乳是由哺乳动物乳腺分泌的一种营养物质，含有蛋白质、脂肪、乳糖、矿物质等各种生物活性成分，营养价值十分丰富，易于被人体消化吸收，是动物幼崽及婴幼儿获得营养物质的重要来源。一般将母体在产后7 d内分泌的免疫活性强、营养价值高的略带黄色的乳汁称为初乳，母体在产后15 d以后分泌的乳汁称为常乳[1]。研究表明，人乳中蛋白质的组成含量与牛乳不同，人乳中乳清蛋白含量约为50%～60%，而在牛乳中约为20%，其余80%为酪蛋白，分子质量较大的酪蛋白不利于婴幼儿消化吸收[2-3]。人初乳、牛初乳的乳清蛋白中均含有免疫球蛋白、乳铁蛋白以及乳过氧化物酶等生物活性蛋白，但人初乳乳清蛋白参与的细胞组成多，且在生物过程如应激反应发挥的作用更强[4-6]。人乳中脂肪组成含量和牛乳无大差异，但在脂肪酸的组成方面，牛乳全脂中多为C4010的低级脂肪酸而人乳中高度不饱和脂肪酸含量较高，说明人乳的抗氧化、降血脂等一些功能性更强[7]。人乳低聚糖和牛乳低聚糖组成和结构有差异，研究表明人乳低聚糖更有利于婴儿肠道菌群的构建和大脑发展[8-9]。人乳中所含的一些营养成分较牛乳更易于婴幼儿消化吸收，且更有助于促进婴幼儿生长发育以及维持机体健康。随着科学的母乳化喂养方式的提出，人乳和牛乳营养成分对比研究也越来越受到重视[10-11]。
氨基酸是指含有一个碱性氨基及一个酸性羧基的有机化合物，但通常是指构成蛋白质的结构单位，信使RNA分子中的4 种核苷酸（碱基）的序列能决定构成蛋白质的20 种氨基酸的种类和排列次序。非编码蛋白氨基酸是指遗传基因中无相应的密码，不能编码于蛋白质分子中的氨基酸，即除组成蛋白质的20 种常见氨基酸以外的含有氨基和羧基的化合物。游离氨基酸是指没有形成聚合状态的单个氨基酸，它可以直接被人体吸收和利用。人乳和牛乳中均含有一定量的游离氨基酸，不同来源乳中游离氨基酸的含量有所差异。从婴幼儿消化吸收的角度分析乳中氨基酸被利用的多少，可在一定程度上反映乳的营养价值[12-13]。同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技术是近年来最新开发的一种定量研究技术，iTRAQ试剂可与氨基酸N端氨基及赖氨酸侧链ε氨基共价连接从而标记肽段，在质谱图中，不同样品中经过iTRAQ试剂标记的同一种氨基酸的质荷比相同。且相比传统蛋白质组学定量方法，iTRAQ技术能够实现高通量检测，同步比较8 种或4 种样品，还具有分析范围广泛、定量结果准确、分析时间短、效率高等优点[14-15]。高效液相色谱-串联质谱（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法是近年来发展起来的最新技术，在食品检测研究中得到广泛应用[16]。
目前，国际卫生组织提倡6 个月以前婴幼儿需母乳喂养，因此，本实验选取初乳和常乳为研究对象。大多数学者对于乳中游离氨基酸的研究，仅限于乳中17 种主要游离氨基酸的检测，而本研究利用先进的iTRAQ标记结合HPLC-MS/MS技术对不同泌乳期人乳和牛乳中42 种氨基酸进行检测及对比分析，比较游离氨基酸的种类及含量的差异性，弥补前人对氨基酸种类研究的不足，为未来婴幼儿配方奶粉的母乳化，研制辅助调血糖、调血脂、增强免疫力的功能性乳制品提供更加精确、全面的指导。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
人初乳、人常乳：实验选取沈阳市妇婴医院正常生产、身体健康、头胎、饮食正常、年龄在26～35 岁之间，产后1～5 d和30～45 d的产妇各10 人，每天上午9点采取人工挤奶的方式收集乳样，将其放入已消毒的采样瓶中，置于超低温冰箱中保存，并在实验前混合（防止个体差异），由授乳母亲自愿提供。
牛初乳、牛常乳：实验选取沈阳辉山乳业奶牛场，奶牛在1～5 龄之间，饲喂以苜蓿草为主的苜蓿型粗饲料，体重相近，泌乳日龄为1～7 d（初乳）和30～45 d（常乳）的健康荷斯坦奶牛各10 头，分别在上午9点进行人工挤奶，将其放入已消毒的采样瓶中，置于超低温冰箱中保存，并在实验前混合（防止个体差异）。
甲酸、乙腈、羟胺、磺基水杨酸（均为分析纯）美国Fisher公司。
1.2 仪器与设备
API 45AA氨基酸试剂盒 北京普瑞华盛生物科技有限公司；TG16-WS台式离心机 湘仪离心机仪器有限公司；U3000液相色谱系统 美国戴安公司；API3200 QTrap质谱系统、移液器 美国应用生物系统公司；超低温冰箱（－80 ℃） 青岛海尔集团；TWK-2001氮吹仪 湖北武汉泰沃康仪器设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品衍生化处理
移取40 μL原始乳样，置于1.5 mL离心管中，向离心管中加入10 μL磺基水杨酸，涡旋振荡30 s后13 200 r/min高速离心4 min。小心吸取10 μL上层液体于另一1.5 mL干净的离心管中。向离心管中加入40 μL标记缓冲液，涡旋振荡混匀后13 200 r/min高速离心4 min。移取10 μL上层液体置于另一1.5 mL干净的离心管。每个离心管中分别加入5 μL稀释的iTRAQ试剂，混匀。室温条件下孵化至少30 min。加入5 μL羟胺，涡旋振荡混匀后13 200 r/min离心4 min。加入32 μL内标物，涡旋混匀，13 200 r/min高速离心4 min，上样检测。
1.3.2 HPLC-MS/MS检测条件
HPLC条件：色谱柱MSLab HP-C18（150 mm×4.6mm，5 μm）；流速0.8 mL/min；柱温50 ℃；流动相A为水-0.1%甲酸；B为乙腈-0.1%甲酸溶液；进样量3 μL。梯度洗脱程序见表1。
表1 梯度洗脱程序
Table 1 Gradient elution program
MS条件：电喷雾离子源，正离子模式；多反应监测扫描方式；气帘气20 psi；碰撞气为Medium；喷雾电压＋5 500 V；雾化温度500 ℃；雾化气55 psi；辅助气60 psi；去族电压35 V；射入电压10 V；碰撞能量30 eV；碰撞室射出电压5 V。
1.4 统计学分析
本研究测定氨基酸质量浓度结果均以 ±s表示，使用SPSS 17.0程序对检测的数据进行分析，使用Levene法对数据进行方差齐性分析。根据P值大小来判断差异性。当P值小于0.05时则被认为差异显著，P值大于0.05则被认为无显著性差异。
2 结果与分析
2.1 游离氨基酸种类的鉴定
图1 44 种氨基酸的总离子图
Fig. 1 Total ion current chromatogram of 44 amino acids
乙腈和0.1%甲酸溶液作为流动相采用梯度洗脱的液相条件下，12 min内44 种氨基酸全部流出，其中正异亮氨酸（Nle）和正缬氨酸（Nva）属于非人体内氨基酸，Nle在样品预处理步骤引入，通过Nle回收率来校准测定结果，Nva于标记步骤引入，用以检验标记反应的效率，在80%～120%范围内为合格，反之作废[17]。样品中42 种氨基酸和2 种质控氨基酸（Nva、Nle）即44 种氨基酸的总离子检测水平如图1所示。样品检测较为顺利，各离子分离较好，质控的2 种氨基酸回收率上无统计学差异，说明在本实验的检测过程中系统误差较小。
2.2 人初乳、人常乳、牛初乳、牛常乳中游离必需氨基酸的差异分析
表2 人初乳、人常乳、牛初乳、牛常乳中游离必需氨基酸检测结果
Table 2 Contents of free essential amino acids in human colostrum,human milk, bovine colostrum and bovine milk μg/L
注：*.人初乳与人常乳比较，氨基酸含量存在差异性显著（P＜0.05）；#.牛初乳与牛常乳比较，氨基酸含量存在差异性显著（P＜0.05）；Δ.人常乳与牛常乳比较，氨基酸含量存在差异性显著（P＜0.05）。表3、4同。
人初乳中游离氨基酸总量约为0.63 g/L；人常乳中游离氨基酸总量约为0.37 g/L，人初乳和人常乳中均含有9 种必需氨基酸。经t检验分析得知，人初乳和人常乳中His、Ile、Lys、Met具有显著性差异（P＜0.05），其余的5 种必需氨基酸在两者间无显著性差异（P＞0.05），如表2所示。早有研究证明人乳可增强免疫力，人初乳和人常乳中Thr、Val的含量最高，且这2 种氨基酸都具有提高免疫力的功能[18-19]。人初乳中只有His质量浓度高于人常乳，His可参与外周神经的感觉与信号传递，对婴儿生长发育起着重要作用[20]。人常乳中Lys的质量浓度显著高于人初乳，可增强机体免疫力和具有促进脂肪分解等功能[21]。质量浓度最高，且具有提高免疫活性的Thr、Val在人初乳和人常乳中无显著差异，未来可对这2 种游离氨基酸功能进一步研究，探究其与人初乳较强免疫活性的关系。
牛初乳中游离氨基酸总量约为0.32 g/L；牛常乳中游离氨基酸总量约为0.16 g/L。牛初乳和牛常乳中均含有9 种必需氨基酸。牛初乳中除游离Lys含量显著低于牛常乳（P＜0.05），其他8 种必需氨基酸含量都显著高于牛常乳（P＜0.05），特别是游离的Val在牛初乳中含量最高，这同刘锋[22]、杨检林[23]等的研究结果近似。有研究证明，牛初乳能够调节机体血糖，对糖尿病具有较好的辅助治疗效果，通过对表2数据的分析发现，牛初乳中Val、Leu质量浓度较高，且这2 种氨基酸均具有调节血糖浓度的作用，未来可据此添加适量Val、Leu，研制辅助降血糖的功能乳制品[24-26]。
经t检验分析得知，人常乳中9 种游离氨基酸质量浓度均显著高于牛常乳（P＜0.05）。人常乳中Thr质量浓度最高，其次分别是Val、Lys、Leu。而牛常乳中Val质量浓度最高，Lys其次。人常乳中的His质量浓度显著高于牛常乳近16 倍，其对婴幼儿的生长发育极为重要。人常乳中Ile含量高于牛常乳约13 倍，而Ile在人体内被消化吸收后可通过不同的代谢途径成为各种人体激素和酶的原料，可促进婴幼儿的生长发育。人常乳中，Thr、Val、Lys、Ile的质量浓度都很高且都显著高于牛常乳，这4 种氨基酸都具有增强免疫力的作用，其含量配比可作为生产婴幼儿乳品时的参考[27-29]。
2.3 人初乳、人常乳、牛初乳、牛常乳中游离非必需氨基酸的差异分析
表3 人初乳、人常乳、牛初乳、牛常乳中游离非必需氨基酸检测结果
Table 3 Contents of free non-essential amino acids in human colostrum, human milk, bovine colostrum and bovine milk μg/L
如表3所示，人初乳和人常乳中均含有以上11 种非必需氨基酸，人初乳和人常乳中Gly、Tyr、Cys的质量浓度无显著性差异（P＞0.05）。人初乳中Ser、Asn、Asp、Glu、Gln、Ala这6 种氨基酸质量浓度显著高于人常乳，Arg、Pro的质量浓度显著低于人常乳（P＜0.05）。游离氨基酸总量随着泌乳时间的延长基本呈下降趋势，其中Glu在不同时期的质量浓度均为最高，这与徐丽[30]、吴立芳[31]等的结论一致。这些氨基酸在机体生命活动过程中起着十分重要的作用，其中，Glu、Asp为“兴奋性氨基酸”，可维持中枢神经系统平衡[32]，有助于婴幼儿生长发育。
实验测得牛初乳中含有8 种游离的非必需氨基酸，牛常乳中含有7 种，牛初乳中未检出Asn、Asp，而牛常乳中还未检出Pro。经t检验得，牛初乳和牛常乳中的Ser无显著性差异（P＞0.05）。牛初乳中Arg、Gly、Tyr、Ala质量浓度显著高于牛常乳（P＜0.05）。牛初乳中Ala的质量浓度最高，其在机体内可辅助葡萄糖代谢，缓解由机体血糖水平较低引起的症状，Gly质量浓度约为牛常乳中的3 倍，其对肝、肾、骨骼肌中的多种细胞系具有保护作用，也可参与神经信号传递[33]；Arg质量浓度约为牛常乳中的2 倍，Arg对机体的内分泌系统具有重要作用，促进生长激素、胰岛素的生成和分泌[34]。牛初乳中以上这些游离氨基酸质量浓度较高，可能是牛初乳具有保健功能的原因之一。在牛常乳中，Glu、Gln质量浓度显著高于牛初乳，Glu的质量浓度最高，L-Glu可脱羧形成一种具有传递抑制性神经信号的抑制性神经递质γ-氨基丁酸，可用于改善儿童神经系统发育，而L-Gln具有抗氧化、调节代谢、减少胃肠源性炎症、提高人体免疫力的功能[35]。
实验测得人常乳中含有11 种非必需游离氨基酸，牛常乳中含有其中7 种，人乳中氨基酸种类较牛乳中氨基酸种类更为齐全。比较发现，除Gln外，人常乳中非必需氨基酸质量浓度均高于牛常乳，牛常乳和人常乳中非必需氨基酸质量浓度均存在显著性差异（P＜0.05）。牛常乳中未检出Asn、Asp、Cys和Pro，而这4 种氨基酸在机体内均具有一定的生理功能。Asp在机体的合成途径是将Glu通过转氨作用将氨基转给草酰乙酸而获得，在机体内还是多种氨基酸例如Lys、Ile等以及碱基的前体；L-Asn在体内的合成途径是Asp通过β-羟基酰胺化作用转化得来的[36]；L-Cys可抑制酪氨酸酶，调节黑色素[37]；L-Pro在生物体内可被转化成L-羟脯氨酸，L-羟脯氨酸可以稳定胶原蛋白，进而有抗骨质疏松，减少皮肤皱纹并保湿的作用[38]。人常乳较牛常乳而特有的功能性，可能与这4 种游离氨基酸有关。
2.4 人初乳、人常乳、牛初乳、牛常乳中非蛋白质编码氨基酸的差异分析
表4 人初乳、人常乳、牛初乳、牛常乳中非蛋白质编码氨基酸检测结果
Table 4 Contents of non-protein amino acids in human colostrum,human milk, bovine colostrum and bovine milk μg/L
人乳中一般含有游离的22 种非蛋白质编码氨基酸。由表4可知，本实验测得人初乳、人常乳样品中均含有其中15 种，人乳中未检出Cth、Hcy、Car、Hyl、Sar、Asa、Hcit这7 种游离氨基酸。人初乳和人常乳中GABA、Ans、β-Ala、β-Aib、PEtN的质量浓度无显著性差异（P＞0.05）。人初乳中Tau、Cit、Orn、Abu、Etn、1-MHis质量浓度显著高于人常乳，其余4 种质量浓度显著低于人常乳（P＜0.05）。Tau在人乳中这22 种非蛋白质编码氨基酸中质量浓度最高，它可促进大脑细胞DNA、RNA及蛋白质的合成，对神经系统传导和视觉机能形成起着重要作用，有助于婴儿智力发育，还具有降血糖功能[39-41]。
实验测定的22 种非蛋白质编码氨基酸中，牛初乳中含有16 种，牛常乳中含有15 种，而牛初乳中未检出Cth、Hcy、Car、Hyl、Asa、Hcit，并且牛常乳中还未检出Sar。经t检验得，牛常乳和牛初乳中除Ans、PSer的质量浓度无显著性差异（P＞0.05），其他14 种氨基酸具有显著性差异（P＜0.05）。牛初乳中GABA、Aad、Cit、β-Ala、β-Aib、1-MHis这6 种游离氨基酸质量浓度显著低于牛常乳，其余8 种游离氨基酸质量浓度均显著高于牛常乳。牛初乳的16 种非蛋白质编码氨基酸中Tau质量浓度最高，其次是PEtN、Etn，而牛常乳中PetN质量浓度最高，但牛初乳中PEtN的含量约为常乳的2 倍。从游离氨基酸组成和质量浓度推断，牛初乳的生理活性可能强于牛常乳。
牛常乳和人常乳中均未检出Cth、Hcy、Car、Hyl、Sar、Asa、Hcit这7 种氨基酸。在牛常乳和人常乳中除GABA、Ans质量浓度无显著性差异（P＞0.05），其余游离氨基酸都具有显著性差异（P＜0.05）。人常乳中Tau质量浓度最高，PEtN质量浓度仅次于Tau。牛常乳中有Aad、Orn、Ans、β-Ala、β-Aib、Etn、Hyp、PEtN这8 种氨基酸质量浓度高于人常乳，其余7 种氨基酸质量浓度低于人常乳。
在本研究检测的42 种游离氨基酸中，牛常乳中含有31 种，人常乳中含有35 种，其中25 种游离氨基酸的质量浓度高于牛常乳。牛初乳中游离的His、Ile、Leu、Phe等17 种游离氨基酸随着母体泌乳时间的延长质量浓度逐渐减少；人乳中的His、Phe、Thr等17 种游离的氨基酸质量浓度随着母体泌乳时间的延长而逐渐降低。
3 结 论
通过iTRAQ标记结合HPLC-MS/MS技术对不同泌乳期人乳和牛乳中42 种氨基酸进行检测，比较分析了其中必需游离氨基酸、非必需游离氨基酸、非蛋白质编码氨基酸的种类及含量的差异。从总体上看，测定的42 种氨基酸，其中有11 种游离氨基酸在牛常乳中未检出，而在人常乳为7 种，即人乳中氨基酸种类较牛乳中游离氨基酸的种类更丰富。随着泌乳时间的延长，游离氨基酸总量呈下降趋势。从氨基酸总量上看，无论是初乳时期还是常乳时期人乳中游离氨基酸含量总是高于牛乳，即人乳游离氨基酸总量高于牛乳，这些游离氨基酸具有促进人体生长发育、增强免疫力、调节血糖、调节脂肪代谢等作用。未来可参考人常乳与牛常乳检测结果，研制更利于婴幼儿生长发育，游离氨基酸含量和种类更接近母乳的婴幼儿配方奶粉，参考不同泌乳期的检测结果研制具有辅助调血糖、调血脂、增强免疫力的功能性乳制品。随着iTRAQ标记结合HPLC-MS/MS技术的广泛应用，未来可以应用此方法对不同地区的母乳氨基酸种类和含量进行统计学分析，找出区域差异性，建立我国母乳氨基酸数据库。
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