苯并（a）芘（benzo(a)pyrene，BaP）是由5 个苯环构成的稠环化合物，具有较强的致癌性、致畸性、致突变性[1-2]，是世界卫生组织确定的三大致癌物质之一，其普遍存在于环境与食品中，可通过皮肤、呼吸、饮食等多种途径进入人体[3-4]。在一些植物油的制备过程中会产生大量的BaP[5-8]，对此，各国对植物油中BaP含量进行了严格的控制，其中欧盟较为严格，规定植物油中BaP的最大限量为2 μg/kg；国际食品法典委员会（Codex Alimentarius Commission，CAC）规定食用油脂中BaP的最大限量为5 μg/kg；而我国食用植物油卫生标准规定最大限量为10 μg/kg，相对较为宽松[9-10]。因此，建立一种简便、快速、准确的BaP检测方法成为研究的重点。
目前，检测BaP的方法主要有荧光分析法、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法、气相色谱-质谱联用法及酶联免疫吸附法[11-22]等，前3 种方法虽稳定性好、灵敏度高，但样品处理繁琐、仪器成本高、消耗时间长；酶联免疫吸附法虽简单快速但其灵敏度较低。而电化学方法具有操作简单、成本低、速度快、灵敏度高等特点，受到了广大研究人员的青睐，成为食品安全快速检测技术方法的主流之一[23-25]。Du Chunyuan等[26]采用微分脉冲伏安法，研究了在乙腈-水溶液中BaP在裸玻碳电极（glassy carbon electrode，GCE）上的氧化还原性质，建立了一种用于实际水样中BaP检测的电化学分析方法，检测限为0.67 nmol/L。Keskin等[27]采用方波溶出伏安法进行测定，发现在醋酸缓冲液中BaP在石墨电极上出现了一个明确的伏安响应，检测限为0.002 7 μmol/L。Yardim等[28]采用吸附溶出伏安法，研究了在添加表面活性剂的水溶液中BaP在掺硼金刚石电极上的电化学氧化性质，检测限为2.8 nmol/L。但目前研究BaP在修饰电极上的氧化还原特性的还很少。
本实验采用新型材料石墨烯（graphene，GS）和壳聚糖（chitosan，CS）构建电化学纳米传感器，研究了BaP在修饰电极表面的氧化还原性质，建立了一种快速检测植物油中痕量BaP的纳米传感器方法，并将其应用在实际样品中。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
小磨香油 石家庄市购。
BaP（96%，CAS：50-32-8） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；GS 北京德科岛金科技有限公司；乙腈（分析纯） 天津市大茂化学试剂厂；正己烷（分析纯） 天津市津东天正精细化学试剂厂；甲醇（色谱纯） 天津市康科德科技有限公司。
1.2 仪器与设备
LK98BII型微机电化学分析系统 天津兰力科化学电子高技术有限公司；三电极系统、电解杯 上海CHI仪器公司；LC-10A型HPLC仪 日本岛津公司；FA 2204型电子分析天平 上海菁海仪器有限公司；KQ 2200型超声波清洗仪 昆山市超声仪器有限公司；RE52CS-1型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；TGL-16C型高速离心机 上海安亭科学仪器厂；GZX-9070 MBE型电热鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；85-2型控温磁力搅拌器 金坛市恒丰仪器制造有限公司。
1.3 方法
1.3.1 CS-GS修饰液的制备
取0.02 g CS加入到100 mL体积分数1%的乙酸溶液中，持续搅拌至无气泡，得到透明的CS溶液，于4 ℃条件下贮存。取0.01 g GS加入10 mL N,N-二甲基甲酰胺，超声处理20 min，制得均匀分散的GS悬浮液。取5 mL GS悬浮液加入到5 mL CS溶液中，超声处理30 min，使GS均匀地分散在CS溶液中，得到CS-GS修饰液，于4 ℃贮存备用。
1.3.2 电化学传感器的制备
先将GCE用Al2O3粉末（粒径 0.05 μm）打磨抛光，至电极表面成镜面，再依次于体积分数为50%的硝酸溶液、无水乙醇和去离子水中各超声处理3 min，然后在1 mol/L H2SO4溶液中采用快速循环伏安法（电位：－0.5～0.8 V；扫描速率：500 mV/s）扫描至稳定的循环伏安图，从而对GCE进行活化，最后用N2吹干，备用。
取上述修饰液5 μL滴涂到已经过预处理的GCE表面，在红外线灯下烘干，备用。
1.3.3 电化学传感器测定BaP
电化学分析法的测定均采用三电极系统：Φ 3 mm经修饰的玻碳圆盘电极为工作电极、Ag/AgCl为参比电极、铂丝电极为辅助电极，并采用线性扫描伏安法进行测定，扫描电位为0.5～1.3 V，扫描速率为30 mV/s。
电化学检测包含两部分：第1部分是BaP在电极表面的富集，将CS-GS/GCE在开路状态下浸没在含有BaP的乙腈-水（1∶3，V/V）溶液中，并用磁力搅拌器不断搅拌；第2部分是BaP的测定，将富集了BaP的CS-GS/GCE转移到乙腈-水的空白溶液（0.2 mol/L的LiClO4溶液作为电解质，0.1 mol/L的硫酸溶液调节pH值）中，采用循环伏安法与线性扫描伏安法进行测定，测定3 次，并记录相应的峰电流值，并取其平均值作为该BaP浓度所对应的氧化电流值Ip。
1.3.4 植物油样品中BaP的测定
1.3.4.1 样品预处理
称取（1.0±0.05）g香油，然后加入10 mL乙腈饱和正己烷溶液，超声处理30 min后移至分液漏斗中，取30 mL正己烷饱和乙腈萃取3 次，合并下层乙腈层后，用旋转蒸发仪蒸发至干，接着用乙腈分3 次淋洗旋蒸瓶并定容至1 mL。样品提取液以5 000 r/min离心10 min后经0.45 μm滤膜过滤后进行检测。
1.3.4.2 电化学传感器法测定
按照1.3.3节的方法进行测定，将3 次测定结果的平均值带入标准曲线中得到样品中BaP含量。
1.3.4.3 HPLC法测定
色谱条件[29-30]：C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（90∶10，V/V）；流速为1.0 mL/min；柱温为35 ℃；进样量为20 μL；激发波长为384 nm，发射波长为406 nm。
准确称取25.0 mg BaP标准品于100 mL 容量瓶中，用乙腈定容，保存于4 ℃条件下备用。配制梯度浓度为10、20、50、100、200、500、1 000 nmol/L的标准溶液，取20 μL标准溶液进样，记录其HPLC图谱，根据所得峰面积与对应的BaP浓度绘制标准曲线。取上述处理好的样品提取液20 μL，进行HPLC检测，取3 次峰面积的平均值作为该样品的图谱峰面积，代入标准曲线计算样品中BaP浓度，并与电化学检测方法的结果进行对比。
1.4 数据处理与统计分析
以上测定均为3 组平行实验，结果取3 组实验数据的平均值。运用SPSS 18.0软件进行数据统计分析，采用单因素方差分析进行显著性差异分析（P＜0.05），实验数据图利用 OriginLab Origin Pro v9.0软件绘制。
2 结果与分析
2.1 BaP在不同修饰电极表面的氧化还原行为
采用快速循环伏安法，研究BaP在裸GCE（a）、CS/GCE（b）、GS/GCE（c）、CS-GS/GCE（d、e）上的氧化还原行为，结果见图1。BaP在各GCE上均出现了一个明显的氧化峰，电位也均在1.0 V附近，而没有出现还原峰，说明该反应是不可逆的；修饰了CS后，其氧化峰电流比裸GCE减小了17.37%，这是由于CS在GCE表面形成了一层膜，阻碍了电子之间的传递；而修饰了GS后，峰电流明显增大，增大了3.85 倍，这是由于GS具有相当大的比表面积以及突出的电学性质，为电子与电极之间的电子传递提供了一个微通道；当修饰了CS-GS后，峰电流进一步增大，增大了4.71 倍，这可能是由于CS极好的成膜性将更多的GS固定在GCE的表面。所以CS-GS/GCE具有良好的电化学性质。根据图1d、e比较，可以看出BaP的氧化响应电流随着BaP浓度的增大而增大。
图1 不同电极的循环伏安图
Fig. 1 Cyclic voltammograms of different electrodes
2.2 实验条件的优化
2.2.1 修饰液配比与修饰量
修饰液的配比与修饰量对纳米传感器的电子传递具有重大的影响。配制CS溶液与GS悬浮液体积比为1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1的修饰液，取5 μL修饰经处理的GCE，采用线性扫描伏安法测定BaP的氧化电流，结果如图2A所示。当CS溶液与GS悬浮液体积比为1∶2时，峰电流达到最大值，之后在一定范围内随着CS的增加峰电流逐渐减小，这是由于CS的成膜性质会阻碍电子传递的结果。所以选择修饰液的配比为1∶2。分别将1、3、5、7、9 μL的CS-GS修饰液滴涂到GCE上，采用线性扫描伏安法测定其电流的大小，结果如图2B所示。随着修饰量的增加，峰电流逐渐增加，当修饰量为5 μL时，峰电流达到最大，然后随着修饰量的增大，峰电流逐渐减小，这是因为修饰膜太厚影响电子传递的结果。
图2 修饰液配比（A）和修饰量（B）对电化学传感器电流的影响
Fig. 2 Effects of composition and volume of modified solution on response current of electrochemical sensor
2.2.2 电解质浓度
采用线性扫描伏安法，研究BaP在不同LiClO4浓度（0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mol/L）的底液条件下的氧化响应电流的变化，结果如图3所示，一开始，峰电流随着电解质浓度的增大而显著增大，当LiClO4浓度为0.2 mol/L时，氧化峰电流值达到最大，LiClO4的浓度继续增大，其峰电流的变化趋向平稳，说明电子之间的传递达到了平衡，导电率达到了最大。所以选择电解质浓度为0.2 mol/L。
图3 电解质浓度对电化学传感器电流的影响
Fig. 3 Effect of electrolyte concentration on response current of electrochemical sensor
2.2.3 硫酸浓度
硫酸浓度与BaP在溶液中的稳定性有着直接的联系，对峰电流也有显著影响。在保证其他实验条件一致的情况下，只改变底液中硫酸浓度（0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mol/L），采用线性扫描伏安法进行BaP的测定，结果如图4所示。BaP的响应电流先随着硫酸浓度的增加而增大，这是由于硫酸可提供质子以促进BaP发生氧化反应；当硫酸浓度为0.1 mol/L时，峰电流的值达到最大，继续添加硫酸，其对峰电流的影响不大，说明此时BaP发生氧化反应所需要的质子的量已达到最大，所以选取硫酸浓度为0.1 mol/L。
图4 硫酸浓度对电化学传感器电流的影响
Fig. 4 Effect of sulfuric acid concentration on response current of electrochemical sensor
2.2.4 富集时间
富集时间与电极表面吸附BaP的多少有关，影响着电化学传感器测定的准确性。配制相同BaP浓度的溶液，富集时间分别为5、10、15、20、25 min，在相同的底液中采用线性扫描伏安法进行测定，如图5所示。在5～15 min范围内峰电流随着富集时间的延长而增大，当富集时间达到15 min后，峰电流的变化较小，说明BaP在电极表面的富集达到了饱和状态。实验选择富集时间为15 min。
图5 富集时间对电化学传感器电流的影响
Fig. 5 Effect of enrichment time on response current of electrochemical sensor
2.3 电化学测定BaP的分析性能
分别配制0、20、40、60、80、100、200、400 nmol/L的BaP标准溶液，按照1.3.4节进行测定，每个浓度均测定3 次，取其平均值为该浓度的响应电流值，不同浓度BaP的线性扫描曲线，如图6所示。BaP的氧化反应电流Ip值随BaP浓度的增大而增大，且在BaP浓度范围为0～100 nmol/L时Ip值与CBaP之间的关系满足线性关系方程：Ip= 0.116 2CBaP＋22.926 2，线性相关系数R2=0.997 8，其检测限为0.103 nmol/L（RSN=3）。可见，本实验构建的电化学传感器具有较好的灵敏度，可作为一种快速测定BaP的分析方法。
图6 不同浓度BaP的线性扫描曲线
Fig. 6 Linear sweeping curves of BaP at different concentrations
2.4 电化学传感器的抗干扰性、稳定性和重复性
考察与BaP性质相同的脂溶性抗氧化剂（VE、TBHQ和PG）对BaP氧化响应电流的影响。分别配制0.1 mol/L的VE、TBHQ和PG溶液，溶剂为乙醇，在4 ℃条件下保存备用。在其他条件相同的情况下，采用线性扫描伏安法分别测定空白的VE、TBHQ和PG溶液、空白的BaP标准溶液以及分别添加3 种抗氧化剂的BaP标准溶液的电化学氧化响应电流，结果如表1所示。该电化学传感器对3 种脂溶性抗氧化剂均可吸附，但其峰位置均在0.35～0.65之间，而BaP的峰位置在1.03左右，互相不影响；且在分别添加VE、TBHQ和PG后，BaP的氧化响应电流变化仅为6.15%、4.72%、4.07%。说明该电化学传感器的抗干扰性较好。
表1 电化学传感器抗干扰性测定结果
Table 1 Interference resistance of electrochemical sensor
分别制备3 批电化学传感器（每批3 支），第1批当天进行测定；第2批3 d后进行测定；第3批7 d后进行测定；结果表明，在相同条件下测定同一样品，同一批次的变化率均在3.41%以下，不同批次的变化率不超过6.77%，说明该电化学传感器的稳定性和重复性较好。
2.5 香油样品中BaP的测定
按照1.3.4.1节处理样品，得到样品提取液，分别采用纳米电化学传感器法和HPLC法检测样品中BaP的含量，并进行加标回收实验，按照1.3.5节计算其平均值和相对标准偏差，结果如表2所示，本法测得样品中BaP含量为22.96 nmol/L，而HPLC法测得23.04 nmol/L，二者相差仅0.35%；在分别加有5、10、20 nmol/L的BaP标准品后，本法的回收率在98.51%～100.57%之间，HPLC法则在98.22%～100.58%；另外，两种方法的相对标准偏差均在2.15%～3.16%之间。所以二者基本一致，电化学传感器法快捷方便。
表2 香油样品中BaP回收率测定的结果
Table 2 Recovery of BaP from spiked sesame oil
测得市售香油中BaP的含量约为5.76 μg/kg，在我国限量标准（10 μg/kg）之内，但超过了欧盟标准（2 μg/kg）与CAC规定的限量（5 μg/kg）。
3 结 论
BaP具有致癌、致畸、致突变的性质，对身体的危害极大，快速简便的检测方法是及时减小其危害的基本前提。本实验用具有极好成膜性的CS与大比表面积的纳米粒子GS修饰GCE，优化了GCE的导电性能，基于BaP的电化学氧化还原性质，构建了一种速率快、稳定性强、灵敏度高的电化学传感器，并应用于实际样品中BaP的测定。采用循环伏安法与线性扫描伏安法测定BaP的氧化还原电流，发现该反应为不可逆反应，其氧化电流与BaP浓度在0～100 nmol/L范围内呈线性关系。本实验还对其修饰测定条件进行了优化，确定了数学模型、线性范围、检测限等参数，实现了BaP的快速、准确、现场检测。此外，该传感器制作简单、稳定好、重复性好，检测过程抗干扰性强、检测时间短，在食品中BaP快速检测中的开发前景广阔。
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