蛋氨酸特异性合成途径关键酶
——高丝氨酸O-酰基转移酶的研究进展

刘诗梦,韩彩静,高云娜,赵 兰,卢红妍,闵伟红*

(吉林农业大学食品科学与工程学院,小麦和玉米深加工国家工程实验室,吉林 长春 130118)

摘 要:在蛋氨酸生物合成过程中,蛋氨酸特异性合成反应的第一步是高丝氨酸酰基化,由高丝氨酸O-酰基转移酶催化,生成酰基高丝氨酸。高丝氨酸O-酰基转移酶受到末端产物蛋氨酸和S-腺苷蛋氨酸的反馈抑制和反馈阻遏,且高温下极易失活,严重影响碳流流向蛋氨酸,是蛋氨酸生物合成的关键酶,因此对高丝氨酸O-酰基转移酶的研究和改造具有重要意义。但目前关于高丝氨酸O-酰基转移酶的改造和研究较少,在微生物代谢途径中,碳流不能过多流入蛋氨酸合成途径,制约了微生物过量积累蛋氨酸,阻碍了发酵法生产蛋氨酸的工业进程。本文简述了高丝氨酸O-酰基转移酶在蛋氨酸生物合成途径中的作用,在介绍该酶的结构、催化机制和研究现状的基础上,提出该酶在反馈抑制和提高稳定性方面的分子改造策略。

关键词:蛋氨酸;高丝氨酸O-酰基转移酶;特异性合成途径;热稳定性

高丝氨酸O-酰基转移酶属于α/β水解酶超家族,通过催化底物高丝氨酸发生酰基化得到产物酰基高丝氨酸,激活蛋氨酸特异性合成途径,是蛋氨酸合成过程中的关键酶。该酶不但与高丝氨酸激酶共同竞争底物高丝氨酸,决定高丝氨酸在蛋氨酸合成途径的利用率,而且直接硫化和转硫途径都需经过该酶催化才能进行,可见高丝氨酸O-酰基转移酶在蛋氨酸合成途径中十分重要。

蛋氨酸作为人和动物体内唯一含硫必需氨基酸,在食品、医药及饲料行业中应用广泛。目前用于生产蛋氨酸的化学合成法[1]存在环境污染、产物为DL型混合物分离困难等问题,迫使学者和生产企业急需寻找环境友好的微生物发酵法[2]替代化学合成法。已有多位学者对微生物体内蛋氨酸的合成代谢网络进行研究[3-5],均取得一定成果,为提高蛋氨酸产量积累了经验。但由于蛋氨酸合成途径代谢调控复杂,现有的改造策略仅能在实验室水平小幅度提高蛋氨酸产量,不能达到工业生产要求;因此,如何构建高产蛋氨酸工程菌成为发酵法产蛋氨酸亟待解决的难题和瓶颈,引起了各国学者的广泛关注[6-8]

蛋氨酸的合成途径在大肠杆菌(Escherichia coli)和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中已被阐明[9](图1)。作为蛋氨酸特异性合成途径的第一个酶,高丝氨酸O-酰基转移酶对高丝氨酸的米氏常数Km为2.8 mmol/L[10],与底物高丝氨酸的结合能力较弱,酶活力和酶量受终产物(甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸)[11]的反馈抑制和阻遏,且极不耐热,在30 ℃下半衰期大约只有40 min[12],超过32 ℃后极易失活[12-14]。致使高丝氨酸主要被苏氨酸合成途径消耗,较少作为蛋氨酸合成的中间代谢物。在解除了蛋氨酸合成途径两个限速酶(天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶)的反馈抑制后[15-16],位于二者之后的高丝氨酸O-酰基转移酶作为下一个影响蛋氨酸积累的关键因素,决定了碳通量用于合成蛋氨酸的程度。因此,解除高丝氨酸O-酰基转移酶受到的调控,提高酶对底物亲和力和高温下的热稳定性,对于蛋氨酸的合成至关重要。

图1 细菌中蛋氨酸合成途径[9]
Fig. 1 Biosynthesis pathway of methionine in bacteria[9]

由此,本文对高丝氨酸O-酰基转移酶的结构、反应机理和现有的分子改造策略进行总结,并探讨了通过改造该酶获得稳定性强且催化效率高的突变体来提高蛋氨酸产量的可能性。

1 高丝氨酸O-酰基转移酶在蛋氨酸合成途径中的作用

高丝氨酸O-酰基转移酶将乙酰-辅酶A(coenzyme A,CoA)或琥珀酰-CoA的酰基转移到高丝氨酸的羟基氧上,使高丝氨酸酰基化,为下一步硫化做准备。该酶存在底物特异性,根据酰基供体不同,可分为高丝氨酸乙酰基转移酶(homoserine acyltransferase,HTA)和高丝氨酸琥珀酰基转移酶(homoserine succinyltransferase,HTS)。多数真菌及少数细菌(如C. glutamicum)使用HTA进行催化,大多数细菌(如E. coli)则使用HTS进行催化。二者之间无序列相似性,但都遵循乒乓反应的酶化学机理[17],催化相似的酰基化反应。

HTA以乙酰-CoA为酰基供体,乙酰基首先转移到此酶催化三联体[18]的亲核残基上,再转移到高丝氨酸的γ-羟基,生产乙酰高丝氨酸(图2)。

图2 HTA催化过程
Fig. 2 Catalytic process of homoserine acetyltransferase

HTS以琥珀酰-CoA为酰基供体,将琥珀酰-CoA的琥珀酰基基团首先转移到亲核残基,随后转移到高丝氨酸形成产物琥珀酰高丝氨酸(图3)。

图3 HTS催化过程
Fig. 3 Catalytic process of homoserine succinyltransferase

2 高丝氨酸O-酰基转移酶的结构及催化机理

部分高丝氨酸O-酰基转移酶的晶体结构[19-21]已公布在蛋白质数据库(Protein Data Bank,PDB)上(图4),从蛋白折叠类型上看,该酶属于α/β水解酶超家族,特点是核心由围绕着α-螺旋的平行β-折叠片层组成,活性位点由高度保守的“催化三联体”残基组成。催化三联体包括酸性、碱性和亲核残基,3 个残基同时作用攻击底物形成不稳定的共价中间复合物,降低反应活化能从而提高反应效率。

图4 钩端螺旋体中HTA结构(A)[19]和金黄色葡萄球菌中HTA结构(B)[21]
Fig. 4 Structure of homoserine acetyltransferase in Leptospira interrogans (A)[19] and structure of homoserine acetyltransferase in Staphylococcus aureus (B)[21]

Wang Mingzhu等[19]研究了钩端螺旋体(Leptospira interrogans)中的HTA(PDB∶2PL5)的结构,由10 个α-螺旋和10 个β-折叠组成,分为两个独立的结构域,包括1 个含有催化三联体的核心α/β结构域和1 个由5 个α-螺旋组成的Lid结构域(图5)。其催化三联体由S153(亲核残基丝氨酸)、D311(酸性残基天冬氨酸)和H344(碱性残基组氨酸)组成(图6)。H344夺取S153的1 个氢原子,激活S153的亲核试剂活性,使其进攻乙酰-CoA的羰基碳,形成四面体过渡态。同时H344构象发生变化,使底物高丝氨酸进入,四面体过渡态解离,产生乙酰-HTA中间产物并释放CoA,去质子化的高丝氨酸作为亲核试剂进攻乙酰-HTA,再次形成四面体过渡态,随后H344构象变化,释放产物酰基高丝氨酸。

图5 高丝氨酸乙酰转移酶二级结构[19]
Fig. 5 Secondary structure of homoserine transacetylase[19]

图6 Leptospira interrogans中HTA催化三联体位置(A)和HTA催化三联体(B)[19]
Fig. 6 Position of the catalytic triad of homoserine acetyltransferase (A)and the catalytic triplet of homoserine acetyltransferase (B) in Leptospira interrogans[19]

E. coli中HTS的编码基因为metA,Rosen等[22]通过质谱鉴定其活性位点,发现琥珀酰基与D47共价结合,推测D47是催化反应的亲核残基。但Coe等[23]通过定点突变得出不同结论,认为HTS的催化三联体由亲核残基半胱氨酸(C142)、碱性残基组氨酸(H235)和酸性残基谷氨酸(E237)组成,D47作为稳定琥珀酰基的关键残基存在。2008年,周奕含等[24]利用同源模建的方法,以蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HTS为模板,建立了E. coli中HTS三维结构,通过分子对接从结构上佐证了C142为亲核进攻的残基,并根据氢键及分子间非键作用推断出稳定琥珀酰-CoA和影响催化效率的14 个氨基酸残基。

对高丝氨酸O-酰基转移酶的分子改造,需要建立在了解其结构和催化机制的基础上,选择底物高丝氨酸的结合位点和催化三联体所处活性口袋附近的氨基酸残基进行突变,达到降低高丝氨酸Km、提高酶对底物亲和力的目的,最终提高酶的催化效率。

3 高丝氨酸O-酰基转移酶的分子改造策略

针对高丝氨酸O-酰基转移酶受到的末端产物反馈抑制和高温下易聚集失活的性质,研究人员通过随机诱变或定点突变技术来解除该酶所受的反馈抑制和提高其热稳定性;或敲除阻遏蛋白来解除反馈阻遏,提高其在蛋氨酸合成通路中的酶活性(表1)。

表1 高丝氨酸O-酰基转移酶分子改造策略
Table 1 Molecular modification strategies for homoserine O-acyltransferase

菌种 改造方法 蛋氨酸产量/(g/L) 参考文献E. coli W3110 HTSFbr 1.7 Liu Qian等[25]E. coli BL21 MetA+ 0.25 郭谦等[26]E. coli BL21 MetA+ 0.34 屈更思等[27]E. coli W3110 HTSFbr 0.24 Usuda等[28]E. coli MG1655 HTSFbr 14.1 Bestel-Corre等[29]C. glu MetX+ 16 Moeckel等[30]

3.1 解除反馈调控的分子改造策略

反馈阻遏是微生物合成蛋氨酸过程中经济的调控方式,通过调节代谢途径中酶的合成阻止代谢产物过量积累。解除高丝氨酸O-酰基转移酶受到的反馈阻遏主要通过敲除阻遏蛋白实现。在E. coli中,阻遏蛋白MetJ涉及蛋氨酸合成及转运基因的转录水平调节,以二聚体形式结合到被称为“met-box”的回文保守序列上[31],这段序列长8 bp,存在于蛋氨酸特异性合成途径和吸收系统中基因的启动子区域[32](图7)。S-腺苷蛋氨酸是MetJ的辅阻遏物,与MetJ结合后可提高该阻遏蛋白对“met-box”的亲和力。谷氨酸棒杆菌中的McbR是TetR型阻遏蛋白[33],由mcbR基因编码,抑制蛋氨酸合成和硫代谢途径中大部分基因的表达。2015年,Qin Tianyu等[4]敲除C. glutamicum的阻遏蛋白McbR后,HTA的编码基因metX的转录水平上调。同样,Han Guoqiang等[34]在C. glutamicum中敲除McbR,解除了HTA及几乎所有蛋氨酸特异性合成途径中的酶受到的反馈阻遏。但李莹[5]在经诱变的C. glutamicum中敲除McbR后,发现蛋氨酸合成途径中的8 个酶转录水平无明显变化,且蛋氨酸产量下降。由于McbR作为全局调控因子,不只是对蛋氨酸合成有调控作用,还参与硫代谢的调控,敲除后会引起胞内氧化应激反应,强烈改变还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)的代谢,在蛋氨酸合成途径中降低NADPH利用率,并影响细胞生长[35]。仅通过敲除阻遏蛋白虽然能够提高高丝氨酸O-酰基转移酶的转录水平,但从菌体生长上看,这种方法会导致细胞代谢失衡,存在一定隐患。如何解决阻遏蛋白敲除后引起的代谢紊乱问题,可以作为解除高丝氨酸O-酰基转移酶的反馈阻遏的一个研究方向。

图7 MetJ与蛋氨酸合成途径及吸收途径基因结合位点[32]
Fig. 7 MetJ binding sites for the methionine synthesis pathway and the uptake pathway[32]

反馈抑制是蛋氨酸合成过程中基本且快速的调节方式,避免代谢物过量积累影响代谢平衡。E. coli是工业生产的模式菌株,E. coli中HTS受蛋氨酸和S-腺苷蛋氨酸(S-adenosyl methionine,SAM)的协调反馈抑制,1 mmol/L蛋氨酸或1 mmol/L S-腺苷蛋氨酸浓度条件下,HTS活力仅为4%或13%[28]。2005年,Usuda等[28]将E. coli W3110中HTS的R27、I296和P298分别替换为Cys、Ser和Leu,部分解除了蛋氨酸和S-腺苷蛋氨酸的反馈抑制作用,在浓度为100 mmol/L的蛋氨酸或1 mmol/L的S-腺苷蛋氨酸条件下相对酶活力可保持在80%以上,虽然减弱了HTS受到的反馈抑制,但突变后酶活力比野生型HTS更低,仍需进一步研究在保证酶活力的基础上解除反馈抑制(表2)。即便HTS突变后酶活力降低,Usuda等[28]的研究仍为随后改造蛋氨酸合成途径的研究提供参考,Liu Qian等[25]在E. coli中过量表达该解除反馈抑制的HTS(R27C、I296S、P298L)并敲除MetJ和过表达运输蛋白YjeH,使蛋氨酸产量达到1.7 g/L。2015年,段昭炜[36]经定点突变后筛选出抗反馈抑制的突变体(Y299C),在1 mmol/L蛋氨酸或1 mmol/L S-腺苷蛋氨酸存在的情况下酶活力分别为86.3%及79.6%。此后关于该酶反馈抑制解除的研究鲜有报道,但可以看出HTS所受的反馈抑制没有完全解除。相比于解除反馈阻遏来提高酶表达量,通过解除反馈抑制提高酶活力的方法更省时,能耗更少,能更加有效地催化高丝氨酸。因此仍需更进一步对酶的抑制剂结合位点进行研究,提高该酶在抑制剂存在情况下的活力。

表2 抑制剂对HTS突变体的影响[28]
Table 2 Effects of inhibitors on HTS mutants[28]

抑制剂 HTS活力/(mmol/(min·mg)pro)(相对酶活力/%)WT R27C I296S P298L无22.3(100) 5.0(100) 4.5(100) 4.5(100)0.1 mmol/L α-MM 18.6(83) 4.9(99) 4.1(93) 4.6(102)1 mmol/L α-MM 7.0(31) 2.7(54) 4.6(103) 4.8(107)0.1 mmol/L Met 14.3(64) 2.5(51) 4.5(101) 4.2(94)1 mmol/L Met 0.8(4) 2.2(44) 4.0(89) 4.0(88)0.1 mmol/L SAM 17.0(76) 1.1(22) 4.6(103) 3.6(79)1 mmol/L SAM 3.0(13) 0.5(10) 2.6(58) 3.3(72)0.1 mmol/L Met+SAM 0(0) 0.9(19) 5.6(125) 2.8(61)

3.2 提高热稳定性的分子改造策略

Ron[37]和Gur[38]等于1971年开始研究HTS与E. coli生长速率之间的关系,其认为高温下HTS活力降低导致E. coli生长缓慢。但关于如何提高高丝氨酸O-酰基转移酶热稳定性的研究较少,Mordukhova等[39]在2008年使用对metA随机诱变来改善高温下的E. coli生长情况,确定了I229T和N267D的突变使得E. coli菌株能够在更高温度下生长并增加菌株耐受酸性条件的能力。在此基础上,Mordukhova等[40]于2013年首先通过多重序列比对的方法鉴定出E. coli中HTS不同于嗜热HTS的8 个氨基酸位点,并分别突变得到突变体Q96K、L110V、I124L、R160L、A195T、A200E、D218G和F247Y,经验证Q96K、I124L、F247Y 3 个突变体能够改善升温时E. coli的生长。随后使用I-Mutant 2.0建模工具进行蛋白质稳定性预测,推测并证实I229Y突变可以提高HTS的稳定性,并提高E. coli在44 ℃下的生长速率。最后同时对HTS进行双突变及三重突变,构建了携带双突变(I124L-I229Y)和三重突变(I124L-I229Y-N267D)的E. coli突变株,发现二者生长速度均快于单突变株。

高丝氨酸O-酰基转移酶高温下易失活限制了其合成蛋氨酸的作用,为了解决这一问题,需要对该酶进行分子改造提高热稳定性。使用生物信息学方法借助蛋白质数据库并通过计算机模拟等手段分析酶的结构-功能关系,识别并筛选该酶稳定性差的关键位点,分析理化性质后应用分子生物学技术如定点突变[41],在适当位置引入二硫键[42]或糖基化位点[43-44]以及截去酶结构中柔性较大的氨基酸序列[45]来提高该酶热稳定性。以上策略在其他热不稳定性酶中已获得较成功的尝试。刘晓萌等[46]应用B-FITTER软件分析了细胞色素单加氧酶晶体结构中的温度因子(B-factor),识别出一个不利于酶热稳定性的关键残基位点G46,对该位点进行定点饱和突变,筛选获得一个突变体的半失活温度比野生型高5 ℃,半衰期延长一倍。Yin Xin等[47]通过MODIP和DbD两种计算工具预测蛋白质中可能的二硫键,经分子动力学模拟确定了A型阿魏酸酯酶的两个氨基酸位点A126-N152,将其突变为半胱氨酸引入二硫键后最适温度提高6 ℃,在55 ℃和60 ℃下的半衰期分别为188 min和40 min,热稳定性提高10 倍且催化效率与野生型相近(图8)。王小艳等[48]在β-葡萄糖醛酸苷酶模拟结构分析的基础上,半理性方法设计并通过定点突变引入N-糖基化位点得到3 株突变菌,其中两株热稳定性得到改善,相比野生型分别提高13%和11%。

图8 A型阿魏酸酯酶126和152位点突变前后示意图[47]
Fig. 8 Schematic diagram of type A feruloyl esterase before and after 126 and 152 mutations[47]

在实际生产中,发酵温度是需要考虑的重点因素。伴随着发酵产热,发酵液温度上升,高丝氨酸O-酰基转移酶失活会影响蛋氨酸合成中碳流的利用,导致高丝氨酸积累,对细胞产生毒性或高丝氨酸被苏氨酸合成途径消耗,不能用于合成蛋氨酸。因此,增强高丝氨酸O-酰基转移酶热稳定性是改造该酶的重要方向。

4 结 语

蛋氨酸合成途径涉及多个酶的共同作用,仅改变途径中单个酶无法达到理想产量,但酶作为调节细胞代谢的基本元件需要拥有良好的酶学性质。针对高丝氨酸O-酰基转移酶热稳定性差的性质,结合生物信息学分析方法,采用突变或敲除该酶热稳定性差的残基或结构,获得热稳定性高的酶分子。在此基础上,通过突变该酶的抑制剂结合位点和底物结合位点以解除反馈抑制,提高酶对底物的敏感性,从而提高酶的催化效率,进一步调节该酶的酶活力和酶量,可以作为研究改造高丝氨酸O-酰基转移酶的尝试方向。

此外,国内外多个实验室建立了可用于E. coli和C. glutamicum的CRISPR/Cas基因组编辑系统,实现了在微生物染色体上进行基因的敲除、敲入和突变[49-53]。应用CRISPR/Cas技术直接对微生物基因组上的高丝氨酸O-酰基转移酶进行碱基的替换及部分结构截除,或将改造后的酶敲入至经多点修饰且优化代谢网络的微生物染色体中,可以避免外源质粒的添加,防止外源质粒丢失引起菌种性能退化的同时又减少菌体代谢负担,对构建用于大规模发酵的高产蛋氨酸工程菌具有重要价值。

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Recent Progress in the Study of Homoserine O-Acyltransferase, the Key Enzyme in the Methionine Biosynthesis Pathway

LIU Shimeng, HAN Caijing, GAO Yunna, ZHAO Lan, LU Hongyan, MIN Weihong*
(National Engineering Laboratory for Wheat and Corn Further Processing, College of Food Science and Engineering,Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Abstract: The first step in methionine synthesis is homoserine acylation catalyzed by homoserine acyltransferase to generate acylhomoserine. Homoserine O-acyltransferase, the key enzyme for methionine biosynthesis, is feedback inhibited or feedback repressed by the end products methionine and S-adenosylmethionine, and is easily inactivated at high temperatures,thus seriously affecting the flow of carbon toward methionine. In this context, studying and modifying homoserine O-acyltransferase are of great significance. However, there are few reports in the literature on studies and modification of homoserine O-acyltransferase. In the microbial metabolic pathways, inadequate carbon flow toward the methionine synthesis pathway can restrict microbial accumulation of methionine, and consequently hinder the industrial fermentation of methionine. In this paper, the role of homoserine O-acyltransferase in the methionine biosynthetic pathway is briefly described. Based on the structure catalytic mechanism of the enzyme as well as a review of recent studies on it, molecular modification strategies for feedback inhibition regulation and stability improvement are proposed.

Keywords: methionine; homoserine O-acyltransferase; biosynthesis pathway; thermal stability

收稿日期:2018-05-11

基金项目:国家自然科学基金面上项目(31771957)

第一作者简介:刘诗梦(1994—)(ORCID: 0000-0002-2662-5127),女,硕士研究生,研究方向为发酵微生物选育与代谢调控。E-mail: Liushimeng1994@163.com

*通信作者简介:闵伟红(1971—)(ORCID: 0000-0002-6093-2104),女,教授,博士,研究方向为发酵工程、粮油科学与深加工技术。E-mail: minwh2000@vip.163.com

DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180511-169

中图分类号:Q517

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2019)11-0261-07

引文格式:

刘诗梦, 韩彩静, 高云娜, 等. 蛋氨酸特异性合成途径关键酶: 高丝氨酸O-酰基转移酶的研究进展[J]. 食品科学, 2019,40(11): 261-267. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180511-169. http://www.spkx.net.cn

LIU Shimeng, HAN Caijing, GAO Yunna, et al. Recent progress in the study of homoserine O-acyltransferase, the key enzyme in the methionine biosynthesis pathway[J]. Food Science, 2019, 40(11): 261-267. (in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180511-169. http://www.spkx.net.cn