驴肉肉质细嫩，味道香醇，具有独特的风味，并且驴肉含脂量为5.0%，低于其他畜禽肉的脂肪含量，不饱和脂肪酸含量高于其他畜禽肉，能够提供丰富的不饱和脂肪酸[1]，较好地满足人体的营养需求，因此受到大众喜爱。但是由于地域限制，许多地区的市场上没有驴肉的相关产品。利用真空包装技术将驴肉变成即食食品，不仅保证产品感官风味和营养成分，而且方便运输、携带，突破了地域限制。目前对于驴肉的研究主要集中于驴肉脂肪酸的组成及功能评价、驴肉制品的工艺研究等，而对于驴肉独特的风味研究较少，为确定真空包装五香驴肉的关键性风味活性物质，本实验拟对真空包装五香驴肉的挥发性风味物质进行研究。
溶剂辅助风味蒸发（solvent-assisted flavor evaporation，SAFE）法是一种能够有效把挥发性成分从复杂基质中提取出来的方法，具有对样品的热敏性挥发成分破坏较小、萃取物的香味自然逼真的优点[2]，常用于果蔬[3]、肉制品[4]中的风味物质分析。气相色谱-嗅闻-质谱（gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry，GC-O-MS）法将GC的分离能力与人类鼻子的灵敏性相结合，使研究者可对挥发性风味物质进行定性定量评价，并能够确定特定的风味物质在某一浓度条件下是否具有风味活性，风味活性的持续时间及其强度和香型等风味信息。风味物质是否对整体风味有贡献不仅取决于浓度的大小，还与其阈值有关，阈值指单个挥发性物质产生嗅觉反应需要的最低浓度[5]。Rothe等[6]定义了香气活性值（odor activity value，OAV），它是风味物质浓度与其阈值的比值。化合物的OAV不小于1，则认为该化合物对其风味有贡献作用，且OAV越大，对整体风味的贡献度就越大[7]。因此可通过OAV确定风味物质对整体风味贡献的大小。
本实验通过SAFE法结合GC-O-MS技术分析鉴定真空包装五香驴肉中的风味物质，采用内标法定量，结合OAV，找到关键性风味活性物质，为真空包装五香驴肉的生产加工、质量控制及风味评价提供指导。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
五香闹汤驴肉（250 g） 河南省老师傅食品发展有限公司。
二氯甲烷、无水硫酸钠、邻二氯苯（均为分析纯）国药集团化学试剂有限公司；C6～C30正构烷烃（色谱纯） 美国Sigma-Aldrich公司；氮气（纯度99.9%）北京氦普北分气体工业有限公司；2-甲基-3巯基呋喃、芳樟醇、麦芽酚、2-甲基吡嗪、壬醛、2,6-二甲基吡嗪、醋酸、叶醇、甲基庚烯酮（质量分数均为99.9%）北京百灵威科技有限公司。
1.2 仪器与设备
溶剂辅助挥发性香气蒸发装置 北京肯堡博美玻璃仪器厂；XDS5复合涡轮分子泵 英国Edwards公司；A-100S旋转蒸发仪 日本EYELA公司；SHB-III循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司；OLS系列多功能水浴摇床 英国固蓝特仪器有限公司；ISQ1310 GC-MS联用仪 美国赛默飞世尔科技公司；ODP3嗅闻检测器 德国Gerstal公司；感官评定杯东莞市万江鑫诚玻璃制品厂。
1.3 方法
1.3.1 SAFE提取挥发性风味物质
准确称取100 g切碎的驴肉，放入500 mL锥形瓶中，加入300 mL二氯甲烷，用封口膜封口并经摇床振荡（转速110 r/min，温度25 ℃）12 h后，经抽滤得到有机相约300 mL。将萃取液倒入滴液漏斗内，超级恒温水槽和循环水的温度设置为50 ℃，在冷阱和保温瓶内加入液氮，当系统压力降至5 MPa左右时，打开滴液漏斗的活塞，缓慢滴加，萃取约40 min。收集的萃取液中加入无水硫酸钠，置于－18 ℃冰箱中干燥12 h，过滤，旋转蒸发浓缩至1.5～2.0 mL，氮吹至1 mL，待GC-MS联用分析。
1.3.2 GC-O-MS分析
采用GC-O-MS对驴肉挥发性风味物质进行分析，该系统由ISQ1310 GC-MS和ODP3嗅闻装置组成。样品经进样口解吸，经GC分离后分别进入质谱检测器和嗅闻检测器，分流比为1∶1。由6 名经过训练的实验人员在嗅闻口记录所闻到的香味特征和强度（1=微弱的气味，2=中等强度的气味，3=强烈的气味）。须有3 人以上嗅闻到才能被确定为风味活性物质。
1.3.3 GC-MS条件
GC条件：DB-Wax毛细管色谱柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；进样口温度250 ℃；升温程序：起始柱温40 ℃，保持1 min；以6 ℃/min升温至100 ℃，保持3 min；以2 ℃/min升温至120 ℃，保持2 min；以5 ℃/min升温至220 ℃，保持3 min；载气（He）流速1.2 mL/min；进样量1 µL；分流比20∶1。
MS条件：电子电离源；电子能量70 eV；离子源温度250 ℃；质量扫描范围45～550 u；全扫描；溶剂延迟时间5 min；调谐文件为标准调谐。
1.3.4 定性定量分析
定性分析：以NIST 11谱库检索，保留指数（retention index，RI）定性对检测结果进行分析，结合相关文献进行人工谱图解析。RI是在分析样品中添加了C6～C30正构烷烃内标物后按公式（1）计算：
式中：t’（i）为待测组分的调整保留时间（t’（n）＜t’（i）＜t’（n＋1））/min；n和n＋1分别为未知物流出前、后正构烷烃的碳原子数；t’（n）和t’（n＋1）分别为具有n和n＋1个碳原子的正构烷烃的保留时间/min。
定量分析：对驴肉中挥发性风味物质进行分离鉴定时添加邻二氯苯（质量浓度为65 μg/mL，溶剂为二氯甲烷）为内标物。根据邻二氯苯的质量浓度与体积、挥发性风味物质的色谱峰面积与邻二氯苯的色谱峰面积进行比较，按公式（2）计算挥发性风味物质相对于邻二氯苯的含量，认定内标的因子为1[8]。
式中：Ci为未知化合物的含量/（μg/g）；Si为邻二氯苯的质量浓度/（µg/mL）；CA为未知化合物的峰面积；SA为邻二氯苯的峰面积；Vi为萃取液的体积/mL；no/i为混合液中所含的内标物体积与萃取液体积之比；ms为前处理前样品的质量/g。
1.3.5 OAV计算
按公式（3）计算OAV：
式中：Ci为化合物的含量/（μg/g）；OTi为该化合物在水中的嗅觉阈值/（mg/kg）。
1.3.6 感官评定
表1 五香驴肉的风味感官评定的描述词、定义及参照物
Table 1 Vocabulary, definition and reference for flavor sensory attributes of spiced donkey meat
采用定量描述性感官评价法[9]，确定五香驴肉风味感官描述词，采用数字评估法对五香驴肉中每一项风味指标的强度进行评分。评定人员根据GB/T 162912—2012《感官分析选拔、培训与管理评价员一般导则》[10]进行培训。
将5 g样品置于感官评定杯中，由12 名（6 男6 女）评定人员进行感官评定，评定的具体指标、定义及标准香味化合物参照见表1。评定人员对不同质量浓度的标准香气化合物按浓度从低至高进行嗅闻，再对样品进行嗅闻，将其进行比较并评分。采用Excel 2010进行数据处理，结果采用平均值表示，并绘制风味剖面图。
2 结果与分析
2.1 五香驴肉挥发性风味物质的GC-MS结果分析
图1 SAFE萃取五香驴肉中挥发性物质的总离子流图
Fig. 1 Total ion current chromatogram of volatile aroma compounds in spiced donkey meat extracted by SAFE
表2 五香驴肉中挥发性物质的定性定量结果
Table 2 Qualitative and quantitative analysis of volatile compounds in spiced donkey meat
续表2
注：MS.质谱定性；RI.保留指数定性；—.无文献值。表4同。
采用SAFE提取五香驴肉中的挥发性风味物质，如图1、表2所示，共鉴定出48 种物质，包括烃类4 种，醇类14 种，酚类1 种，醛类7 种，酮类4 种，酸类5 种，酯类6 种，醚类1 种，杂环及其他类6 种。其中含量最高的为杂环及其他类化合物，含量为3.714 μg/g，其次为醇类（3.266 μg/g）、醚类（1.365 μg/g）、酸类（0.785 μg/g）、烃类（0.596 μg/g）、酯类（0.514 μg/g）、酚类（0.413 μg/g）、醛类（0.167 μg/g）、酮类（0.134 μg/g），含量高低并不能说明对风味的贡献度大小[11]，需结合GC-O-MS结果与OAV进行进一步分析。
2.2 五香驴肉风味活性物质的OAV分析
如表3所示，在检测出的48 种挥发性风味物质中，有13 种化合物的OAV大于1，包括3 种烃类物质，4 种醇类物质，1 种酚类物质，4 种醛类物质，1 种醚类物质。它们对五香驴肉的风味有贡献作用。其中桉叶油醇、丁香酚的OAV大于200，说明它们对五香驴肉的风味有关键性贡献作用。在所有挥发性组分中含量较多的是醇类和醚类物质，在一定程度上说明了挥发性风味物质的质量浓度大小决定了OAV的大小[12]。
OAV大于1的烃类化合物鉴定出3 种，Shahidi等[13]认为无论是饱和烃还是不饱和烃对食品风味形成中发挥的作用均较小。月桂烯具有令人愉快的甜香脂气味，与驴肉制作过程中添加的花椒等香辛料有关[14]。双戊烯和1-石竹烯二者分别具有柠檬香味[15]和淡的丁香似香味[16]。双戊烯含量为0.275 μg/g，1-石竹烯含量为0.257 μg/g，二者含量相近但OAV值差较大，说明挥发性风味物质的OAV不仅与物质含量有关还与阈值有关。
醇类主要来自于脂肪的氧化，不饱和脂肪酸在氧化裂解生成醛的过程中，会生成醇和醛的混合物，不饱和醇的阈值较低，OAV较大，对风味的形成有较大贡献[17]，本实验中OAV大于1的醇类物质共鉴定出4 种，其中鉴定出的不饱和醇有1-辛烯-3-醇、芳樟醇、糠醇、其中糠醇含量最高，有特殊的苦辣气味。1-辛烯-3-醇是亚油酸自动氧化的产物，具有蘑菇风味[18]。芳樟醇具有类似柠檬的香味，天然存在于肉桂挥发性成分中[19]，与驴肉制作过程中添加的肉桂等香辛料有关。
酚类物质仅鉴定出丁香酚。丁香酚是丁香挥发油中最主要的风味成分[20]，具有辛香、烟熏香、熏肉样香气和特殊浓烈的味道。
醛类物质主要来源于脂氧化和降解，Strecker降解反应也是其重要来源之一[21]。OAV大于1的醛类鉴定出3 种，虽然含量较低，但阈值也较低，具有脂肪香味，是肉品香味的主要构成部分。其中壬醛具有强烈的脂肪、柑橘香气和味道[22]。辛醛是驴肉制作过程中添加的姜中的主要成分[23]，未稀释前具有粗油脂的气息，稀释后具有甜橙，轻油脂味，蜂蜜样香气[24]。十二醛天然存在于八角莲叶中[25]，具有强烈脂肪香气，并有类似松叶油和橙油的强烈香气。柠檬醛属于烯醛类化合物，主要提供果香、甜香、脂肪香及陈香[26]。
脂肪氧化的另一产物是酮类，酮类阈值较高，OAV较小，对驴肉的风味贡献程度相对较小。一般认为酮类物质具有清香气味、奶油味和果香味。GC-MS检测出的酮类化合物有4 种，其中3-羟基-2-丁酮含量最高，具有奶油似香气；甲基庚烯酮具有果香、柑橘香气。由于酮类化合物阈值较高，实验中4 种酮类化合物的OAV均小于1，未在表2中列出。
酸类和酯类阈值较高，OAV较小，对驴肉的特征风味贡献不大。GC-MS鉴定出酸类5 种，其中含量较高的是己酸和辛酸，分别具有强烈的、腐臭奶酪香气[18]和略有不舒适的气味和焦膣味。鉴定出的6 种酯类中，δ-十二内酯含量最高，具有甜的水果和芹菜似香气。它们的OAV均小于1。
醚类化合物的作用在肉制品风味中很重要，本实验鉴定出对丙烯基茴香醚的OAV大于1且含量较高，其具有茴香、辛香甘草的气味，天然存在与八角茴香、小茴香精油中[27]。
综上可知，醇类、酚类、醛类、醚类物质共同构成了五香驴肉独特的风味。
2.3 五香驴肉风味活性物质的GC-O-MS分析
表4列出了由嗅闻检测到的21 种风味活性物质，包括烃类2 种、醇类6 种、酚类1 种、醚类1 种、酮类3 种、醛类2 种、酯类2 种、杂环化合物类4 种。但由质谱检测出的挥发性物质却有48 种，说明大部分挥发性物质都没有香气特征。从嗅闻口闻到的香气特点包括烤香、坚果香、辛香、油脂味、甜香等。主要香气特征是辛香、烤香、甜香。由表4的强度数据（强度=3）可知，气味强烈的有桉叶油醇（凉香，药草香）、丁香酚（酸甜，辛香）、对丙烯基茴香醚（甜香、清凉、药草香）、壬醛（油脂味）、2-甲基吡嗪（烤香）、2,6-二甲基吡嗪（坚果香）、2-乙酰基吡咯（烤香、甜香）、麦芽酚（焦糖香）。这些化合物对驴肉风味贡献最大，是起主要作用的风味成分。桉叶油醇、丁香酚、对丙烯基茴香醚是制作过程中添加的香辛料的挥发性成分[19,29]，主要提供辛香。杂环类化合物主要来自美拉德反应的产物，是肉品中重要的风味呈味物质[30]，主要提供烤香。壬醛提供了脂肪类香气。
表4 GC-O-MS法鉴定五香驴肉的风味活性物质
Table 4 Flavor-active compounds in spiced donkey meat identified by GC-O-MS
注：化合物和香气特征至少3 名实验员嗅闻到的化合物以及至少3 名实验员在嗅闻口闻到的香味描述。鉴定方式中O表示嗅闻。
对比可知，OAV法和GC-O-MS法2 种方法共同确定的风味活性物质有6 种，包括1-石竹烯、桉叶油醇、芳樟醇、丁香酚、壬醛和对丙烯基茴香醚。说明2 种方法在鉴定五香驴肉风味活性物质方面有一致性。
2 种方法鉴定结果的不同之处在于，OAV小于1的2-甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙酰基吡咯、麦芽酚在GC-O-MS中被鉴定为风味活性物质，而被OAV法鉴定为风味活性物质的月桂烯、双戊烯、1-辛烯-3-醇、糠醇、辛醛却没有在GC-O-MS中检测到。说明2 种方法存在一定的差异性与不足之处[12]。
2.4 感官评定
食品风味是由多种芳香物质共同决定的，芳香物质的检测结果是对食品挥发性香气物质实际含量水平的反映，各芳香物质的作用虽然能够通过阈值与含量计算，但在实际风味中不少芳香物质的作用仍是不确定的。因为不同物质的气味特征不同。含量高的风味物质不一定有积极作用，也可能会降低整体风味。因此，需要对芳香物质与感官评定建立一种联系，以便进一步确认风味活性物质，对五香驴肉的感官评定结果，如图2所示。
由图2可以看出，五香驴肉的风味轮廓为肉香、辛香、咸香、油脂香、甜香、烤香、清香、果香、酸味、坚果香。其中肉香、辛香、咸香、油脂香、焦甜香、烤香对驴肉的风味具有较大影响。感官评定结果与GC-O-MS结果（主要香气特征是辛香、烤香、甜香）具有一定相似性，同时也存在差异。出现这一现象的原因是感官评定鉴定的是整体香气的感官特征，而风味物质以复合体的形式存在时，相互之间会出现相乘、相杀等效应。GC-O-MS得到的是单一物质的香气特征，并不能体现整体香气的香气特征。因此感官评定结果与GC-O-MS结果具有一定的相似性又各具特点。
图2 五香驴肉的风味剖面图
Fig. 2 Flavor profile of spiced donkey meat
3 结 论
依据OAV和GC-O-MS结果可知，五香驴肉的关键性风味物质为桉叶油醇、丁香酚、对丙烯基茴香醚、壬醛、2-甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙酰基吡咯和麦芽酚。它们为真空包装五香驴肉生产的质量控制、风味评价方面提供了实验依据。
OAV法和GC-O-MS法在鉴定五香驴肉风味活性物质方面有一致性，OAV法实现了对食物复杂香气的简单化分析，GC-O-MS将仪器与感官结合。同时二者也具有差异和不足。在实际工作中既可以根据样品的性质选择合适的方法，也可以将2 种方法结合使用。
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