降低的蛋白质多肽链展开，从而引起蛋白质的变性[14-15]。汪秋宽等[16]采用电子显微镜和聚丙烯酰胺凝胶电泳观察发现冻藏过程中鲈鱼肌肉纤维出现明显的间隙和裂缝，肌原纤维蛋白空间结构发生变化，说明冻藏过程中冰晶增大导致肌原纤维蛋白的脱水变性。

第三，溶质浓缩变性。冻藏过程中自由水及结合水形成冰晶不断析出，导致组织细胞内尚未冻结的细胞液浓缩，细胞液中有机溶剂及金属盐的浓度升高，引起细胞液离子浓度及pH值的改变，蛋白质大分子胶体失稳凝聚，造成蛋白质的冷冻变性[13-14]。

另外，冰晶对鱼肉组织产生的破坏、鱼肉组织内源蛋白酶对蛋白质的降解、ATP降解、氧化三甲胺还原、脂质氧化及蛋白质氧化等因素在一定程度上均可能诱导鱼肉蛋白质的冷冻变性[14,17]。目前，冻藏过程中脂质氧化及蛋白质氧化所引发的蛋白质变性成为蛋白质冷冻变性的研究热点。

鱼肉在冻藏过程中，冰晶不断升华，组织内不饱和脂肪酸和脂肪大量氧化并分解为酮、醛等有害物质，促使鱼肉蛋白质分子间交联，此外，大量游离脂肪酸的产生大大降低了蛋白质溶解度，同时，蛋白质肽链断裂及脂质-蛋白质相互作用也容易导致蛋白质的冷冻变性[18]。有研究发现脂肪和不饱和脂肪酸含量高的鱼类更易发生蛋白质冷冻变性，这可能与油脂氧化对蛋白质结构和功能的不利影响有关[19]。

鱼肌肉细胞中含有大量蛋白质，在冻藏过程中，蛋白质易受到自由基的攻击而发生氧化，诱导蛋白质的冷冻变性[20]。有研究发现活性氧可以与脂质和蛋白质相互作用，当活性氧与蛋白质结合时，蛋白质氧化变性导致化学特性和功能特性的改变，如羰基的大量形成、巯基的急剧下降、氨基酸侧链基团的修饰、蛋白质的解折叠以及交联聚集等，从而使蛋白质失稳，溶解度及持水力下降，质构特性和感官特性发生改变，严重影响鱼肉的品质[20]。其中，持水力的下降与蛋白质间质空间的收缩密切相关，这源于肌原纤维蛋白氧化导致的肌球蛋白和肌动蛋白的聚集[20-21]。

2 糖、糖醇类及糖类降解物的抗冻保护作用

糖及糖醇类作为抗冻剂在冷冻水产品中的应用已较为广泛，主要包括海藻糖、壳聚糖、壳寡糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、多聚葡萄糖、山梨糖醇及乳糖醇等[22]。其中，壳寡糖可以有效抑制冻藏过程中鳙鱼鱼糜肌动球蛋白和鲈鱼肌原纤维蛋白的冷冻变性，对鱼肉蛋白质起到很好的冷冻保护作用[23-24]。

糖及糖醇类可以与蛋白质反应基团结合，处于饱和状态的蛋白质分子很难发生聚集变性，另一方面，糖类含有大量游离羟基，可与鱼肉组织中水分子结合，促使自由水的转变，更多结合水的存在导致“共晶点”温度的降低，冰晶的形成受阻，蛋白质分子难以相互聚集，从而保持稳定构象[25-26]。葡萄糖、壳寡糖及乳糖等低分子质量糖类通过氢键或离子键与蛋白质分子缔合，代替蛋白质表面的水分子，避免蛋白质氢键连接点的暴露，从而使蛋白质高级结构得以稳定[27]；蔗糖等多糖通过固定水分子[28]、以玻璃态形式包裹蛋白质[29]或促进蛋白质分子中α-螺旋结构的形成[4]，延缓蛋白质的冷冻变性。

近年来，海藻糖作为抗冻剂对鱼肉蛋白质的冷冻保护作用研究更为普遍。张静雅[26]探究了在冻藏过程中添加糖及糖醇类复配物对白鲢鱼蛋白质冷冻变性的影响，发现当4%（质量分数，下同）海藻糖、1%蔗糖、2%山梨糖醇及3%乳糖醇复配作为抗冻剂使用时，相比于商业抗冻剂（4%蔗糖与4%山梨糖醇），其对冻藏过程中白鲢鱼的抗冷冻变性效果更佳。海藻糖的抗冻机理可能与其他糖类相似，即与蛋白质分子氢键的结合[29]、形成玻璃体避免蛋白质分子的聚集变性[30]及与蛋白质周围水分子的优先结合[31]。Sola-Penna[31]及Green[32]等研究认为海藻糖对蛋白质的冷冻保护作用依次高于麦芽糖、蔗糖及葡萄糖，即海藻糖相比其他糖类具有一定的优越性。这种优越性与海藻糖的高玻璃态转变温度（glass transition temperature，Tg）密切相关，而高Tg反映的是较小的自由体积、受限的分子流动性及对相分离和结晶较强的抵抗能力[33]。另外，海藻糖水合体积远超过麦芽糖、蔗糖及葡萄糖等，可优先结合更多的水分子，故而海藻糖抗冻效果优于其他低聚糖[31]。

糖类作为抗冻剂，存在甜度及热量过高的问题，严重影响鱼肉的加工性能，无法满足消费者对口味、口感及营养的追求[8]，而且部分多糖分子质量较大，与水分子的较强亲和力容易导致聚集，从而难以均匀分散，故而需要对其进行降解后用于鱼肉制品[4]。汪兰等[4]研究发现鱼肉肌原纤维蛋白的α-螺旋和β-折叠结构所占比例随冻藏时间的延长而下降，添加酶解魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM）或辐照降解KGM后其α-螺旋和β-折叠所占比例均高于空白组，说明酶解KGM和辐照降解KGM通过稳定α-螺旋和β-折叠结构起到延缓蛋白质聚集变性的作用。这是由于KGM降解产物中极性基团与水分子结合，阻碍水分子形成规律的晶体，水的凝固点下降，从而抑制蛋白质的冷冻变性[34]。Chou等[35]研究了低聚木糖对冻藏猪肉肌原纤维蛋白冷冻变性的影响，结果显示低聚木糖可以明显减少蛋白质疏水基团的暴露，提高肌原纤维蛋白溶解度和凝胶持水力，增强蛋白质冻融稳定性，表现出优于山梨醇和蔗糖等抗冻剂的蛋白质冷冻保护作用。

3 酚类的抗冻保护作用

酚类通过清除活性氧自由基、阻断自由基的链式反应、螯合金属离子及增强抗氧化酶系，抑制脂肪氧化体系，从而阻止蛋白质的折叠，避免蛋白质因构象改变而导致的变性[36-37]。同时，酚类含有大量酚羟基，这些基团与蛋白质分子中羧基或氨基的多点结合作用可以有效阻止微生物的侵染，延缓鱼肉组织蛋白质的降解及变性[37-38]。另外，有研究发现酚类可以与蛋白质络合，从而稳定蛋白质构象，起到一定的冷冻保护作用[39]。

茶多酚是目前作为抗冻剂研究最为广泛的多酚类物质。赵进等[40]研究发现添加茶多酚实验组样品中蛋白质—SH含量远超过空白组，说明茶多酚可以减缓大黄鱼组织蛋白质的氧化变性。在冻藏过程中鱼肉脂质的氧化产生大量的活性次生氧化产物及自由基，如羟自由基及超氧阴离子自由基，极易与氨基酸尤其是侧链上带有—NH—或—NH2基团的氨基酸结合反应，引起蛋白质的氧化变性[37,41]，而且有研究发现脂质氧化产物丙二醛是蛋白质衍生化形成羰基的底物之一，脂质氧化与蛋白氧化相互促进[20]，进而诱导蛋白质的变性。另外，α-生育酚也是良好的酚类抗冻剂，在鱼类蛋白抗冻保护方面应用广泛。Suhur等[42]研究认为氧化脂质与蛋白质的相互作用是蛋白质冷冻变性的影响因素之一，氧化脂质的自由基转移至氨基酸及蛋白质，导致蛋白质不溶性聚集体的形成和蛋白质的变性，同时，引起蛋白质功能特性的改变，包括氨基酸丢失、蛋白质交联及DNA损伤等，电子自旋共振结果显示，在脂质-蛋白质作用前添加α-生育酚可以明显抑制自由基的产生，从而减缓大西洋鲭鱼蛋白质的冷冻变性。

4 蛋白质水解物的抗冻保护作用

蛋白质在水解过程中，产生大量的亲水性氨基酸及游离氨基酸，更容易与水分子之间形成氢键，促使自由水的转变，更多结合水的存在可以明显减少冰晶的形成，阻止蛋白质的相互聚集或蛋白质因构象变化导致的开链变性[43]。同时，水解产物也可以通过氢键与冰晶结合，包裹在冰晶表面，阻止冰晶因不断扩大对蛋白质造成的破坏[44]。另外，水解产物与蛋白质之间的氢键及疏水相互作用等也可以延缓蛋白质的冷冻变性[44]。有研究发现海水鱼废弃料水解物[45]、鱿鱼蛋白水解物[46]及鳗鱼头水解物等蛋白质水解物可以保持冻藏长蛇鲻鱼糜及草鱼鱼糜等蛋白制品的Ca2+-ATP酶活性、盐溶性蛋白含量、未冻结水含量及凝胶强度，从而有效抑制蛋白质的冷冻变性。刘艺杰等[25]研究发现向鳙鱼鱼糜中添加红鱼鱼排酶解物后，样品蛋白质结构相比空白组更加致密且冰晶减少，说明红鱼鱼排酶解物可以增强蛋白质的稳定性，有效抑制冻藏过程中的冷冻变性，其中，木瓜蛋白酶水解物效果最为显著。Du Lihui等[47]研究鸡皮胶原蛋白水解物对反复冻融天然肌动球蛋白模型体系的冷冻保护作用，偏振显微镜结果显示鸡皮胶原蛋白水解物诱导冻结过程中形成更小体积的冰晶体，其通过抑制冰晶的形成，控制肌动球蛋白的解折叠，避免氧化氨基酸的暴露，从而减缓蛋白质的冷冻变性。Korzeniowska等[48]研究发现8%的太平洋鳕鱼水解物可以明显提高天然肌动球蛋白的热稳定性、凝胶持水能力及质构特性，对蛋白质具备良好的低温保护性能。

5 盐类的抗冻保护作用

目前，磷酸盐是作为抗冻剂最广泛使用的盐类物质，这主要是由于磷酸盐使用方便且价格低廉[22]。多聚磷酸盐可以解离鱼肉肌动球蛋白，扩大肌原纤维蛋白的空间结构，使结合水的含量增加，蛋白质表面的水分子层保护蛋白质结构的稳定，避免冷藏过程中的冷冻变性[37]。复合磷酸盐含有大量磷酸根离子，可以增强鱼肉离子强度，提高pH值，增强肌动球蛋白的亲水性，延缓蛋白质的冷冻变性[26]。磷酸盐对鱼肉蛋白质的冷冻变性作用弱于糖类，但是，可以显著增强鱼肉凝胶强度和保水性，与糖类协同使用时起到一定的增效作用[49]。罗永康等[50]研究得到蔗糖、山梨糖醇及多聚磷酸盐以一定比例复配时，鱼肉盐溶性蛋白质溶解度及pH值明显升高。梁慧等[37]研究发现添加磷酸盐后，鱼肉肌原纤维蛋白Ca2+-ATP酶活性及活性巯基含量都高于空白组。张艳等[22]研究表明向鱼肉中添加复合磷酸盐后，当肌原纤维蛋白pH值保持在6.5～7.5之间时，蛋白质变性最小。

6 抗冻肽的抗冻保护作用

抗冻肽（antifreeze peptide，AFP）的研究在20世纪较为热门。一般认为其是一种热滞后蛋白质[51]，可以与水结合并抑制冰晶的生长和再结晶[52]。Wu Jinhong[51]及Kim[53]等利用分子动力学模拟法研究了丝胶抗冻肽抑制冰晶生长的机理，发现其可以抑制草鱼鱼糜的冷冻变性，能够作为有效的抗冻剂。在冻藏过程中，鱼肉细胞膜通透性增大，导致细胞内容物的渗漏，抗冻肽可与细胞膜磷脂以氢键结合，避免冷却相变过程中焦碳酸二乙酯脂质体的渗漏和膜融合[54-55]。但是，抗冻肽对细胞膜的稳定机理及抗冻肽结构与功能间的关系尚不明确[56]。同时，抗冻肽由大量氨基酸残基组成，如甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸及丙氨酸等，因而抗冻剂与冰之间的亲和力极强[56]，而抗冻肽与冰的结合及对冰晶生长的抑制作用则可能源于氢键、疏水相互作用及非键相互作用，其中，氢键存在于苏氨酸与天冬氨酸之间，疏水相互作用与非键相互作用皆存在于脯氨酸与缬氨酸之间，这有待进一步深入研究[51]。现有研究认为脯氨酸残基阻碍抗冻肽和水分子渗入抗冻剂附近的冰晶中，因而从动力学角度抑制了冰晶的生长[54]。另外，抗冻肽中甘氨酸-氨基酸-脯氨酸/羟脯氨酸三肽重复序列在鱼肉蛋白的冷冻保护方面发挥着重要作用[52]。目前，大豆蛋白水解物、猪肉肌原纤维蛋白水解物及蓝鳕鱼皮明胶水解物等一系列蛋白质水解物[57]中具有强抗氧化活性和自由基清除能力的肽序列已被发现并鉴定[58]。Pan Xin等[59]研究发现从孔鳐蛋白水解物中分离鉴定的3 种生物活性肽的分子结构小，存在大量抗氧化性及疏水性氨基酸残基，因而具有很强的抗冻及抗氧化性能。近年来，抗冻肽被认为可以开发为有利的抗冻剂在冷冻食品中使用[51-52]，然而，抗冻肽主要从自然生物体中分离或基因工程生产得到，有限的可用性和未知的安全性严重制约其使用[56,60]，故而，目前抗冻肽尚未有实际大规模的应用。

7 抗冻剂使用效果的影响因素

抗冻剂的抗冻效果受到很多因素的影响，如糖及糖醇类抗冻剂的抗冻效果与其结构、分子质量及温度关系密切。戊糖（核糖、木糖）分子内部存在大量活性醛基，与蛋白质分子的氨基发生反应，极易引起蛋白质分子的聚集，因此，其抗冻效果远不及二糖（乳糖、蔗糖）和己糖（葡萄糖、果糖）[26]。相比于高分子质量麦芽糊精，低分子质量麦芽糊精具有更大的最适抗冻温度范围[61]。这可能是由于大分子多糖与水分子之间的强相互作用导致多糖分子间的大量聚集，因而糖类降解物的应用受到更大的关注。Yamashita[62]及Kingduean[63]等研究发现相比于壳聚糖，壳聚糖降解物分子结构中存在大量—OH，可以稳定肌原纤维蛋白分子周围的水分子，使其保持更高的水合作用，同时，可以明显抑制鲻鱼肌原纤维蛋白中Ca2+-ATP酶的活性，更好的延缓其冷冻变性。

同时，抗冻剂的抗冻效果受其溶解性、添加量及抗氧化特性等因素的影响，如茶多酚作为一种脂溶性较差的酚类，在油脂性体系中容易发生凝集和沉淀，从而对多脂鱼的冷冻保护较差，且茶多酚易被氧化，产生大量自由基，当添加量过多时会产生促氧化现象，加剧鱼肉蛋白质的冷冻变性。同时，磷酸盐的添加也存在超标的问题，且焦磷酸盐和三聚磷酸盐易发生降解，严重影响磷酸盐的抗冻效果，因而严格控制磷酸盐在鱼肉冻藏过程中的降解至关重要[64]。

8 抗冻剂的应用及其局限

现有部分糖类降解物具有良好的抗冻效果，但是在鱼肉及鱼肉制品的应用中存在一定的局限。有研究发现淀粉水解物对冻藏鱼肉起到明显的冷冻保护作用，可是严重影响鱼肉凝胶的形成，无法满足冷冻鱼糜行业的需求[61]。同样，部分蛋白质水解物也存在这样的问题，如脯氨酸抗冻效果较佳，但其安全性及价格限制了其在实际工业生产中的应用[26]。另外，蛋白质水解物在作为抗冻剂使用时需要先进行适当的脱苦脱色处理，避免其不良的风味和色泽对鱼肉本身的影响[65]。

目前，传统抗冻剂（4%蔗糖与4%山梨糖醇复配）存在高热量、高甜度的缺点，严重影响鱼肉及鱼肉制品的风味、口感及营养价值。因而，近年来对低热量、低糖度的新型糖类抗冻剂的开发成为研究重点，以满足现代生活中消费人群对健康饮食的需求[8]。其中，部分糖类抗冻剂有待进一步研究，如国内外对壳聚糖在改善海水鱼鱼糜凝胶特性方面的研究较多，而其对鱼肉及鱼肉制品的冷冻保护作用鲜有研究，尤其是国内的相关报道很少。

另外，由于人工合成抗冻剂存在一定的毒性和致癌作用，海洋生物来源的天然抗冻剂受到了更多的关注。有研究发现从小达鱼中提取的明胶水解产物和太平洋鳕鱼水解产物寡肽具有更高比例的亲水性氨基酸，与水分子结合更加紧密，阻止水分子迁移形成冰晶，从而有效抑制经过反复冻融的鲭鱼肌球蛋白和肌动蛋白及冻藏太平洋鳕鱼鱼糜的冷冻变性[66-67]。

在冻藏过程中鱼肉发生的脂质氧化和蛋白质氧化会引起蛋白质的聚集变性，在一定程度上诱导鱼肉蛋白质的冷冻变性，导致蛋白质功能特性的丧失。抗氧化剂已广泛用于抑制冻藏鱼肉的脂质氧化，其能否充当抗冻剂来抑制鱼肉蛋白质的冷冻变性引起了广泛关注。有研究发现抗氧化剂抑制冰晶的生长和形成以及脂质过氧化物的积累，从而减弱冻藏少脂鱼的冷冻变性，同时，也有研究发现抗氧化物可以有效防止冻藏鲭鱼的脂质和蛋白质氧化，但未对鱼肉蛋白质起到冷冻保护作用[68-69]。目前，脂质氧化对蛋白质冷冻变性的影响的研究相对缺乏，故而，抗氧化剂充当抗冻剂延缓鱼肉蛋白质的冷冻变性有待更深入的研究。

9 结 语

近年来，国内外学者运用不同方法从多个方面研究了鱼肉蛋白质的冷冻变性，且主要集中在生化方面，其分子作用机制仍需进一步研究。同时，对于鱼肉蛋白冷冻变性动态变化方面的研究有所欠缺，抗鱼肉蛋白冷冻变性的技术手段和抗冻剂的种类也有待深入探究，这些对于提升鱼肉及鱼肉制品品质及后续加工性能、满足市场及消费者的需求都具有现实意义。

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