图1 小鼠骨质疏松性骨折模型的建立
Fig. 1 Establishment of the osteoporotic fracture model
骨质疏松症是绝经后妇女和老年人最普遍、复杂的骨骼代谢疾病，会引起骨组织内单位体积骨量减少、骨微结构遭到破坏，正常荷载性能下降，骨脆性增加，以致骨组织受到低能量创伤即会引发骨折[1-2]。骨质疏松性骨折（osteoporosis fracture，OPF）是骨质疏松症最常见、最严重的并发症[3]。OPF的特点之一是发病率高：国际骨质疏松基金会调研发现，全球范围内每3 s就会出现一起OPF病例；50 岁之后，1/2的女性和1/5的男性会遭遇一次骨折[4]。OPF特点二为致残率高：与一般创伤性骨折相比，OPF愈合过程中骨内、外膜表面骨形成不足，骨矿化沉积速率减慢，骨痂形成量减少；此外，骨重塑出现延迟，骨折区新生皮质骨厚度变薄，最终延长了骨折愈合周期[5-7]，甚至会导致骨不连，新骨机械性能下降[8-9]，大大增加了发生二次骨折的风险[10-11]。因此具有高发病率、高致残率特点的OPF对老年人尤其是绝经后妇女的身心健康构成了巨大的威胁[12]，其漫长的恢复过程给患者的日常生活带来了极大的不便，高昂的医疗费用还给家庭乃至社会带来了沉重的经济负担[13]，OPF已俨然成为新的全球威胁。现在临床上OPF的治疗方式多为物理、基因和药物治疗，但是这些治疗手段价格昂贵，且或多或少存在副作用，所以寻找安全有效的辅助治疗措施成为了研究热点。
以南极磷虾为原料提取的南极磷虾油（Antarctic krill oil，AKO）富含磷脂型二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）、二十二碳六烯酸（docosapentenoic acid，DHA）以及少量的虾青素等多种活性因子[14-15]，研究发现AKO具有抗氧化[16]、强健大脑[17]、降血脂[18-19]、抗疲劳[20]等多种生物功能[21]。此外，近期研究发现，EPA、DHA可促进骨生成、改善软骨细胞代谢[22]，而骨折愈合过程经历的软骨内骨化则与此有着密切的关系，因此本研究以富含磷脂型EPA和DHA的AKO为受试物，以软骨内成骨为切入点，系统地研究AKO对骨质疏松骨折愈合的作用，以期为南极磷虾油功能性食品开发提供理论参考，为OPF的辅助性治疗提供新思路。
8 周龄雌性C57BL/6J小鼠，SPF级，体质量（18.50±2.56）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，生产许可证号：SCXK（京）2012-0001，饲养温度为22～24 ℃，相对湿度为52%～58%。
南极磷虾油由中国海洋大学食品科学与人类健康实验室赠予。AKO组成成分分析结果显示其含有约57.4%（质量分数，下同）磷脂、14.2%甘油三酯、15.3%游离脂肪酸、2.1%胆固醇和0.594‰虾青素。EPA和DHA分别占总脂肪酸质量的25.13%和19.24%。
阿仑膦酸钠片 澳大利亚默沙东公司；血清中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、骨碱性磷酸酶（bone alkaline phosphatase，BALP）酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒 美国R & D公司；通用型组织固定液（中性） 武汉赛维尔生物科技有限公司；UNIQ-10柱式TRIzol总RNA抽提试剂盒及随机引物 生工生物工程（上海）股份有限公司；TRIzol试剂 Ambion生物科技有限公司；RiboLock RNA酶抑制剂 美国Thermo Fisher Scientific公司；M-MLV逆转录酶 美国Promega公司；dNTP Mixture宝日医生物技术（北京）有限公司；Aggrecan、Col10a、MMP-13、PDGF-BB、Ang1、Col1a、OCN β-actin引物 苏州金唯智生物科技有限公司；SYBR Green荧光染料 美国Novoprotein 公司；其他试剂均为国产分析纯。
Neofuge 13R 型高速冷冻离心机 力康生物医疗科技控股有限公司；Model680型酶标仪 美国Bio-Rad公司；LightCycler480实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 瑞士Roche公司；RM2125RTS石蜡切片机 德国Leica公司；BH14光学显微镜 日本Olympus公司；YLS-16A小动物骨骼强度测定仪 济南益延科技发展有限公司；GK99-UNIGAMMA X-RAY PLUS双能X射线骨密度仪意大利I’can公司；SCANCO微型计算机断层扫描（micro computed tomography，μCT）仪 瑞士Scanco Medical AG公司；100型高效液相色谱仪 美国Aglient公司；ICS2000型离子色谱仪 美国Dionex公司；Ultra Trurrax T18 basic型高速匀浆机 德国IKA公司。
1.3.1 动物分组及模型建立
C57BL/6J小鼠随机分为假手术组（Sham组，36 只）和去卵巢组（OVX组，90 只），腹腔注射水合氯醛（400 mg/kg mb）进行麻醉，Sham组切除卵巢周围少量脂肪组织，OVX组行双侧去卵巢手术。术后3 个月，每组取4 只小鼠进行安乐死，取股骨进行骨密度分析，结果显示，与Sham组相比，OVX组小鼠股骨骨密度显著降低（P＜0.05），证明骨质疏松模型建立成功（图1A）。
图1 小鼠骨质疏松性骨折模型的建立
Fig. 1 Establishment of the osteoporotic fracture model
随后小鼠于右胫骨中上1/3处行开放性骨折手术（图1B）。将手术成功的小鼠进行分组：Sham组小鼠骨折后作为一般骨折对照组（Control组），去卵巢小鼠骨折后随机分为骨质疏松性骨折模型组（Model组）、阳性对照组（ALN组）、AKO组，每组27 只。骨折后立即灌胃受试物，其中Control组、Model组小鼠灌胃生理盐水，ALN组小鼠灌胃阿伦磷酸钠（质量浓度为0.1 mg/mL），AKO组小鼠灌胃南极磷虾油（质量浓度为30 mg/mL），灌胃剂量均为10 mL/kg mb。骨折术后第5天，每组取5 只小鼠禁食不禁水8 h，行尾静脉取血，常规分离血清用于生化指标检测。术后11、24 d每组取8 只小鼠禁食不禁水8 h，摘眼球取血，收集血清用于生化指标检测；小鼠脱颈椎处死后，迅速分离右胫骨痂组织，用于组织形态学观察（11、24、35 d，每组4 只）、2D μCT分析（24 d，每组3 只）、生物力学分析（56 d，每组4 只）及骨折愈合相关基因检测（11、24 d，每组4 只）。
1.3.2 血清生化指标测定
参照ELISA试剂盒方法测定血清VEGF质量浓度和BALP活力。
1.3.3 股骨组织骨密度测定
小鼠去卵巢术后3 个月，取股骨组织，采用双能X射线骨密度测试仪检测骨密度。
1.3.4 骨痂组织形态学观察
小鼠右胫骨痂于组织固定液固定24 h，质量分数8%乙二胺四乙酸二钠（pH 7.3）脱钙 2～3 周石蜡包埋切片（5 μm厚），进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，光学显微镜下观察骨痂组织学特点并成像。
1.3.5 骨痂2D μCT分析
小鼠骨折术后第24天取材骨痂组织，采用2D μCT扫描仪进行扫描，并使用配套软件分析骨折区形态学参数。用ImageJ软件分析2D μCT图像获得的愈伤组织横切面，计算横切面的最大长度和最小长度以评估愈伤组织的大小。
1.3.6 骨痂生物力学测定
在骨折后第56天取材骨痂组织，通过小鼠骨骼强度测试仪的3点弯曲测试来确定胫骨骨折区的最大弯曲刚度。
1.3.7 qPCR分析
取小鼠骨折后第11、24天骨痂组织，检测骨折愈合相关基因mRNA相对表达量。采用总RNA抽提试剂盒法提取骨痂组织总RNA，取1 μg骨痂总RNA在反转录酶M-MLV的催化下逆转录成cDNA。随后进行荧光实时定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）扩增，各反应物用量参照Maxima SYBR Green qPCR Mastermix说明书要求。反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共45 个循环。相关目的基因的引物序列如表1所示，以β-actin作为内参校正目的基因mRNA表达量。
表1 小鼠骨折愈合相关基因的引物序列
Table 1 Primer sequences used for qPCR amplification of fracture healing related genes
基因 上游引物（5’-3’） 下游引物（5’-3’）Aggrecan TTGCAGACCAGGAGCAATGT CGGTCATGAAAGTGGCGGTA Col10a AGGTATGGCTCCAATTGCCC AGGACGAGTGGACGTACTCA MMP-13 GACCCCAACCCTAAGCATCC CCTCGGAGACTGGTAATGGC PDGF-BB TCCACCAGCAGCGATTCCTCAG GTGCCATCAGAGTTCCTCCAGTCT Ang1 ATTCGCCATCCCAACAGGAA ATCAAGAACAACGGGCCTGG Col1a AGCACGTCTGGTTTGGAGAG GACATTAGGCGCAGGAAGGT OCN GCCCTGAGTCTGACAAAGCCTTCCGGTCTTCAAGCCATACTGGTCTG β-actin TGTCCACCTTCCAGCAGATGT AGCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA
采用SPSS 17.0软件对实验数据进行单因素方差分析，并进行最小显著性差异法和SNK（Student-Newman-Keuls）法组间比较分析，P＜0.05为差异显著。
图2 AKO对小鼠血清生化指标的影响
Fig. 2 Effect of AKO on serum biochemical indicators
由图2A可知，各组VEGF表达高峰期集中在骨折后第5、11天，说明新血管的生成及入侵主要发生在骨折愈合的早中期。骨折后第5、11天，Model组血清VEGF质量浓度较Control组均显著降低，经AKO干预后VEGF质量浓度分别上升了6.39%和8.05%（P＜0.05），提示AKO在骨折愈合早中期促进血管新生与入侵。图2B显示，各组BALP在骨折术后第24天呈现高表达，表明这个时期是活跃的新骨形成阶段。此外，骨折后第11天，与Control组相比，Model组血清BALP活力显著降低，而AKO组极显著升高（P＜0.01）。提示在骨折愈合期间，AKO可增强成骨细胞活性、促进新骨形成。
图3 AKO对小鼠骨折后11 d骨痂组织形态学的影响
Fig. 3 Effect of AKO on callus histomorphology at 11 days post-fracture
对不同时间点的骨痂组织切片进行HE染色，动态观察骨痂形态学变化，从而反映软骨内骨化进程。如图3所示，骨折手术后11 d，Control组骨折区愈伤组织由大量编织骨组织和少量软骨组织组成。然而，Model组主要充斥大量软骨愈伤组织，且多数处于增殖期。模型小鼠经AKO干预后，骨痂中大量软骨细胞变得肥厚，并伴有软骨基质降解和矿化新骨替代软骨现象，表明AKO促进软骨细胞肥大、凋亡及新骨矿化，使小鼠提前完成软骨痂期过渡至硬骨痂期。
图4 AKO对小鼠骨折后24 d骨痂组织形态学及微结构的影响
Fig. 4 Effect of AKO on histomorphology and microstructure of callus at 24 days post-fracture
图4 A表明，骨折后24 d软骨性骨痂已经转化为硬骨骨痂，且逐渐丰富聚集演变成致密的板层骨桥接骨折断端。结果显示，Control组骨痂由致密的编织骨填充，且向成熟的板层骨转变；而Model组编织骨含量较少，且疏松散乱。补给AKO后，小鼠骨痂内编织骨的数量增加，且聚合呈片状骨。结果提示AKO可以促进骨性骨痂的形成与成熟。此外，第24天愈伤组织的2D μCT分析（图4C～E）表明，AKO通过增加相对骨体积（增加16.97%）、骨小梁数量（增加14.77%），降低骨小梁分离度（降低18.53%），使模型小鼠骨性骨痂微结构得到显著改善。2D μCT结果显示，AKO组较Model组骨痂横截面最大长度减少了23.51%（P＜0.01）（图4B、F），在一定程度上反映了AKO在骨折手术后第24天显著降低了愈合组织的大小，加速后期骨重塑。
综上表明，AKO通过加速软骨细胞肥大和矿化、促进硬骨痂的形成与完善，增加愈伤组织的成熟，从而促进骨折愈合。
图5 AKO对小鼠骨折后35 d骨痂组织形态学及56 d骨痂生物力学性能的影响
Fig. 5 Effect of AKO on callus histomorphology at 35 days post-fracture and biomechanical properties of callus on at 56 days post-fracture
图5 A显示，骨折后35 d，Control组骨痂在将形成皮质骨的区域观察到致密的板层骨，而Model组骨折处的板层骨塑型不完全，间隙较大；灌胃AKO后，板层骨痂致密成熟，骨重塑能力显著增强。骨折后56 d骨痂的弯曲刚度测试结果（图5B）显示，Model组骨痂结构强度较Control组显著降低，说明骨质疏松症损害了OPF愈合质量；经AKO治疗后，骨痂结构强度极显著升高59.28%（P＜0.01）。以上结果提示，AKO可促进骨重塑的完成，使新骨快速恢复正常的机械强度，提高新骨的内在质量和抗外力性能。
骨折愈合过程中软骨内成骨相关关键因子的mRNA相对表达量检测结果显示（图6），骨折术后第11天，与Control组相比，Model组Aggrecan、Col10a表达量显著升高；而MMP-13、PDGF-BB、Ang1、Col1a及OCN相对表达量显著降低，直到术后第24天表达量才上升。提示Model组小鼠骨折后第11天愈合过程仍处于软骨痂优势阶段，直至第24天才集中发生软骨矿化及骨性骨痂的重塑。说明由于骨质疏松症的影响，软骨痂的成熟及矿化被严重推迟。模型小鼠灌胃AKO后，骨痂Aggrecan、Col10a表达量在术后第11天显著下调，分别下降53.43%、20.47%；而MMP-13、PDGF-BB、Ang1、Col1a及OCN相对表达量在骨折后第11天显著上调，分别升高85.53%、187.83%、115.5%、35.15%、134.74%。另外，图6B、C显示，骨折后第24天，AKO组小鼠MMP-13、PDGF-BB、Ang1表达量降低，而Col1a及OCN表达量显著升高（P＜0.05）。以上结果提示，AKO可通过调控软骨内骨化相关基因的表达，促进血管入侵，加速OPF小鼠软骨痂向钙化软骨痂转变，从而加速骨折愈合。
图6 AKO对小鼠软骨内成骨相关基因mRNA表达的影响
Fig. 6 Effect of AKO on mRNA expression of key genes related to endochondral ossification
本实验采用OVX手术及单侧胫骨开放性骨折手术建立OPF模型，通过检测OPF愈合过程中软骨内成骨时期和骨痂重塑期相关的各项指标，探究AKO对骨质疏松模型小鼠骨折愈合的作用。结果表明，AKO可促进OPF愈合过程中的成软骨分化、软骨成熟肥大、软骨基质降解、新血管生成和新骨形成，加速软骨内骨化进程；促进硬骨痂塑型，增强新骨机械强度，提高愈合质量。
骨折愈合是一个响应骨损伤而发生的复杂多阶段的骨修复过程，其最终目标是使受损的骨返回到功能和生物力学健全的状态。骨质疏松性骨折愈合主要经历以下3 个紧密连接的阶段：1）骨折断端形成血肿、募集间充质干细胞的炎症期；2）骨膜反应为特征的膜内成骨，以及经历软骨骨痂-矿化软骨痂-编织骨样骨性骨痂的逐步过渡的软骨内骨化阶段；3）包括骨再吸收和骨形成的骨痂重塑阶段，使骨恢复原始形态和质量[23-24]。
软骨内成骨阶段是发生在骨质疏松性骨折愈合早中期的重要阶段：在此过程中，大量具有多向分化潜能的MSCs被募集到骨折断端，在转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等生长因子作用下分化为软骨细胞；软骨细胞大量增殖，分泌软骨蛋白聚糖；软骨细胞成熟肥大，分泌X型胶原，形成软骨骨痂[25]。随后，由于软骨痂机械强度无法满足机体需求，它将被编织骨由外向内逐渐替代：软骨愈伤组织分泌MMP-13等因子进行软骨基质降解，最终软骨细胞凋亡[26]；成骨细胞入侵增殖分化、分泌骨基质并矿化成小梁骨，并逐渐汇聚成致密的板层骨，形成骨性骨痂连接骨折断端[27]。骨折后第11、24天的骨痂HE、2D μCT结果显示，相比于Model组小鼠，AKO组小鼠骨折区提前出现大量肥大软骨细胞并伴有软骨基质降解，部分软骨被矿化新骨代替，形成松散的小梁骨；随后更快地转变成了致密、骨微结构优良的成熟板层骨。提示AKO通过促进软骨内骨化进程，改善骨质疏松引起的骨折愈合延迟现象。
软骨内骨化进程受多种生长因子调控：其中Aggrecan、Col10a、MMP-13是软骨细胞增殖、肥大、基质降解的标志物[28-30]；VEGF、PDGF-BB、Ang是血管生成及入侵相关的关键调控因子[31]，促进氧分压的改善及营养、成骨细胞和破骨细胞的运输；BALP、Col1a、OCN表达量反映成骨细胞活性[32]，是重要的骨生成标志物，可以反应硬骨痂形成及重塑情况。血清及基因检测结果显示，模型小鼠灌胃AKO后，骨折后第11天的骨痂Aggrecan、Col10a表达量显著降低，而MMP-13、VEGF、PDGF-BB、Ang1、ALP、Col1a及OCN的mRNA相对表达量显著上调，表明AKO促进软骨细胞增殖、肥大、凋亡及矿化。同时骨折后第24天，骨痂MMP-13、PDGF-BB、Ang1 mRNA相对表达量降低，而Col1a及OCN mRNA相对表达量显著升高，说明AKO组已提前完成血管入侵，且加速了新骨的形成，进一步证明了AKO加速软骨内骨化，促进骨折愈合。
骨折愈合后期以骨重塑为主：为了恢复骨的原有模式，骨性骨痂进行骨塑形与改建，髓腔中多余的愈伤组织被吸收、清除，髄腔重新沟通，皮质骨区演变出生物力学性能优良的板层骨，恢复正常骨结构。此阶段主要经历破骨细胞对松散的编织骨进行重吸收，并伴随成骨细胞形成新的成熟板层骨的爬行替代过程，使原始骨痂的形状和大小被重塑[33]，生物力学性能得到改善[34-35]。骨折后第35天，组织学观察结果显示AKO组较Model组具有更强的骨重塑能力，形成致密的新骨桥接骨折断端。骨折后第56天，AKO组骨痂最大弯曲刚度较Model组显著增加，说明骨折愈合质量更优。综上结果表明，AKO能够在骨折愈合末期促进骨性骨痂重塑，优化骨痂力学结构。
综上所述，AKO通过调控血管生成因子、软骨内成骨相关因子的表达以及成骨细胞活性来增强血管入侵、软骨内成骨以及骨重塑，改善因骨质疏松导致的骨折愈合延迟与损伤，提高愈合质量。
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