青稞（Hordeum vulgare Linn. var. nudum Hook. F.），又称裸大麦、元麦，禾本科大麦属，是我国西北高寒地区极为重要的一种高原谷类作物[1-2]。青稞营养价值丰富，富含β-葡聚糖和阿拉伯木聚糖（arabinoxylan，AX）等非淀粉多糖，具有高蛋白质、高维生素、高纤维、低糖、低脂等特点[2-3]。AX主要存在于谷物麸皮中，质量分数可达干基的20%～25%，而胚乳及籽粒中含量相对较低，质量分数分别为1.5%～2.5%及4%～8%[4]。麸皮AX因与纤维素、木质素等存在共价结合[5]，水法提取效果较差，多采用碱法NaOH溶液、饱和Ba(OH)2、Ca(OH)2溶液等提取[6-9]，而使用阿拉伯木聚糖酶法亦可提高AX提取率[6]。李雪等[10]比较了不同碱性提取剂对小麦麸皮水不溶性AX的提取效果，发现以NaOH溶液为提取溶剂时，AX得率虽然不如饱和Ba(OH)2溶液提取得率高，但是提取时间短、成本低、工艺简单。Wang Jing等[11]采用超声波辅助酶法优化了小麦麸皮AX的提取工艺，其中得率为14.26%，超声波提高了酶处理效率，进而得率提高。Gong等[12]研究了3 种青稞麸皮中AX质量分数分别为14.21%、18.18%及21.06%，阿拉伯糖与木糖物质的量比值分别为0.83、0.76及0.58。国内外对AX的研究多集中于小麦、大麦及其加工副产物，而对青稞乃至青稞麸皮AX的研究还较少。
本研究采用碱法提取青稞麸皮AX，研究料液比、提取温度、提取时间、NaOH质量浓度对青稞麸皮AX提取的影响，通过响应面法优化AX的最佳提取工艺。采用高效凝胶渗透色谱（high-performance gel permeation chromatography，HPGPC）对青稞麸皮AX进行纯度鉴定，紫外吸收光谱、红外吸收光谱和高效阴离子色谱法对其结构进行初步分析，旨在为青稞麸皮AX的进一步开发应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
青稞麸皮（品种：肚里黄）产地为青海省贵南市，青稞麸皮粉碎后过40 目筛备用。
考马斯亮蓝试剂盒、耐高温α-淀粉酶、透析袋上海源叶生物科技有限公司；氢氧化钠、乙酸钠、硝酸钠、盐酸、硫酸、苯酚、三氟乙酸、乙醇、葡萄糖均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
SF-2000高速粉碎机 上海市药材有限公司；R206B旋转蒸发仪 上海申生科技有限公司；SHB-III循环水式真空泵 上海诚育仪器设备有限公司；TD5A-WS台式低速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；U1810紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；HWS24型电热恒温水浴锅 上海恒科学仪器有限公司；冷冻干燥机 上海比朗仪器制造有限公司；MDF-U52V超低温冰箱 日本Sanyo公司；Mili-Q超纯水系统 美国Millipore公司；PL203电子天平梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；ICS-5000离子色谱仪 美国戴安公司；Waters E2695高效液相色谱仪美国沃特世公司。
1.3 方法
1.3.1 青稞麸皮预处理
青稞麸皮粉中加入10 倍体积的体积分数95%乙醇溶液，不断搅拌，浸泡1 d，除去小分子、低聚糖、挥发油等物质[13]。将除去乙醇的青稞麸皮于60 ℃烘箱中过夜干燥。向脱脂后的青稞麸皮去离子水体系中（料液比1∶10（g/mL））加入耐高温α-淀粉酶，95 ℃水浴30 min[14]。60 ℃烘箱中过夜干燥得到脱脂除淀粉的青稞麸皮粉。
1.3.2 碱提工艺
青稞麸皮预处理粉→加入NaOH溶液→水浴振荡→离心→等电点除蛋白[15]→旋转蒸发浓缩→去离子水透析→乙醇沉淀→离心后水复溶→冷冻干燥→青稞麸皮AX。
1.3.3 AX得率计算
采用苯酚-硫酸比色法测定多糖的含量[16]，以葡萄糖制作标准曲线，测得提取液中多糖含量后，按下式计算样品中多糖得率（以预处理粉计）：
式中：C为提取液中多糖质量浓度/（μg/mL）；V为提取液体积/mL；n为提取液稀释倍数；m为预处理粉质量/g。
1.3.4 单因素试验
固定基本提取参数为料液比1∶15（g/mL）、提取温度25 ℃、提取时间2 h、NaOH质量浓度10 g/L。在基本提取参数下，分别考察料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL））、提取温度（25、35、45、55、65 ℃）、提取时间（1、2、3、4、5 h）、NaOH质量浓度（1、5、10、15、25 g/L）4 个单因素对AX得率的影响。
1.3.5 响应面试验
在单因素试验的基础上，以料液比、提取温度、提取时间、NaOH质量浓度为自变量，以AX得率为响应值，采用Box-Behnken响应面设计原理[17]，以青稞麸皮AX得率为指标，采用SAS V8.0分析软件设计四因素三水平响应面组合设计，对碱法提取AX工艺参数进行优化。试验因素与水平设计见表1。
表1 AX提取工艺优化响应面分析试验因素与水平
Table 1 Independent variables and their coded values tested in response surface analysis
1.3.6 青稞麸皮AX纯度鉴定
青稞麸皮AX经过多次乙醇沉淀后，采用HPGPC法对其进行纯度鉴定。色谱条件：Ultrahydrogel liner柱（7.8 mm×300 mm），示差折光检测器，柱温、检测器温度35 ℃，0.10 mol/L NaNO3溶液为流动相，流速0.6 mL/min。流动相溶解样品，配制青稞麸皮AX溶液2 mg/mL，过0.45 µm微孔过滤膜后，供进样分析。
1.3.7 青稞麸皮AX紫外光谱分析
配制青稞麸皮AX溶液0.5 mg/mL，于紫外-可见分光光度计中进行波长190～400 nm范围内紫外光谱扫描。
1.3.8 青稞麸皮AX红外光谱分析
将2.0 mg多糖干燥样品，与200 mg KBr研磨后压片，在4 000～400 cm－1区域内进行红外光谱扫描。
1.3.9 青稞麸皮AX单糖组成分析
采用带有脉冲安培检测器的高效离子交换色谱系统测定单糖组成[18]。取多糖样品5 mg于具塞管中，加入2 mol/L的三氟乙酸溶液2 mL于121 ℃水解2 h，氮吹除去过量的三氟乙酸，加水溶解定容后过0.45 µm微孔过滤膜，供进样分析[19]。
色谱柱：CarboPac PA20；流动相A：H2O；B：250 mmol/L NaOH溶液；C：1 mol/L CH3COONa溶液，三元梯度洗脱程序见表2；流速：0.5 mL/min；积分脉冲安培检测器。
表2 AX单糖组成分析梯度淋洗程序
Table 2 Gradient elution procedure for monosaccharide composition analysis of AX
2 结果与分析
2.1 青稞麸皮AX提取单因素试验结果
2.1.1 料液比对青稞麸皮AX得率的影响
图1 料液比对青稞麸皮AX得率的影响
Fig. 1 Effect of solid to solvent ratio on the extraction efficiency of AX
由图1可知，低溶剂用量时料液呈糊状，不利于AX的溶出，因而AX得率较低。随着溶剂用量的增加，麸皮粉与溶剂充分接触，加速AX的溶出。料液比1∶20（g/mL）前，AX得率随着溶剂用量的提高快速增大，料液比1∶20（g/mL）后得率增加趋于平缓，提高不再明显。鉴于后续旋蒸浓缩的易操作性及经济角度，确定最佳料液比为1∶20（g/mL）。
2.1.2 提取温度对青稞麸皮AX得率的影响
图2 提取温度对青稞麸皮AX得率的影响
Fig. 2 Effect of extraction temperature on the extraction efficiency of AX
由图2可知，青稞AX得率对提取温度依赖性较高，提取温度的升高显著提高了AX得率，低于55 ℃前随着温度的升高得率快速上升，高于55 ℃后得率趋于平缓。虽然较高温度利于AX的提取，但高温下得到的AX颜色明显加深，其中色素等杂质较高，不利于后续的纯化，此外，高温会导致多糖的降解。因此确定最佳提取温度为55 ℃。
2.1.3 提取时间对青稞麸皮AX得率的影响
图3 提取时间对青稞麸皮AX得率的影响
Fig. 3 Effect of extraction time on the extraction efficiency of AX
由图3可知，提取时间较短时，青稞麸皮中的AX尚未充分溶解出来，随着提取时间的延长，AX得率总体呈现上升趋势，但3 h后增速较慢，渐趋于平缓。因此从提取周期及能耗角度，确定最佳提取时间为3 h。
2.1.4 NaOH质量浓度对青稞麸皮AX得率的影响
图4 NaOH质量浓度对青稞麸皮AX得率的影响
Fig. 4 Effect of sodium hydroxide concentration on the extraction efficiency of AX
由图4可知，AX作为植物细胞壁多糖，不仅与材料中的木质素、纤维素等存在复杂的物理缠绕，与多糖、蛋白质之间还存在着以阿魏酰相连的共价键[20]，因而在极低的碱浓度下，绝大部分AX无法溶出，得率极低，这也是AX一般均采用碱提法提取的主要原因。NaOH的质量浓度为1～5 g/L时，AX得率增速较低，质量浓度为15 g/L时，得率显著提高，此后得率有所提高但较平缓。虽然溶剂浓度越大越利于物质的溶出，但因麸皮中含有较多色素物质，AX得率提高的同时也伴随着其他杂质（色素、蛋白、木质素等）的溶出。因此从后续除杂及经济角度，确定最佳NaOH质量浓度为15 g/L。
2.2 青稞麸皮AX提取的响应面分析
2.2.1 响应面试验设计与结果
响应面试验设计及结果见表3，共27 个试验点，其中包括24 个析因试验点，其自变量取值在各因素构成三维顶点，3 个中心试验点，用于估计试验误差。采用SAS V8.0软件对试验数据进行分析，得到青稞麸皮AX得率与各变量的二次多项方程的数学回归模型为：Y=14.256 67＋1.810 833X1＋0.22X2＋0.695X3＋0.269 167X4－2.138 333X12－0.307 083X22－0.932 083X32－0.858 333X42－0.122 5X1X2－0.137 5X1X3＋0.217 5X1X4－0.145X2X3－0.137 5X2X4－0.242 5X3X4。
由表4可知，该回归模型P值小于0.000 1，说明该模型极显著，其响应值与各试验因素之间存在显著的线性相关性；R2值为0.998 3，R2Adj值为0.996 3，说明该模型与试验值拟合较好，能很好地表述青稞麸皮AX提取过程中其得率随提取条件的变化规律；失拟项P值为0.332 4，不显著，同样确定了模型的可行性；自变量X1、X2、X3、X4的P值均小于0.000 1，说明它们对AX得率都有极显著的影响，而据自变量的F值可判断各因素对AX得率的影响由大到小依次为：X1＞X3＞X4＞X2；交互项X1X2、X1X3、X1X4、X2X3、X2X4、X3X4P值小于0.05，均影响显著，说明各因素对AX得率均有显著的交互作用。
表3 青稞麸皮AX提取工艺优化响应面分析试验设计及结果
Table 3 Experimental design and corresponding results for response surface analysis
表4 响应面模型方差分析
Table 4 Analysis of variance (ANOVA) for response surface quadratic regression model
2.2.2 响应面交互作用分析
响应面及等高线图可分析因素对AX得率的交互作用并确定最佳提取参数。等高线形状可反映各因素间交互作用的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，圆形则相反[11]。
图5 两因素交互作用对提取效果影响的响应面及等高线图
Fig. 5 Response surface and contour plots showing the interactive effects of factors on extraction efficiency
选取3 组交互作用作响应面图，其他两因素水平取0。由图5a可知，AX得率随着料液比和提取时间水平的增大而提高，但当两者达到一定组合后，AX得率趋于平缓，两者交互作用显著。可能是当料液比和提取时间达到一定值后，AX得到了充分提取，再之后水平提高AX得率增加不再显著。由图5b可知，在一定范围内，AX得率随着料液比及NaOH质量浓度水平的增加显著提高，而当两者达到一定组合后，AX得率随着组合条件的提高而呈缓慢下降趋势。可能是过高的NaOH质量浓度造成了部分多糖的降解。由图5c可知，在一定范围内，随着提取时间的延长，AX得率不断增加，当提取时间超过3.5 h后，AX得率趋于稳定；此条件下NaOH质量浓度对AX得率的影响与图5b类似，两者交互作用显著。
2.2.3 最佳工艺条件的确定及模型验证
回归模型预测的青稞麸皮AX最佳提取工艺参数为料液比1∶25（g/mL）、提取温度55 ℃、提取时间3 h、NaOH质量浓度15 g/L，在此条件下，AX得率可达14.27%。以确定的最佳工艺参数进行3 次青稞麸皮AX提取的平行实验，得到AX得率平均值为14.31%，接近回归方程所得AX得率的预测值。说明回归方程能较真实地反映各因素对青稞麸皮AX得率的影响，采用响应面分析方法优化得到的提取工艺参数准确可靠。
2.3 青稞麸皮AX的纯度鉴定
HPGPC因其快速、简便和高分辨率等优点，是目前多糖纯度鉴定最常用的方法。青稞麸皮AX的高效液相色谱图如图6所示，在其纯度检测中，只有一个对称的信号峰，可见其均一性较好，可以认为该青稞麸皮AX为单一组分的多糖聚合物。
图6 青稞麸皮AX HPGPC法纯度测定
Fig. 6 HPGPC analysis of AX
2.4 青稞麸皮AX的紫外光谱分析
图7 青稞麸皮AX紫外吸收光谱图
Fig. 7 UV absorption spectrum of AX
由图7可知，青稞麸皮AX在192 nm波长处有一个较强的吸收峰，这是多糖的特征吸收峰，在280 nm波长处有微弱的吸收，说明青稞麸皮AX中含有少量蛋白质，而在260 nm波长处无吸收峰，说明该多糖中不含核酸[20]。
2.5 青稞麸皮AX的红外光谱分析
图8 青稞麸皮AX红外吸收光谱图
Fig. 8 Fourier transform infrared spectrum of AX
由图8可知，3 429 cm－1处的吸收峰是—OH的伸缩振动吸收峰，宽吸收峰说明存在分子内和分子间氢键；2 927 cm－1处的吸收峰是—CH的伸缩振动吸收峰；1 647 cm－1处的吸收峰是—C＝O的伸缩振动；1 448 cm－1、1 399 cm－1处吸收峰是—CH2的变形吸收峰；1 340 cm－1处吸收峰是—CH弯曲振动吸收峰；1 038 cm－1处的则是醇羟基—OH的变角振动吸收峰。在893 cm－1处存在β-糖苷键的特征吸收峰，该多糖结构中存在β-多糖[12,21-24]，在864 cm－1处存在α-糖苷键的特征吸收峰，该多糖结构中存在α-多糖[25-26]。而据文献报道，AX结构的主链是由β-D-吡喃木糖残基经β-（1→4）糖苷键连接而成的木聚糖，在C2和C3位β-D-木糖残基可被α-L-呋喃阿拉伯糖取代，形成多分支结构[27]。说明青稞麸皮中提取的多糖符合AX的结构特征。
2.6 青稞麸皮AX的单糖组成
图9 AX的高效阴离子交换色谱
Fig. 9 High performance anion exchange chromatogram of AX
根据各单糖标样与多糖样品的保留时间确定其单糖的种类，根据各峰面积计算样品中各单糖的物质的量比。由图9可得，青稞麸皮AX主要由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖4 种单糖组成，单糖对应的物质的量比为11.61∶1∶3.62∶18，可以确定提取的青稞麸皮多糖中主要物质为AX，且杂质糖含量较低，阿拉伯糖与木糖物质的量比值为0.645。Izydorczyk等[28]对一种加拿大蜡质裸大麦糊粉层组织中AX的研究显示，阿拉伯糖-半乳糖-葡萄糖-木糖物质的量比为13.43∶1∶12.86∶20.33，阿拉伯糖与木糖物质的量比值为0.66，该实验中阿拉伯糖与木糖物质的量比值与本实验比值相近，但其中葡萄糖含量较高。Skendi等[29]发现，小麦中提取的多糖阿拉伯糖与木糖物质的量比值在0.57～0.71之间，而Rattan等[30]发现，小麦粉中阿拉伯糖与木糖物质的量比值在0.61～0.68之间，可见来源不同时其值会有不同。
3 结 论
本实验通过Box-Behnken试验设计建立了料液比、提取温度、提取时间及NaOH质量浓度4个影响因素与响应值青稞麸皮AX得率相互作用的数学模型，并对试验结果进行了模拟和预测，优化后的最佳提取工艺为料液比1∶25（g/mL）、提取温度55 ℃、提取时间3 h、NaOH质量浓度15 g/L。在此条件下AX得率为14.31%，与理论值14.27%无显著差异。提取工艺的优化为青稞麸皮AX的进一步理化研究奠定了基础。对青稞麸皮AX的结构做了初步分析，HPGPC结果表明青稞麸皮AX均一性较好，可认为其为单一组分的多糖聚合物；紫外光谱检测结果表明青稞麸皮AX中含有微量蛋白质，不含核酸；红外光谱分析结果表明该多糖具有多糖特征吸收，并且含有α、β-糖苷键结构；高效离子交换色谱结果表明青稞麸皮AX的主要单糖组成为阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖，阿拉伯糖-半乳糖-葡萄糖-木糖物质的量比为11.61∶1∶3.62∶18，阿拉伯糖与木糖物质的量比值为0.645。阿拉伯糖与木糖物质的量比值一定程度上反映了多糖结构分支程度，谷物中该比值在0.3～1.1之间，而大麦糊粉层中阿拉伯糖与木糖物质的量比值在大麦AX提取物中最低，在0.56～0.66之间，反映了大麦糊粉层AX的分支度低[31]。本实验中青稞麸皮AX主要单糖组成为阿拉伯糖和木糖，分支度较低，与前人对大麦中AX的研究结果基本一致。
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