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复合酶法提取石榴籽多糖的工艺优化

王占一1，张立华1，王玉海1，戴博2，郑丹丹1，王飞1

（1.枣庄学院生命科学学院，山东枣庄 277160；2.空军总医院药学部，北京 100142）

摘要：探讨应用复合酶法提取石榴籽多糖的最佳工艺条件。以多糖得率为考察指标，在单因素试验基础上，通过D-最优混料试验设计优化复合酶配比，Box-Behnken试验设计优化得出影响因素的最佳参数水平，进而得出最佳工艺条件。结果显示：复合酶最优配比为果胶酶24.2%、纤维素酶67.2%、甘露聚糖酶8.6%；并以此参数为基础，得到复合酶法提取石榴籽多糖的最佳工艺条件为液固比20∶1（mL/g）、介质pH 4.5、酶解温度48.5 ℃、酶解时间287 min，在此条件下，石榴籽多糖得率为2.83%。

关键词：石榴籽；多糖；复合酶法；D-最优混料设计；响应面分析法；提取工艺

Optimization of Enzymatic Extraction of Polysaccharides from Pomegranate Seeds with Mixed Enzymes

WANG Zhanyi1, ZHANG Lihua1, WANG Yuhai1, DAI Bo2, ZHENG Dandan1, WANG Fei1

(1. College of Life Sciences, Zaozhuang University, Zaozhuang 277160, China;

2. Department of Pharmacology, General Hospital of Air Force, Beijing 100142, China)

Abstract: In this study, we optimized the conditions for enzymatic extraction of polysaccharides from pomegranate seeds with a mixed enzyme preparation consisting of pectinase, cellulase and mannase. The optimization of the mixing ratio of the three enzymes was performed by the combined use of one-factor-at-a-time method and D-optimal mixture design. Thereafter, the enzymatic extraction conditions were optimized by response surface methodology using Box-Behnken design. The yield of polysaccharides was taken as response for both optimizations. It was shown that the optimal combination of enzymes were 24.2% pectinase, 67.2% cellulase and 8.6% mannose and that the optimal extraction conditions were determined as follows: liquid/solid ratio, 20:1 (mL/g); initial pH, 4.5; hydrolysis temperature, 48.5 ℃; and hydrolysis time, 287 min. Under these conditions, the yield of polysaccharides was 2.83%.

Key words: pomegranate seeds; polysaccharide; enzymatic extraction with mixed enzymes; D-optimal mixture design; response surface analysis; extraction process

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618004

中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2016）18-0019-07

引文格式：

王占一, 张立华, 王玉海, 等. 复合酶法提取石榴籽多糖的工艺优化[J]. 食品科学, 2016, 37(18): 19-25. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618004. http://www.spkx.net.cn

WANG Zhanyi, ZHANG Lihua, WANG Yuhai, et al. Optimization of enzymatic extraction of polysaccharides from pomegranate seeds with mixed enzymes[J]. Food Science, 2016, 37(18): 19-25. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618004. http://www.spkx.net.cn

石榴（Punica granatum L.）是亚热带地区常见树种，全球各地区均有广泛分布[1]。石榴籽是石榴果品的主要副产品之一，近年来，关于石榴籽中生物活性成分的研究已有相关报道，杨丽娜等[2-3]研究证实，石榴籽提取物中多糖及多酚类成分，具有较强的清除自由基能力，对四氯化碳诱导小鼠肝损伤保护作用效果明显。在国内，已经有学者对石榴籽多糖提取过程进行研究，如郭传琦等[4]采用正交试验设计法对石榴籽中多糖提取工艺条件进行优化，发现石榴籽中多糖成分含量较高，然而，同类的文献多限于应用各类溶剂，以不同机械力辅助提取石榴籽多糖类成分，工艺过程中，存在着得率较低、产物杂质多、有机溶剂难去除等缺点。舒红英[5]、汪殿蓓[6]
等研究发现，采用复合酶法提取植物中有效成分具有操作简单、提取效率高、条件温和、环境友好的特点。但是，有关复合酶法提取石榴籽中多糖领域的研究，国内鲜见文献报道。因此，本研究以鲁南地区产石榴籽为实验材料，果胶酶、纤维素酶和甘露聚糖酶作为复合酶组成[6-7]，通过D-最优混料设计中的单纯形质心设计结合响应面分析法中的Box-Behnken试验设计，优化复合酶法提取石榴籽多糖的最佳工艺条件，以期为工业化大生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

野生石榴采自鲁南地区峄城“万亩石榴园”核心产区，经枣庄学院李思健副教授鉴定为正品石榴科石榴（Punica granatum L.），石榴籽经过手工搓洗，低温干燥后，粉碎，备用。

D-无水葡萄糖对照品（批号：110833-201205）中国
食品药品检定研究院；果胶酶（酶活力≥1 100 U/g）、
纤维素酶（酶活力≥15 000 U/g）、甘露聚糖酶（酶活力≥
1 800 U/g）国药集团化学试剂有限公司；石油醚（沸点：60～90 ℃）、苯酚、浓硫酸、3,5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、氢氧化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾（均为分析纯）天津市大茂化学试剂厂；蒸
馏水枣庄学院生物学省级实验教学示范中心。

1.2 仪器与设备

AL204型电子分析天平梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；759型紫外-可见分光光度计上海奥谱勒仪器有限公司；FW135型多功能粉碎机天津泰斯特仪器有限公司；BPZ-6050型真空干燥箱上海和呈仪器制造有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅上海蓝凯仪器仪表有限公司；SH2-Ⅲ型循环水真空泵、RE-2000A型旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂；PHS-3C型数显酸度计杭州奥利龙仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖含量测定

精密称取D-无水葡萄糖对照品100 mg，用蒸馏水定容至500 mL，即得0.2 mg/mL的葡萄糖储备液。总糖质量浓度测定采用苯酚-浓硫酸法[8-9]。将储备液制备成质量浓度分别为0、10、20、30、40、50、60、70 μg/mL的稀释液，按照文献方法处理后，在490 nm波长处测定吸光度（A）。以葡萄糖质量浓度作为横坐标，A为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为：A=0.266 1C－0.007 1，R2=0.999 1，总糖质量浓度线性范围：0～2.8 μg/mL。还原糖质量浓度测定采用二硝基水杨酸比色法[10-11]。将上述葡萄糖储备液稀释10 倍，按照文献方法处理后，在540 nm波长处测定吸光度（A）。以葡萄糖质量浓度作为横坐标，A为纵坐标绘制标准曲线。回归方程为：A=0.656 9C－0.003 5，R2=0.999 3，还原糖质量浓度线性范围：0～0.96 μg/mL。多糖质量浓度计算见公式（1）[11-12]：

（1）

式中：CD为多糖质量浓度/（μg/mL）；CZ为总糖质量浓度/（μg/mL）；CH为还原糖质量浓度/（μg/mL）。

1.3.2 样品处理

准确称取低温干燥至恒质量，并粉碎至规定粒度的石榴籽粉末5.0 g，石油醚脱脂后，置于三颈圆底烧瓶中，按照试验设计，加入不同配比的复合酶（果胶酶-纤维素酶-甘露聚糖酶）至设定加酶量，再加入设定pH值磷酸盐缓冲液至设定液固比例，于设定温度水浴锅中，不停搅拌，酶解反应至设定时间[13-15]。反应结束后，立即在沸水中灭酶10 min，抽滤，滤液定容至250 mL，作为供试品溶液。按照1.3.1节方法测定多糖质量浓度，按公式（2）、（3）计算样品中多糖含量（m）及得率（Y）。

m/μg＝（CZ1－CH1）×V （2）

（3）

式中：CZ1为样品中总糖质量浓度/（μg/mL）；CH1为样品中还原糖质量浓度/（μg/mL）；V为样品溶液体积/mL；M为石榴籽粉末质量/mg。

1.3.3 单因素试验设计

单因素试验中，复合酶选用等比例混合酶（果胶酶∶纤维素酶∶甘露聚糖酶=1∶1∶1）[6-7]，考察加酶量（质量分数为4.0%、4.5%、5.0%、5.5%、6.0%）、液固比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，mL/g）、介质pH值（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5）、酶解温度（35、40、45、50、55 ℃）和酶解时间（210、240、270、300、330 min）对石榴籽多糖提取效果的影响。每组试验重复3 次，结果取平均值。

1.3.4 D-最优混料设计优化复合酶配比

复合酶配比确定试验中，以果胶酶、纤维素酶和甘露聚糖酶为复合酶组成，采用D-混料设计中的单纯型质心设计[16-17]，在单因素试验基础上，对3 种酶的比例进行优化。D-最优混料设计试验中，设定加酶量5%、液固比20∶1、介质pH 4.5、酶解温度45 ℃、酶解时间270 min。

1.3.5 Box-Behnken试验设计优化最佳提取工艺

通过对D-最优混料试验设计结果的分析，在单因素试验和D-最优混料设计试验基础上，选取液固比（X1）、介质pH值（X2）、酶解温度（X3）和酶解时间（X4）作为Box-Behnken试验设计的4个自变量，通过响应面试验设计建立石榴籽多糖得率（Y）与自变量之间的函数关系，进而寻求复合酶法提取石榴籽多糖的最佳提取工艺条件[18-19]。Box-Behnken试验设计中，设定复合酶组成为D-最优混料设计试验结果所得到的数值，加酶量为5%。Box-Behnken试验因素与水平见表1。

表 1 Box-Behnken设计因素与水平

Table 1 Coded levels for independent variables used in Box-Behnken design

因素	水平
因素	－1	0	1
X1液固比（mL/g）	15∶1	20∶1	25∶1
X2介质pH	3.5	4.5	5.5
X3酶解温度/℃	40	45	50
X4酶解时间/min	240	270	300

1.4 数据统计分析

本实验中D-最优混料设计和Box-Behnken试验设计采用Design-Expert 8.0.5统计分析软件，图形制作采用Excel和Origin Pro 8.0数据处理软件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 加酶量对石榴籽多糖得率的影响

固定液固比20∶1、介质pH 4.5、酶解温度45 ℃、酶解时间270 min，考察加酶量对石榴籽多糖得率的影响，结果见图1。

图 1 加酶量对石榴籽多糖得率的影响

Fig. 1 Effect of enzyme dosage on the yield of polysaccharides

由图1可知，加酶量在4%～5%范围内，随着加酶量的增大，石榴籽多糖得率明显提高，当加酶量为5%时，石榴籽多糖得率达到2.26%。继续增大加酶量，多糖得率不再发生显著变化，考虑生产成本问题，确定加酶量为5%。

2.1.2 液固比对石榴籽多糖得率的影响

固定加酶量5%、介质pH 4.5、酶解温度45 ℃、酶解时间270 min，考察液固比对石榴籽多糖得率的影响，结果见图2。

由图2可知，液固比在10∶1～20∶1范围内，随着溶剂用量的增大，石榴籽多糖得率呈明显升高趋势，当液固比为20∶1时，多糖得率达到2.27%。继续增大液固比，多糖得率反而略有降低，原因是溶剂量过大，在后续处理中，有效成分会有损失，因此，液固比确定为20∶1。

图 2 液固比对石榴籽多糖得率的影响

Fig. 2 Effect of liquid/solid ratio on the yield of polysaccharides

2.1.3 介质pH值对石榴籽多糖得率的影响

固定加酶量5%、液固比20∶1、酶解温度45 ℃、酶解时间270 min，考察介质pH值对石榴籽多糖得率的影响，结果见图3。

图 3 介质pH值对石榴籽多糖得率的影响

Fig. 3 Effect of medium pH on the yield of polysaccharides

由图3可知，随着介质pH值的升高，石榴籽多糖得率逐渐提高，当介质pH值为4.5时，多糖得率达到最大值。随后，随着介质pH值的升高，多糖得率呈下降趋势。原因是，应用生物酶法提取材料中的有效成分，复合酶的生物效应受介质pH值影响较大，只有在最佳pH值条件下，生物酶才能发挥最佳效应，因此选择介质pH 4.5左右。

2.1.4 酶解温度对石榴籽多糖得率的影响

固定加酶量5%、液固比20∶1、介质pH 4.5、酶解时间270 min，考察酶解温度对石榴籽多糖得率的影响，结果见图4。

图 4 酶解温度对石榴籽多糖得率的影响

Fig. 4 Effect of hydrolysis temperature on the yield of polysaccharides

由图4可知，随着酶解温度的升高，石榴籽多糖得率逐渐提高，当酶解温度为45 ℃时，多糖得率达到最大值。随后，随着酶解温度的升高，多糖得率呈下降趋势。原因是复合酶的生物效应受酶解温度影响较大，只有在最佳酶解温度条件下，生物酶才能发挥最佳效应，因此酶解温度应控制在45 ℃左右。

2.1.5 酶解时间对石榴籽多糖得率的影响

固定加酶量5%、液固比20∶1、介质pH 4.5、酶解温度45 ℃，考察酶解时间对石榴籽多糖得率的影响，结果见图5。

图 5 酶解时间对石榴籽多糖得率的影响

Fig. 5 Effect of hydrolysis time on the yield of polysaccharides

由图5可知，酶解时间在210～270 min之间时，随着酶解时间的延长，石榴籽多糖得率不断提高，当酶解温度达到270 min时，多糖得率达到2.26%。继续延长酶解时间，多糖得率升高趋势不明显，考虑到实际生产问题，控制酶解时间为270 min左右。

2.2 D-最优混料设计试验结果

本试验通过D-最优试验设计，确定试验因素空间内的候选点，组成14 个模拟组合，确定复合酶中果胶酶（A）、纤维素酶（B）和甘露聚糖酶（C）用量范围，进而确定复合酶的最优配比[16-17]，以石榴籽多糖得率（Y）作为预测响应值，每个试验号平行试验3 次，取平均值作为试验结果，试验方案及结果见表2，因素方差分析结果见表3。

表 2 D-最优混料试验设计与结果

Table 2 D-optimal mixture design and corresponding results

试验号	A果胶酶用量	B纤维素酶用量	C甘露聚糖酶用量	Y石榴籽多糖得率/%
1	0	0	1	1.96
2	1	0	0	1.71
3	0	1	0	2.23
4	1/3	1/3	1/3	2.28
5	1/2	0	1/2	2.01
6	2/3	1/6	1/6	2.11
7	1/2	1/2	0	2.31
8	0	1/2	1/2	2.35
9	1/2	1/2	0	2.32
10	0	0	1	2.15
11	1/6	2/3	1/6	2.31
12	1	0	0	1.80
13	0	1	0	2.29
14	1/6	1/6	2/3	1.82

表 3 D-最优混料设计方差分析结果

Table 3 Results of analysis of variance for D-optimal mixture design

来源	平方和	自由度	均方	F值	P值
模型	0.51	5	0.10	28.83	＜0.000 1
线性混合	0.33	2	0.16	46.73	＜0.000 1
AB	0.13	1	0.13	38.16	0.000 3
AC	0.01	1	0.01	2.87	0.128 4
BC	0.03	1	0.03	8.38	0.020 1
残差	0.028	8	0.003 5
失拟项	0.004 2	4	0.001 1	0.18	0.939 1
误差项	0.024	4	0.006
总离差	0.54	13

应用分析软件对表2中的数据进行回归拟合，得到石榴籽多糖得率（Y）对影响因素A、B、C的回归方程为：

Y=1.76A＋2.25B＋2.05C＋1.20AB＋0.40AC＋0.68BC （4）

由表3的方差分析结果可以看出，整个模型
（P＜0.000 1）达到极显著水平，失拟项（P=0.939 1＞0.05）
不显著，表明二次方程模型是显著的，复相关系数R2=0.947 4，决定系数R2Adj=0.914 6，变异系数CV=2.77，数值较小，表明应变量与全体自变量之间的多元回归关系显著，回归方程对试验数据拟合情况良好，试验误差较小，试验精度较高[19-21]，因此，可以用该模型对复合酶配比进行优化。

图 6 复合酶配比对石榴籽多糖得率的三角曲面图与等高线图

Fig. 6 Triangular surface and contour plot showing the in the effect of the mixing ratio of three enzymes on the yield of polysaccharides

以石榴籽多糖得率（Y）为响应值，绘制3 个自变量之间交互影响的响应面图和等高线图，见图6。从图6可以看出，响应面图为开口向下的平滑曲面，说明曲面上存在着石榴籽多糖得率的最大响应值，能够得到3 种酶最佳配比值[16-17]。等高线图中，3 种酶线性混合交互作用显著
（P＜0.000 1），果胶酶用量（A）和纤维素酶用量（B）、纤维素酶用量（B）和甘露聚糖酶用量（C）之间交互作用显著（P＜0.05），3 种酶对于多糖得率的影响先后顺序为：B＞A＞C，而这种影响直接体现在复合酶最优配比上。

通过统计分析软件得到复合酶最优配比为：果胶酶24.2%、纤维素酶67.2%、甘露聚糖酶8.6%。为了对模型进行验证，在上述最优复合酶配比条件下进行3 次平行验证实验，测得石榴籽多糖平均得率为2.35%，与模型预测值2.36%较为接近，说明应用D-最优混料试验设计得到的复合酶最优配比是可信、可靠的。

2.3 Box-Behnken试验设计结果

本试验以液固比、介质pH值、酶解温度和酶解时间为试验因素，以石榴籽多糖得率（Y）作为预测响应值，每个试验平行测定3 次，取平均值作为试验结果，根据Box-Behnken试验设计原理在四因素三水平上对复合酶法提取石榴籽多糖工艺条件进行优化，试验安排及结果见表4，方差分析结果见表5。

表 4 Box-Behnken试验设计与结果

Table 4 Box-Behnken design and corresponding results

试验号	X1液固比	X2介质pH	X3酶解温度	X4酶解时间	Y石榴籽多糖得率/%
1	1	1	0	0	2.71
2	0	0	1	1	2.83
3	0	0	1	－1	2.76
4	0	0	0	0	2.83
5	0	－1	0	1	2.72
6	－1	0	0	－1	2.81
7	1	0	0	1	2.79
8	0	0	－1	1	2.76
9	0	1	1	0	2.76
10	1	－1	0	0	2.72
11	－1	0	－1	0	2.75
12	1	0	－1	0	2.71
13	－1	－1	0	0	2.74
14	0	－1	－1	0	2.71
15	0	0	－1	－1	2.76
16	1	0	1	0	2.77
17	0	－1	1	0	2.79
18	0	1	0	－1	2.75
19	0	0	0	0	2.83
20	0	0	0	0	2.83
21	0	1	0	1	2.78
22	0	－1	0	－1	2.73
23	－1	0	1	0	2.80
24	1	0	0	－1	2.69
25	0	0	0	0	2.81
26	0	0	0	0	2.82
27	－1	1	0	0	2.75
28	－1	0	0	1	2.78
29	0	1	－1	0	2.77

表 5 Box-Behnken试验方差分析结果

Table 5 Results of analysis of variance for Box-Behnken design

来源	平方和	自由度	均方	F值	P值
模型	0.045 0	14	0.003 2	16.64	＜0.000 1
X1液固比	0.004 8	1	0.004 8	24.63	0.000 2
X2介质pH	0.001 0	1	0.001 0	5.17	0.039 2
X3酶解温度	0.005 2	1	0.005 2	26.73	0.000 1
X4酶解时间	0.002 1	1	0.002 1	10.95	0.005 2
X1X2	0.000 1	1	0.000 1	0.51	0.485 6
X1X3	＜0.000 1	1	＜0.000 1	0.13	0.725 6
X1X4	0.004 2	1	0.004 2	21.68	0.000 4
X2X3	0.002 0	1	0.002 0	10.39	0.006 1
X2X4	0.000 4	1	0.000 4	2.05	0.173 9
X3X4	0.001 2	1	0.001 2	6.29	0.025 1
X12	0.011 0	1	0.011 0	54.15	＜0.000 1
X22	0.017 0	1	0.017 0	88.56	＜0.000 1
X32	0.003 0	1	0.003 0	15.51	0.001 5
X42	0.003 4	1	0.003 4	17.35	0.001 0
残差	0.002 7	14	0.000 2
失拟项	0.002 4	10	0.000 2	3.01	0.149 8
误差项	0.000 3	4	＜0.000 1
总离差	0.048 0	28

应用分析软件对表4数据进行回归拟合，得到4 个因素作为自变量的二次多元回归方程为：

Y=2.82－0.020X1＋0.092X2＋0.021X3＋0.013X4－0.005X1X2＋0.003X1X3＋0.033X1X4－0.023X2X3＋0.01X2X4＋
0.018X3X4－0.04X12－0.052X22－0.022X32－0.023X42 （5）

从表5的方差分析结果可以看出，二次多项式模型（P＜0.000 1）达到极显著水平，说明用上述回归方程描述各自变量与响应值之间的关系时，二者线性关系显著。相关系数R2=0.943 3，失拟项P=0.149 8＞0.05，表明试验误差较小，试验值与预测值之间具有较好的拟合度，可以用该回归方程对试验结果进行分析与预测[22-23]。回归方程的一次项X1、X2、X3和X4，交互项的X1X4、X2X3和X3X4以及二次项的X12、X22、X32和X42均达到显著水平。4 个试验因素对石榴籽多糖得率（Y）的影响顺序依次为：酶解温度（X3）＞液固比（X1）＞酶解时间（X4）＞介质pH值（X2）。

为了探讨回归方程交互项中影响显著的X1X4、X2X3和X3X4之间的关系，将4 个因素中的另外2 个因素确定为0，绘制影响显著的两因素之间的响应面图和等高线图，见图7。可以看出，3 个响应面图均为光滑的曲面，且开口向下，表明石榴籽多糖得率的最大响应值就在曲面某处，在所设计的因素水平范围内能够找到石榴籽多糖得率的最大值[24-25]。等高线图中，X1X4交互作用极显著（P=0.000 4＜0.01），说明液固比对多糖得率的影响比酶解时间大，原因是当提取达到平衡状态之前，原料与介质之间的浓度之差直接影响表观速率常数，液固比数值越大，更有利于使表观速率常数数值维持在较大水平，提高多糖得率。X2X3交互作用极显著
（P = 0.006 1＜0.01），说明介质pH值对结果的影响也很明显，在最适提取温度范围内，调节介质pH值使酶的活性达到最佳，促进细胞内有效成分的溶出。X3X4交互作用显著（P = 0.025 1＜0.05），说明在最适酶解温度范围内，适当延长酶解时间有利于提高石榴籽多糖得率，但是时间过长，随着提取物自身的水解或杂质析出吸附大量目标产物后，多糖得率会有所降低。

a.液固比（X1）与酶解时间（X4）

b.介质pH值（X2）与酶解温度（X3）

c.酶解温度（X3）与酶解时间（X4）

图 7 两因素交互作用对石榴籽多糖得率影响的响应面与等高线图

Fig. 7 Response surface and contour plot showing the interactive effect of three extraction parameters on the yield of polysaccharides

2.4 最佳工艺条件的确定及验证

应用软件分析得出复合酶法提取石榴籽多糖的最佳工艺条件为：液固比20∶1、介质pH 4.49、酶解温度48.60 ℃、酶解时间287.1 min。在此条件下，石榴籽多糖得率的模型预测值为2.84%。以上通过数学模型预测的试验条件在实际操作中无法实现，因此将最优工艺参数修订为：液固比20∶1、介质pH 4.5、酶解温度48.5 ℃、酶解时间287 min。在上述修订的最佳提取条件下，共进行3 次平行验证实验，测得石榴籽多糖得率为2.83%，与模型预测值接近，说明通过Box-Behnken试验设计所得到的复合酶法提取石榴籽多糖工艺条件是可靠的。

3 结论

本研究在单因素试验基础上，将D-最优混料设计与响应面分析法相结合，分别得到多项式回归方程，很直观地体现各试验因素与试验结果的相关性，进而获得最佳工艺条件。D-最优混料设计得到的复合酶最优配比为：果胶酶24.2%、纤维素酶67.2%、甘露聚糖酶8.6%。并以此为基础，得到复合酶法提取工艺中，各因素对石榴籽多糖得率的影响程度：酶解温度＞液固比＞酶解时间＞介质pH值。最佳工艺条件为液固比20∶1、介质pH 4.5、酶解温度48.5 ℃、酶解时间287 min，在此条件下，石榴籽多糖得率的模型预测值为2.84%，而实测值为2.83%，二者接近，这表明应用D-最优混料结合响应面分析法，可以对复合酶法提取石榴籽多糖的工艺条件进行优化，从而获得最佳工艺参数，该工艺节能环保，并能对工业化生产起到指导作用。

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