红曲霉（Monascus spp.）具有有性生殖和无性生殖2 个生殖期。有性生殖期形成子囊和闭囊壳，无性繁殖过程中形成分生孢子[1]。红曲是以大米为原料，经过红曲霉发酵而成的一种紫红色米曲，被李时珍称为“造化之巧着”，是药食两用之奇才[2-3]。红曲色素是一种天然染色剂，同时红曲霉的次级代谢产物还具有降血脂、降血压、抑制癌细胞增殖等功效[4-12]。近年来，红曲发酵产物被用于治疗登革热病毒感染[13]。莫纳可林K（Monacolin K，MK）又叫洛伐他汀，是功能性红曲霉次级代谢产物中主要功能成分[14-15]。不同培养基种类能够影响MK产量[16-19]。祁田甜等[20]通过等离子体诱变技术选育高产MK的红曲霉突变株。2010年，Chen Yipei等[21]将mok H基因过表达，发现能够提高MK产量。
红曲霉mok E基因对应编码脱氢酶，该脱氢酶与土曲霉中由lov C编码的烯醇还原酶相似度为84%[22]。研究表明，lov C编码的烯醇还原酶能催化反应，使土曲霉MK合成前体物质——九酮化合物[23]。本课题组基于前期研究结果，确定了表达量与MK产量呈正相关的基因[17]。选取MK生物合成基因簇中mok E基因进行基因过表达，以提高MK产量，通过扫描电镜对转化子菌丝体及孢子形态进行观察，为进一步研究基因过表达与MK产量及菌体、孢子之间的相关性提供理论支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌种与原料
红曲霉M1由天津科技大学食品生物技术研究室保存。
大麦芽、大米 市售；RNA提取试剂盒 美国Omega公司；GV3301农杆菌、pCAMBIA1301质粒 天津科技大学食品生物技术研究室；T4连接酶、SYBRII Mix日本TaKaRa公司；HiFi-Script cDNA第一链合成试剂盒 康为世纪生物科技有限公司；Bsp119I、BglII内切酶 美国Thermo Fisher Scientific公司。
1.1.2 培养基
麦芽汁培养基：将大麦芽粉碎，称取500 g，加入2 L水，55～60 ℃保温糖化3～4 h，滤去残渣，煮沸、过滤，加水稀释至糖度为12°Brix，加入3%琼脂，121 ℃灭菌20 min。
种子液培养基：葡萄糖60 g/L，蛋白胨20 g/L，NaNO310 g/L，MgSO4·7H2O 5 g/L，KH2PO410 g/L。取100 mL培养液分装至250 mL三角瓶中，121 ℃灭菌20 min。
固态发酵培养基：在液体种子培养基中加入3%琼脂，121 ℃灭菌20 min。超净工作台内将培养基倒入已灭菌的平板中，待培养基凝固后，铺上已剪好的无菌玻璃纸，将气泡赶出，备用。
1.2 仪器与设备
1260型高效液相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司；LRH-250-GII型培养箱 广东省医疗器械厂；KCL-2000W型恒温恒湿培养箱 日本东京理化器械株氏会社；XL-3型扫描式电子显微镜 日本日立公司；SW-CJ-1FD型号超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；DK-S24型电热恒温水浴锅 上海森信实验仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 过表达载体连接与转化
对pCAMBIA1301质粒及mok E基因（含酶切位点及保护碱基）通过Bsp119I及BglII分别进行双酶切，纯化，在T4连接酶作用下16 ℃连接过夜[24]，连接产物经双酶切验证，确认连接成功。连接产物通过农杆菌介导红曲霉进行转化，转化步骤参考邵彦春[25]方法：将野生型红曲霉孢子与经乙酰丁香酮诱导剂处理的农杆菌共培养，在含有潮霉素抗性培养基上涂布，30 ℃黑暗培养3 d，有菌体长出则为转化子。
1.3.2 mok E基因表达水平的测定
分别称取转化子菌体100 mg，提取菌丝体RNA，反转录为cDNA，利用逆转录实时荧光定量聚合酶链式反应（reverse transcription-quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）法测定mok E基因表达水平，确定mok E基因过表达成功的转化子。RT-qPCR体系为：11 μL水；12 μL SYBRII Mix；1 μL cDNA；上下游引物各0.5 μL；总体系25 μL；每个样品做3 个平行实验。反应程序如下：95 ℃、30 s循环1 次；95 ℃、5 s，57 ℃、20 s，72 ℃、15 s，共循环40 次。所用引物序列见表1。
表1 引物序列
Table 1 List of primers used in RT-qPCR
1.3.3 发酵产物中MK的检测
1.3.3.1 MK固态发酵及样品处理
将在麦芽汁培养基上30 ℃活化7 d的红曲霉M1接种至种子液培养基，30 ℃培养48 h，在无菌操作台中用4～6 层无菌纱布过滤孢子悬液，用无菌水将孢子浓度调至106个/mL。在固态发酵培养基中心位置加入20 μL孢子悬液，待菌液干燥后，30 ℃倒置培养6 d后，于25 ℃培养12 d。分别将培养至18 d的野生型红曲霉M1及经筛选的转化子玻璃纸取下，剥落玻璃纸，得菌体，50 ℃烘干，研磨成粉末，称取0.50 g。用10 mL 75%乙醇溶液分3 次进行萃取，每次超声30 min，3 500 r/min离心15 min，上清液经0.22 μm滤膜过滤，待测。每个样品做3 个平行实验。
1.3.3.2 MK标准品的制备及检测
配制质量浓度分别为5.00、10.00、50.00、100.00、200.00、400.00 μg/mL的MK标准溶液。用高效液相色谱法测定MK标准品，并绘制标准曲线。
1.3.3.3 高效液相色谱检测条件
检测器：二极管阵列检测器；检测波长237 nm；色谱柱：Agilent X DB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；进样体积：20 μL；柱温：25 ℃；流速：1 mL/min；流动相：乙腈-0.1%甲酸溶液体积比60∶40，等度洗脱。
1.3.3.4 扫描电镜观察
分别将野生型红曲霉M1及转化子培养至18 d，取菌体，放置于2.5%戊二醛溶液中固定6 h，用pH 7.2，0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液漂洗3 次，经50%、70%、90%和100%乙醇溶液梯度脱水，每次15 min，冷冻干燥，待用。用Eiko IB-3型离子溅射仪喷金，XL-3型扫描式电子显微镜（20 kV）扫描[26-27]观察形态。
2 结果与分析
2.1 过表达载体质粒连接与转化结果
mok E基因长度为1 294 bp，连接于Bsp119I及BglII两个位点之间。位于CaMV 35s启动子下游，mok E基因含有终止子。质粒图谱[24]如图1所示。mok E基因片段全长为1 294 bp，由图2可知，在1 000～2 000 bp之间有片段，且与目的片段大小相符，表明mok E基因与pCAMBIA1301质粒连接成功，可用于后续的转化实验。
图1 过表达质粒图谱
Fig. 1 Schematic representation of the overexpression vector
图2 连接产物双酶切验证凝胶电泳结果
Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of pCAMBIA-mok E with double enzyme digestion
pCAMBIA1301质粒含有潮霉素抗性基因，按照1.3.1节农杆菌介导丝状真菌的转化方法，对连接好的过表达质粒进行转化，共得到240 个转化子，按照选取菌落直径大、长势良好的9 个转化子（部分转化子如图3所示）进行遗传稳定性检测，结果表明5 代遗传稳定。
图3 野生型及转化子菌落形态
Fig. 3 Morphological features of the wild-type strain and transformants
2.2 mok E基因表达量测定结果
由图4可知，WS M1为野生型红曲霉M1菌株中mok E基因表达水平，T1转化子为转入空质粒的转化子，作为阴性对照，其mok E基因水平未增加。T2、T8、T9菌株中mok E基因水平均增加，表明在T2、T8、T9菌株中mok E基因过表达成功，其mok E基因表达量分别为野生型mok E基因表达量的1.57、4.63、2.39 倍。
图4 野生型红曲霉M1与转化子mok E基因表达水平
Fig. 4 Expression levels of mok E gene in the wild-type strain M1 and transformants
2.3 MK产量测定结果
2.3.1 MK标准曲线
根据MK标准溶液浓度及峰面积计算得到MK标准曲线的线性回归方程为y=63.48x＋13.50，相关系数R2=0.999。
2.3.2 野生型红曲霉M1及转化子内酯型MK产量
图5 野生型红曲霉M1与4 株转化子的内酯型MK产量
Fig. 5 Monacolin K lactone production by wild-type strain M1 and 4 transformants
由图5可知，野生型红曲霉M1 MK产量为1 447.8 μg/g，T2、T8、T9转化子内酯型MK产量增长明显，而转入空质粒的T1转化子内酯型MK产量增长不明显，表明mok E基因过表达能够提高红曲霉MK产量。这与Chen Yipei等[21]的结论一致，对与MK产量呈正相关的基因进行过表达能够提高MK产量。其中，T8转化子内酯型MK产量最高为4 177.6 μg/g，比野生型红曲霉内酯型MK产量提高了188.5%。T2、T9转化子内酯型MK产量分别为2 159.7、3 365.7 μg/g，MK产量较野生型分别提高了49.2%、132.5%。
2.4 基因过表达对菌丝及孢子形态的影响
由图6a可知，红曲霉菌丝有大量分枝，菌丝体密实，多呈网结联合，在分枝的顶端具有单个或成串的球形或椭圆形囊实体。这与Ji等[28]的描述一致。野生型红曲霉存在大量的分生孢子，即在菌丝顶端或侧面小梗顶端的倒梨形球体。由图6b～d可知，T2、T8、T9转化子中分生孢子数量少，球状闭囊壳数量多。以分生孢子进行的繁殖为无性繁殖，而产生闭囊壳的过程为有性繁殖[29]。这表明mok E基因过表达，对红曲霉菌丝及孢子形态有一定的影响。推测mok E基因过表达使菌丝体长度变短，菌丝之间网结联合减少，从而促进MK产生。而菌丝体较短，网联结构稀疏能够促进丝状真菌次级代谢产物的产生，这与王莉衡[30]的研究结果一致。有研究表明，利于菌丝生长的环境也利于无性繁殖，即分生孢子的产生，但一般不利于有性繁殖[31]，这与本实验结果一致。
图6 野生型M1及mok E基因过表达转化子扫描电镜（×800）
Fig. 6 Scanning electron micrographs of wild-type strain M1 and mok E overexpressing transformants (× 800)
3 结 论
选取红曲霉MK生物基因簇中mok E基因进行过表达，共得到240 个转化子；挑取菌落直径大、生长良好的9 个转化子，测定其mok E基因表达量，发现3 株mok E基因表达量增加的转化子T2、T8、T9。MK产量测定结果表明，T2、T8、T9转化子内酯型MK产量比野生型红曲霉的内酯型MK产量分别提高了49.2%、188.5%及132.5%。说明mok E基因过表达能够提高MK产量。
对野生型红曲霉M1及转化子菌丝、孢子进行扫描电镜观察。结果显示mok E基因过表达，对红曲霉的菌体生长、孢子形态及生殖方式均有影响。推测mok E基因过表达是通过影响红曲霉菌丝体及孢子的生长，最终影响MK的产生。该结果对通过生物技术手段研究MK产生与菌体、孢子生长的相关性提供了理论支持。
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