硒是一种人体必需的微量元素[1]。硒具有抗癌及抗衰老作用，能够增强人体免疫力，调节人体维生素的吸收与利用，维持人体健康状态[2]。硒摄入不足容易引起人体免疫力下降，导致许多疾病的发生，比如近视、白内障、肝癌、肺癌、白血病等[3]。硒的日摄入量至少需要维持30～40 µg，但也不是越多越好，日摄入量达到400 µg也会导致一些疾病的发生，比如头发脱落、指甲变脆易脱落、神经系统异常等，引起人体代谢功能紊乱[4]。
我国很多地方都属于缺硒地区，因硒缺少引起的地方病波及东北到西南的十多个省和自治区，所引发的疾病包括已发现的克山病和大骨节病等。日常人体硒的摄入主要来源于食物。动物内脏、水产品、蛋类等都是硒含量较高的食物；豆类、肉类蔬菜以及粮食也有少量的硒存在[5]。针对部分严重硒缺乏地区，一些富硒食品如富硒大米、富硒大豆、富硒鸡蛋等也被研发出来，用于补充缺硒人群对硒的正常摄入，维持身体健康。
硒对人体的作用取决于硒的形态，人体对不同形态的硒吸收和利用都不同。硒存在的形态有很多种，比较常见的有硒酸根（Se（VI））、亚硒酸根（Se（IV））、硒代胱氨酸（SeCys2）、甲基-硒代半胱氨酸（SeMC）、硒代蛋氨酸（SeMet）等。针对这些不同形态的硒化合物，也出现了许多相应的检测分析方法[6-10]，分离硒化合物通常采用气相色谱法[11]、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法[12]、离子色谱法[13]以及毛细管电泳法[14]，检测方法有原子吸收光谱法[15]、原子荧光光谱法[16]、电感耦合等离子发射光谱法[17]、电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）法[18-28]。本实验采用HPLC与ICP-MS联用方法对5 种常见硒化合物进行分离检测，该联用技术具有分离效率高、检出限低、精密度高、稳定性好等优点，适用于这5 种硒化合物的分离和检测。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
SeCys2溶液（44.2 µg/g）、SeMC溶液（34.8 µg/g）、Se（IV）溶液（42.9 µg/g）、SeMet溶液（39.4 µg/g）、Se（VI）溶液（41.5 µg/g）（均以硒计） 中国计量科学研究院；柠檬酸（色谱纯） 美国Sigma公司；其他化学试剂均为优级纯；超纯水（电阻率≥18.2 MΩ·cm） 美国Millipore公司；ICP-MS 7500cs调谐溶液（1 µg/L，Li、Mg、Y、Co、Tl、Co） 美国Agilent公司。
1.2 仪器与设备
7500型ICP-MS仪、1200 series型HPLC仪 美国Agilent公司；Hamilton PRP-X100（250 mm×4.1 mm，10 µm）色谱柱 瑞士Hamilton公司；AL204型万分位电子分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；4-16K离心机 美国Sigma公司；超声波清洗仪 上海科导超声仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 仪器工作参数
色谱分离条件：PRP-X100（250 mm×4.1 mm，10 µm）色谱柱；流动相A：10 mmol/L柠檬酸溶液；流动相B：超纯水；流速：0.8 mL/min；进样量：20 µL。洗脱梯度见表1。
表1 HPLC梯度洗脱条件
Table 1 Gradient elution conditions of HPLC
ICP-MS工作条件：射频功率1 500 W；雾化室温度2 ℃；载气流量0.5 L/min；辅助气流量0.1 L/min；采样模式：时间积分；分析时间1 200 s。样品分析前用ICP-MS调谐液将仪器灵敏度调至最佳。
1.3.2 样品前处理
称取约0.2 g茶叶样品于10 mL离心管中，加入1 mL 10 mg/mL的蛋白酶K溶液，加纯水定容到10 mL，超声1 h，10 000 r/min离心15 min，取上层清液经0.22 µm滤膜过滤后上机测定。
2 结果与分析
2.1 色谱条件优化
图1 流动相为100% A时硒化合物分离谱图
Fig. 1 Chromatograms of selenium species with 100% mobile phase A
本实验根据文献[29]报道，选用柠檬酸溶液为流动相，通过优化柠檬酸溶液的浓度确定最佳色谱分离条件。根据文献[30]，如图1a所示，10 mmol/L的柠檬酸溶液（pH 5.5）单一等度洗脱能较好的分离SeCys2、Se（IV）、SeMet、Se（VI）这4 种硒形态化合物，与文献报道基本一致。但SeMC与Se（IV）在该流动相中却无法分离（图1b）。
图2 不同比例流动相硒化合物分离谱图
Fig. 2 Chromatograms of selenium species with different mobile phase compositions
为了使得SeMC和Se（IV）两种硒形态化合物能够取得较好的分离度，以达到完全分离，本研究对流动相进行了进一步的研究。以柠檬酸溶液（流动相A）-水（流动相B）进行色谱分离条件的摸索，通过调节流动相A和B的比例，来实现SeMC和Se（IV）较好的分离，实验分别研究了流动相A为100%、50%、10%、5%时两种硒化合物的分离情况如图2所示，最终发现在含5%的流动相A时，SeMC和Se（IV）两种硒形态化合物可以完全分离。
图3 硒化合物分离谱图
Fig. 3 Chromatograms of selenium species with isocratic and gradient elution
当流动相A-B（5∶95，V/V）时，5 种硒形态化合物得到了较好的分离，整个分离时间达到25 min左右（图3a）。由于Se（VI）的分离时间过长，不但导致峰形变宽，而且导致分析成本增加，不利于实际样品的快速检测。由图3a可知，SeCys2、SeMC、Se（IV）、SeMet在7 min内能够全部分离，而 Se（VI）则在22 min左右出峰，因此，本研究考虑采用梯度洗脱，缩短Se（VI）的分离时间且不影响前面4 种硒形态化合物的分离度。研究表明，随着流动相中柠檬酸溶液比例的增加，Se（VI）的出峰时间逐渐缩短。随着柠檬酸浓度的增大，盐含量高不利于ICP-MS的仪器保养，所以本研究综合考虑采用了如表1所示的洗脱梯度，5 种硒形态化合物在较短的时间内全部得到了完全分离（图3b），又能较好地保护仪器。
2.2 样品前处理条件的优化
针对硒形态化合物的提取试剂常见的有水、盐酸浸提和蛋白酶酶解等。本研究分别考察了以水、1%硝酸以及蛋白酶K溶液作为提取试剂对富硒茶叶中硒形态化合物的提取效果。结果表明，用水和1%硝酸溶液提取的溶液中未检测到硒形态化合物，蛋白酶K溶液中有硒形态化合物检出，这可能因为富硒茶叶中的硒形态化合物主要以硒蛋白和硒糖的形式存在，在水或1%硝酸溶液中溶解性较差，这一结果与文献[30]报道相符。因此本研究采用蛋白酶K溶液作为提取试剂。确定好提取液后，比较了恒温振荡与超声提取两种提取方式的提取效率，结果通过超声提取可以大大缩短实验时间，提取效果良好。最后，又进一步优化了超声提取时间以及蛋白酶K用量。
2.2.1 超声时间的选择
采用1.3.1节前处理方法，研究了超声时间对SeMC提取量的影响。结果表明，随着超声时间的延长，SeMC提取量增加，在60 min后增加量趋于平缓（图4）。因此，本实验选取超声60 min为最佳提取条件。
图4 超声时间对提取效率的影响
Fig. 4 Effect of ultrasonic treatment time on extraction efficiency
2.2.2 蛋白酶K用量的选择
图5 蛋白酶K用量对提取效率的影响
Fig. 5 Effect of protease dosage on extraction efficiency
采用1.3.1节前处理方法，研究了蛋白酶K用量对SeMC提取量的影响，如图5所示，结果表明，SeMC的提取量随蛋白酶K用量的增加而增加，在用量为1 mL以上时增加量趋于平缓。因此，本实验选取蛋白酶K用量1 mL为最佳提取条件。
2.3 标准曲线及检出限结果
配制质量浓度分别为0、5、10、20、30、40、50 µg/L的一系列5 种硒化合物的混合标准溶液，在优化的实验条件下考察方法的线性范围，5 种硒化合物在0～50 µg/L的质量浓度范围内线性良好（表2），线性相关系数R2不小于0.999 8。
表2 5 种硒化合物的标准曲线线性参数及检出限
Table 2 Linear correlation coefficients and detection limits of 5 selenium species
在空白样品中加入5 µg/L的混合标准溶液，以3 倍基线噪音测定5 种硒化合物的检出限分别为SeCys20.13 µg/L、SeMC 0.25 µg/L、Se（IV）0.24 µg/L、SeMet 0.65 µg/L、Se（VI）1.09 µg/L。
分别向样品中加入5、25、50 µg/L 3 个水平的5 种硒化合物标准溶液，各平行处理6 个样品，经扣除样品空白后，5 种硒化合物的回收率在91.8%～109.4%之间，5 种硒化合物的相对标准偏差均在5%以内。
2.4 实际样品的检测结果
应用本研究优化的方法对富硒茶叶（产地为恩施，品种为绿茶）样品进行测定，结果检测出了SeMC和SeMet，如图6所示，其中，SeMC含量为0.27 mg/kg，SeMet为0.066 mg/kg。
图6 实际样品的检测结果
Fig. 6 Chromatogram of real sample
3 结 论
采用HPLC-ICP-MS测定富硒茶叶中5 种硒化合物，通过对色谱分离条件和样品前处理方法的优化，利用高效液相色谱Hamilton PRP-X100色谱柱分析5 种硒化合物，线性范围为0～50 µg/L，线性相关系数不小于0.999 8，检出限为0.13～1.09 µg/L，5 种硒化合物的回收率在91.8%～109.4%之间，5 种硒化合物的相对标准偏差均在5%以内。本方法样品前处理简便快速、检出限低、精密度高、重复性好，能有效地同时处理和分析5 种硒化合物，适用于富硒茶叶中5 种硒化合物的测定。
参考文献：
[1] ESCUDERO L A, PACHECO P H, GASQUEZ J A, et al.Development of a FI-HG-ICP-OES solid phase preconcentration systemfor inorganic selenium speciation in Argentinean beverages[J]. Food Chemistry, 2015, 169(1): 73-75. DOI:10.1016/j.foodchem.2014.07.127.
[2] BRYSZEWSKA M A, MAGE A. Determination of selenium and its compounds in marine organisms[J]. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology, 2015, 29(1): 91-98. DOI:10.1016/j.jtemb.2014.10.004.
[3] BIRD S M, GE H, UDEN P C, et al. High-performance liquid chromatography of selenoamino acids andorgano selenium compounds speciation by inductively coupled plasma mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A, 1997, 789(1/2): 349-359.
[4] WHANGER P D J. Metabolism of selenium in humans[J]. The Journal of Trace Elements in Experimental Medicine, 1998, 11(2/3): 227-240.
[5] MAZEJ D, FALNOGA I, VEBER M, et al. Determination of selenium species in plant leaves by HPLC-UV-HG-AFS[J]. Talanta, 2006,68(3): 558-568. DOI:10.1016/j.talanta.2005.04.056.
[6] 杨玉玲, 刘元英. 食品中硒的测定和形态分析进展[J]. 中国调味品,2013, 38(6): 1-5. DOI:10.3969/j.issn.1000-9973.2013.06.001.
[7] 李红英, 陈永波, 胡百顺, 等. 原子荧光和电感耦合等离子质谱法在硒形态分析中的应用[J]. 氨基酸和生物资源, 2014, 36(2): 39-43.
[8] 刘扬, 张涛, 杨静, 等. 运用RPLC-ICP-MS对富硒酵母中的硒形态分析[J]. 食品与生物技术学报, 2013, 32(12): 1261-1265.
[9] 谢娟平. 紫阳富硒茶中硒的赋存形态及浸出率研究[J]. 食品研究与开发, 2016, 37(9): 156-159. DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.036.
[10] 方建军, 祝华明, 方芳, 等. 富硒大米中硒形态分析[J]. 食品研究与开发, 2012, 33(9): 146-149.
[11] BUENO M, PANNIER F. Quantitative analysis of volatile selenium metabolites in normal urine by headspace solid phase microextraction gas chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry[J].Talanta, 2009, 78(3): 759-763. DOI:10.1016/j.talanta.2008.12.044.
[12] MONTES-BAYÓN M, MOLET M J D, GONZÁLEZ E B, et al.Evaluation of different sample extraction strategies for selenium determination in selenium-enriched plants (Allium sativum and Brassica juncea) and Se speciation by HPLC-ICP-MS[J]. Talanta,2006, 68(4): 1287-1293. DOI:10.1016/j.talanta.2005.07.040.
[13] 谢小雪, 叶明德, 陈丹飞, 等. 离子交换色谱-氢化物原子荧光法测定水产品中硒的形态[J]. 分析试验室, 2014, 33(2): 231-243.DOI:10.13595/j.cnki.issn1000-0720.2014.0054.
[14] DENG B Y, SHEN C Y, QIN X D, et al. Selenium speciation in ginger using capillary electrophoresis online coupled with electrothermal atomic absorption spectrometry[J]. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 2014, 29(10): 1889-1896. DOI:10.1039/c4ja00129j.
[15] YAN L Z, DENG B Y, SHEN C Y, et al. Selenium speciation using capillary electrophoresis coupled with modified electrothermal atomic absorption spectrometry after selective extraction with 5-sulfosalicylic acid functionalized magnetic nanoparticles[J]. Journal of Chromatography A, 2015, 1395(1): 173-179. DOI:10.1016/j.chroma.2015.03.061.
[16] KOCOT K, LEARDI R, WALCZAK B, et al. Determination and speciation of trace and ultratrace selenium ions by energy-dispersive X-ray fluorescence spectrometry using grapheme as solid adsorbent in dispersive micro-solid phase extraction[J]. Talanta, 2015, 134(1): 360-365. DOI:10.1016/j.talanta.2014.11.036.
[17] 肖志明, 宋荣, 贾铮, 等. 液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱法测定富硒酵母中硒的形态[J]. 分析化学研究报告, 2014, 42(9): 1314-1319. DOI:10.11895/j.issn.0253-3820.140390.
[18] 谢倩, 李建洪, 黄文耀, 等. HPLC-ICP-MS测定硒蛋白中硒代氨基酸的方法[J]. 中国卫生检验杂志, 2015, 25(5): 636-641.
[19] MAR J L, REYES L H, RAHMAN G M, et al. Simultaneous extraction of arsenic and selenium species from rice products by microwave-assisted enzymatic extraction and analysis by ion chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(8): 3005-3013. DOI:10.1021/jf803598k.
[20] 李晶, 孔维恒, 高峰, 等. HPLC-ICP-MS法分析测定富硒保健品中的硒形态[J]. 现代仪器, 2012, 18(3): 36-39.
[21] MCSHEEHY S, YANG W J, PANNIER F, et al. Speciation analysis of selenium in garlic by two-dimensional high-performance liquid chromatography with parallel inductively coupled plasma mass spectrometric and electrospray tandem mass spectrometric detection[J].Analytica Chimica Acta, 2000, 421(1): 147-153.
[22] 吴雅颖, 桂仁意, 汤鋆, 等. HPLC-ICP-MS联用技术测定竹笋中六种硒形态[J]. 营养学报, 2014, 36(5): 494-498. DOI:10.13325/j.cnki.acta.nutr.sin.2014.05.018.
[23] KAMMAMKUMARAH S S, WRBEL K, WUILLOUD R G, et al.Studying the distribution pattern of selenium in nut proteins with information obtained from SEC-UV-ICP-MS and CE-ICP-MS[J].Talanta, 2005, 66(1): 153-159. DOI:10.1016/j.talanta.2004.10.010.
[24] 王丙涛, 谢丽琪, 林燕奎, 等. 高效液相色谱-电感耦合等离子质谱联用检测食品中的五种硒形态[J]. 色谱, 2011, 29(3): 223-227.DOI:10.3724/SP.J.1123.2011.00223.
[25] CROCHFORD D, HOLMES E, LINDON J C, et al. Statistical heterospectroscopy, an approach to the integrated analysis of NMR and UPLC-MS data sets: application in metabonomic toxicology studies[J]. Analytical Chemistry, 2006, 78(2): 363-371. DOI:10.1021/ac051444m.
[26] 李登科, 范国樑, 叶鸿宇, 等. 高效液相色谱-电感耦合等离子质谱分析烟草中硒形态[J]. 分析科学学报, 2016, 32(6): 836-840.DOI:10.13526/j.issn.1006-6144.2016.06.019.
[27] FRANCESCONI K A, SPRLING M. Speciation analysis with HPLC-mass spectrometry: time to take stock[J]. Analyst, 2005, 130(7):998-1001.
[28] 米秀博, 邵树勋, 汤鋆, 等. 湖北恩施地区天然富硒植物中硒形态的HPLC-ICP-MS分析[J]. 草业科学, 2014, 31(6): 1173-1177.DOI:10.11829/j.issn.1001-0629.2013-0436.
[29] 王欣, 幸苑娜, 陈泽勇, 等. 高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法检测富硒食品中6 种硒形态[J]. 分析化学研究报告, 2013, 41(11):1669-1674. DOI:10.3724/sp.j.1096.2013.30491.
[30] 曹玉嫔, 闫丽珍, 黄红丽, 等. 超声辅助提取结合高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用技术测定牛蒡和三七中硒形态[J]. 分析化学, 2015, 43(9): 1329-1334. DOI:10.11895/j.issn.0253-3820.150574.