壳聚糖（chitosan，CS）具有良好的成膜性，是地球上最丰富且天然存在的多糖之一[1]。由于其安全性、生物可降解、来源广泛等优良特性，在食品、化妆品、生物医学及农业等领域有广泛的应用[2]。且CS具有多种降解方法，包括光降解、酶降解、酸降解等[3]，因此全球许多公司已开始将基于CS的产品进行商业化[4]。但是CS单一成膜组分不具备一定的抗氧化性，且抑菌范围较窄，可降解速度较为缓慢；因此，国内相关研究者通过添加一种或者多种组分制备复合膜以改善其性能，扩大其应用范围。蒲传奋[5]、Shankar[6]等通过向CS中添加硫纳米颗粒、微晶纤维素，显著提高了CS膜的疏水性、抗氧化性、机械强度及抗菌活性。γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，γ-PGA）是一种由微生物产生的易生物降解的高分子天然聚合物，具有良好的水溶性，且无毒、可食用[7]，在食品工业中具有极高的发展潜力及应用价值[8-10]。通常为适应不同产品类型、不同加工条件或保存环境的要求，需要在膜中添加特定物质来改善膜的物理特性、功能性、抑菌性等，扩大其适用范围。姜黄素（curcumin，Cur）是从姜科植物郁金、天南星科植物菖蒲等的植物根茎中提取的一种小分子物质[11]，是良好的食品级色素[12]，具有显著的抗氧化功能及抗炎、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等生物活性[13]，近年来逐渐受到国内外临床治疗、医药、食品、保健品等研究者的关注。
果蔬类产品多使用含蜡的水溶性乳液进行保鲜处理，但蜡质成分在体内体外都难以降解。而对于肉制品而言，肠衣随着需求量的增大，应用范围也逐渐扩大，但对于一些食品的使用受到限制[11]。而CS、γ-PGA均具有良好的可降解性和安全性，以其为成膜材料所制备的可食性膜可通过直接喷洒于食品表面或将成型的膜覆盖于食品表面达到预想的效果，除可减少产品的氧化和水分损失外，还可改善产品质量、色泽、感官属性及延长保质期[12-13]。冯文婕等[14]发现以一定浓度茶多酚-CS复合保鲜膜液对新鲜草莓进行涂膜保鲜处理，可延长草莓的保鲜期，且保持其较好的感官品质。因此，可食性膜的开发利用在食品的保存与运输中起着至关重要的作用。Cur作为一种光敏剂，在光照作用下可以发生光敏作用，产生光毒性，表现出抑菌效果。然而，光毒性是否对人体产生不良影响，已有研究对此进行了探讨。武娟等[15]探究了光敏化Cur对小鼠L929细胞生长的影响。结果表明，经不同浓度的光敏化Cur（5、10、20 μmol/L）处理后，L929细胞生长良好，不发生细胞凋亡，与对照组相比无明显差异。且Cur在光照下易发生分解，主要产物为阿魏酸和香草醛，二者分别具有调节人体生理机能和辅助治疗各种类型癫痫的作用。因此，搭载Cur的可食性复合膜将有助于扩大其于果蔬及肉制品保鲜中的使用范畴。
本研究以CS、γ-PGA为成膜材料，添加Cur制备可食性复合膜，对膜的厚度、透光率、水溶性进行评价，阐明各组分对可食性膜特性的影响，并分析膜的表面结构和红外吸收情况。然后探究该可食性复合膜对培根及火腿表面的抑菌保鲜效果，以初步评价其应用于肉制品保鲜包装的可行性。
CS（脱乙酰度≥95%） 上海阿拉丁试剂有限公司；γ-PGA（相对分子质量为7×105） 陕西一诺生物科技有限公司；Cur（纯度99%） 山东西亚化学工业有限公司；胰蛋白胨、琼脂粉、酵母浸粉 北京奥博星生物技术有限责任公司；氯化钠、乙酸、无水乙醇、丙三醇均为分析纯；实验用水为去离子水。
YT-CJ-1N型超净工作台 北京亚泰科隆仪器技术有限公司；SHZ-82A恒温振荡器 常州市国旺仪器制造有限公司；SPX-100B-Z型生化培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；79-1型磁力搅拌器 北京中兴伟业仪器有限公司；JJ-1A数显电动搅拌器 金坛市荣华仪器制造有限公司；DZF-6320真空干燥箱 上海新苗医疗器械制造有限公司；UV-6000PC紫外-可见分光光度计上海元析仪器有限公司；螺旋测微器 上海申韩量具有限公司；JEM-2100型扫描电子显微镜 日本电子株式会社；TENSOR37型傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared，FTIR）仪 杭州汉泽科技有限公司。
1.3.1 复合膜的制备
采用流延法制备复合膜，复合膜液的配制及膜制备的具体方法如下。
CS/Cur膜：将CS用体积分数1%冰乙酸溶解，依次配制成5、10、15 g/L的CS溶液，分别取100、99、97、95、92、90 mL的CS溶液，分别添加不同体积（0、1、3、5、8、10 mL）1 mmol/L的Cur溶液，于60 ℃水浴锅内充分反应，直至CS溶液与Cur混合均匀，得到Cur浓度分别为0、0.01、0.03、0.05、0.08、0.10 mmol/L的透明状CS-Cur膜液。
CS/Cur/γ-PGA复合膜：将10 g/L的γ-PGA按一定体积比例（1∶10、1∶8、1∶6、1∶4、1∶2）缓慢添加到CS/Cur溶液（含10 g/L CS和0.05 mmol/L Cur）中，于70 ℃恒温水浴锅中振荡2 h后，取出得到相应体积比的CS/Cur/γ-PGA复合膜液。
在以上复合膜液中分别加入一定量甘油（为了成膜），超声脱气5 min，排除气泡。取一定量的该膜溶液分别倒入直径90 mm的玻璃平皿内，于40 ℃真空干燥箱中烘干24～36 h，得到均匀的膜样品，在相对湿度为50%的环境下放置2 h，揭下备用。
1.3.2 复合膜指标测定
1.3.2.1 厚度的测定
膜厚度的测定参考Prommakool等[16]的方法。将待测膜样品裁剪成大小相同的薄膜，采用螺旋测微器分别测量膜四周及中心位置5 处的厚度，取其平均值。
1.3.2.2 水溶性的测定
选取适当大小的膜样品，记录其初始质量（m0/g），置于烧杯中，加入去离子水，将膜样品充分浸泡4 h，取出，用滤纸将表面水分吸干之后置于干燥箱，50 ℃干燥至质量恒定，记录此时质量（m1/g）。按公式（1）计算膜样品的水溶性。
式中：m0为膜样品的初始质量/g；m1为充分浸泡干燥后的膜样品的质量/g。
1.3.2.3 透明度的测定
透明度的测定参考王坤等[17]的方法。将膜样品裁剪为5 cm×1 cm大小，贴在比色皿壁上，以空气作空白对照，用紫外-可见分光光度计测定600 nm波长处吸光度（A600 nm），按公式（2）计算透明度。
式中：d为膜的厚度/mm。
1.3.2.4 表面形态的观察
选取不同膜样品，经喷金干燥处理后，在JEM-2100型扫描电子显微镜下观察其表面微观结构。
1.3.2.5 傅里叶变换红外光谱扫描
选取适当的复合膜，采用TENSOR37型FTIR仪（400～4 000 cm－1）进行扫描，分析不同膜样品的扫描曲线。
1.3.3 复合膜在培根与火腿表面的应用分析
将市售培根与火腿在无菌环境下拆封，切片（厚度约3 mm），将样品分别经10 g/L CS膜液及CS/Cur/γ-PGA复合膜液（V（γ-PGA）：V（CS/Cur）＝1∶8）涂膜处理与采用市售保鲜膜进行包装，空白组样品不经任何处理，于28 ℃、相对湿度为50%环境下保存，2、3 d后分别测定菌落总数（参考GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》），并在第3天对其进行感官评定（参考GB 2730—2015《食品安全国家标准 腌腊肉制品》）和拍照。
使用SPSS Statistics 17.0统计软件进行实验数据分析，采用t检验进行显著性差异分析（P＜0.05），数据以平均值±标准差表示，使用OriginPro 8.0软件作图。
Cur具有较强的着色作用，在我国食品添加剂使用标准（GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》）中允许作为糖果、碳酸饮料、果冻等的着色剂使用。大量研究也报道了Cur具有很好的抑菌、防腐作用。图1为在10 g/L的CS溶液中添加不同浓度Cur后的膜液和膜样品，可以看出，随着Cur浓度的增加，复合膜液及膜的颜色均逐渐加深。由图2可知，当在CS/Cur中添加γ-PGA后，CS/Cur的添加比例越小，膜颜色逐渐变浅。膜样品的颜色决定膜的使用范围，对于颜色较浅的果蔬，宜采用Cur含量较低与之颜色相符的膜，以不影响食品的外观，而对于颜色较深的肉类等，如火腿、培根，则可以提高Cur的浓度。因此，实际应用中，在保证膜特性的前提下，需根据样品特点选择不同配比的膜使用。
图1 CS/Cur膜液和膜样品
Fig. 1 CS solutions (10 g/L) and film samples with different concentrations of Cur
Fig. 2 Composite film samples with different ratios between γ-PGA and CS/Cur
图3 CS/ Cur（A）和CS/ Cur /γ-PGA（B）复合膜的厚度
Fig. 3 Thickness of CS/Cur (A) and CS/Cur/γ-PGA (B) composite films
CS本身具有良好的成膜性，由图3A可知，混合膜溶液中，随着CS质量浓度的增加，得到的混合膜厚度明显增加。Cur浓度对膜厚度也有明显影响，随着Cur浓度的增加，CS/Cur膜的厚度也逐渐增加。Saranya等[18]在研究中也曾报道，Cur是一类酸性多酚类物质，在溶液中普遍以烯醇式结构存在，在一定条件下，可以与CS发生偶联作用，引起CS膜厚度的增加。Cur在复合膜中主要起抑菌效果，但是添加会导致其厚度增大，对一些食品包装会影响其质感。
由图3B可以看出，随着γ-PGA添加量的增加，复合膜的厚度逐渐减小。因此，可以考虑通过适当增加γ-PGA的添加量以减小膜的厚度，从而适应不同的产品要求。市售保鲜膜的厚度约在0.02～0.03 mm，而流延法制作的复合膜的厚度可以达到0.02 mm左右，喷涂法制作的膜厚度更薄。因此，该可食性复合膜有望在食品表面的涂膜保鲜及作为包装材料上发挥一定的作用。
图4 CS/Cur（A）和CS/Cur/γ-PGA（B）膜的水溶性
Fig. 4 Water solubility of CS/Cur (A) and CS/Cur/γ-PGA (B) films
由图4A可知，当Cur浓度一定时，随CS质量浓度增加，复合膜的水溶性显著下降（P＜0.05），这是因为CS本身的亲水性差；CS质量浓度一定时，添加Cur后，复合膜的水溶性显著低于单独的CS膜（P＜0.05），这是因为Cur呈疏水性，添加Cur后，疏水性碳链增多，膜的水溶性下降，但Cur的浓度对CS/Cur膜水溶性影响不显著（P＞0.05）。从图4B可以看出，与未添加γ-PGA的复合膜相比，添加γ-PGA后复合膜的水溶性显著增加（P＜0.05），但是γ-PGA的添加量对复合膜水溶性的影响不显著（P＞0.05）。水溶性的增加主要是因为CS与γ-PGA之间会形成良好的分散体系，且γ-PGA具有良好的水溶性与降解性。
图5 CS/Cur（A）和CS/Cur/γ-PGA（B）膜的透明度
Fig. 5 Transparency of CS/Cur (A) and CS/Cur/γ-PGA (B) films
薄膜的透光性直接影响产品的保鲜效果及外观，有的产品包装需要提高透光率，来呈现食品原有的新鲜色泽；有的则需要避光，减少光线对包装内食物的影响，形成良好的阻隔作用。由图5A可以看出，CS质量浓度一定时，复合膜溶液中Cur的浓度越高，制得的复合膜透明度越低，这是因为Cur为黄色粉末，具有极强的着色性，且一旦着色后便不会轻易褪色，导致透明度降低。由图5B可以看出，在CS/Cur溶液中添加不同比例γ-PGA后，所得复合膜的透明度没有较大变化，且透明度良好。
图6 CS（A）、CS/ Cur（B）和CS/Cur/γ-PGA（C）膜的表面扫描电子显微镜图
Fig. 6 Scanning electron microscope images of CS (A), CS/Cur (B) and CS/Cur/γ-PGA (C) films
CS具有良好的成膜能力，其膜表面平整且光滑（图6A）。CS中添加Cur后，没有出现团聚现象，且膜表面无缝隙与杂质，紧凑且光滑（图6B），因此二者也表现出良好的相容性；陈红等[19]以CS为成膜基质，添加微晶甾醇制备可食性膜，通过扫描电子显微镜观察复合膜的表面结构发现，添加低剂量微晶甾醇的复合膜表面光滑均匀，且微晶甾醇均匀地分布于CS膜中；因此CS与其他物质有较好的相容性，适合作为可食性膜的基质。但添加γ-PGA后的复合膜表面更为紧密，表面有少许白色絮状物分布（图6C），推测可能是γ-PGA与CS/Cur反应的产物引起的，这与胡熠等[20]所报道的结果相似。
图7γ-PGA、Cur（A）、CS及其复合膜（B）的FTIR图
Fig. 7 FTIR spectra ofγ-PGA, Cur (A), CS and their composite films (B)
图7 为复合膜及单一膜组分的FTIR图。对于单一Cur，1 627.3 cm－1处为C＝O的伸缩振动吸收峰（图7A）；单一CS膜在3 368.3 cm－1左右为O—H与N—H伸缩振动的重叠吸收峰（图7B）；通过对比CS/Cur复合膜的FTIR图（图7B），可以发现复合膜中的这两个吸收峰均发生明显的位移，吸收波数分别位于1 641.8 cm－1和3 361.2 cm－1处，推测可能是CS的N—H与Cur的C＝O发生了偶联作用[21]；刘举慧等[22]也报道了CS与Cur之间会发生偶联反应。
单一γ-PGA膜在3 338.4 cm－1与1 685.7 cm－1处分别出现O—H与C＝O的伸缩振动吸收峰（图7A），通过对比分析CS/Cur/γ-PGA复合膜相对应基团的伸缩振动吸收峰后发现，复合膜在3 349.4 cm－1与1 634.1 cm－1处的伸缩振动吸收峰发生较为明显波动，推测3 349.4 cm－1处出现吸收峰可能是γ-PGA的羧基中的O—H与CS的N—H发生了化学反应，1 634.1 cm－1处的吸收峰可能是CS的N—H与γ-PGA的C＝O之间发生了相互作用，这与孙文超[23]的报道结果一致。因此CS与γ-PGA可以通过化学键之间的相互作用出现良好的共混性。但因CS与γ-PGA所含基团极其相似，故FTIR判断化学反应比较困难，仍需结合其他方法进一步检测。
表1 复合膜与市售保鲜膜对火腿的保鲜效果分析
Table 1 Preservative effects of the composite film and commercial wrap film on sausage
处理组 2 d菌落总数/（CFU/g）3 d菌落总数/（CFU/g） 3 d感官评定 3 d外观图空白 4.1×105 9.3×105 颜色较暗，有些许的黏液，有酸败味，组织性状较正常images/BZ_282_2057_713_2197_842.png市售保鲜膜 3.6×105 3.4×106 颜色较暗，有些许的黏液，有酸败味，组织性状较正常images/BZ_282_2057_869_2197_993.pngCS膜 4.0×104 8.9×104 颜色较正常，无黏液，无酸败味，组织性状较正常images/BZ_282_2057_1017_2197_1154.pngCS/Cur/γ-PGA膜 2.7×104 1.6×104 颜色发黄，少许黏液，些许酸败味，组织性状正常images/BZ_282_2057_1172_2197_1303.png
由表1可以看出，不经任何处理的火腿与市售保鲜膜包装的火腿在28 ℃、相对湿度50%条件下放置2 d后，其菌落总数均已达到105 CFU/g以上，3 d后，其表面明显发黏，有酸败味和腐臭味，已成为变质肉。而经自制CS与复合膜涂膜处理后的火腿，在相同环境放置48 h后，其菌落总数较空白组约低1（lg（CFU/g））；72 h后，感官品质无明显劣变，且菌落总数在GB 2726—2016《食品安全国家标准 熟肉制品》对熟肉制品菌落总数的要求范围内，具有可食性。由表2可以看出，自制CS与复合膜涂膜处理后的培根样品，其菌落总数比空白组约低1（lg（CFU/g）），且感官评价和外观状态明显更优。可见，CS/Cur/γ-PGA可食性膜在火腿和培根的抑菌保鲜上发挥了积极作用。
表2 复合膜与市售保鲜膜对培根的保鲜效果分析
Table 2 Preservative effects of the composite film and commercial warp film on bacon
处理组 2 d菌落总数/（CFU/g）3 d菌落总数/（CFU/g） 3 d感官评定 3 d外观图空白 7.6×107 3.4×109 颜色白化，有较多黏液，酸败味较大，组织黏连images/BZ_282_2100_2411_2242_2556.png市售保鲜膜 8.4×107 5.6×109 颜色白化，有较多黏液，酸败味较大，组织黏连images/BZ_282_2100_2601_2242_2756.pngCS膜 2.8×106 6.2×107 颜色较正常，少许黏液，些许酸败味，组织性状正常images/BZ_282_2100_2797_2242_2942.pngCS/Cur/γ-PGA膜 6.1×106 2.35×107 颜色发黄，少许黏液，些许酸败味，组织性状正常images/BZ_282_2100_2982_2242_3136.png
张立彦等[24]研究报道了将无菌处理的鸡肉浸泡于含质量分数1.5% CS、0.3%茶多酚及0.5% VC的复合保鲜膜液中，鸡肉的货架期显著延长。郭利芳等[25]将含有Nisin的乳清蛋白可食性膜涂抹于火腿肠表面，明显抑制了火腿肠硬度的增加和咀嚼性的劣变，并显著抑制了其贮藏过程中总挥发性盐基氮含量、脂质氧化以及菌落总数的上升，更好地维持了产品的感官品质。Papadimitriou等[26]将Cur与二碘化锌按一定物质的量之比反应形成抗菌材料，并探讨其对铜绿假单胞菌的抑菌活性，结果发现该抗菌材料对铜绿假单胞菌生物膜的形成起到了显著的抑制作用。Tosati等[27]将姜黄与明胶、木薯淀粉制备呈水凝胶，将其涂抹于香肠表面，在UV-A光照下5 min，香肠表面的单核增生李斯特氏菌减少4～5（lg（CFU/mL）），显著减少了香肠在运输中的污染。因此，可食性膜尤其是搭载Cur的可食性膜有望在未来食品包装市场中发挥积极的作用，也将越来越展现出巨大的应用潜力。
CS具有良好的成膜性，但其抑菌性和水溶性有限，且降解速度慢，一定程度限制了其适用范围，Cur与γ-PGA的添加大幅改善CS的特性。本研究中CS/Cur溶液（含10 g/L CS和0.05 mmol/L Cur）与10 g/L γ-PGA按体积不同比例混合，制作的膜厚度最薄可达0.025 mm，CS/Cur/γ-PGA复合膜水溶性在80%以上，透明度良好，膜表面较为紧密。该可食性复合膜在火腿与培根表面的初步应用中也表现出了显著的效果。经自制复合膜液处理的火腿与培根在28 ℃、相对湿度50%条件下放置2～3 d后，与不经任何处理和市售普通保鲜膜处理的样品相比，菌落总数均约降低1（lg（CFU/g）），且感官品质更优。
CS/Cur/γ-PGA复合膜兼具了3 种物质各自的优点，具有生物相容性、可降解性和良好的安全性，满足了人们对无污染、可降解性、可食性的要求，对肉制品的保鲜及果蔬的保鲜都有着较为广阔的应用潜力；但该研究技术还需要不断完善，后续研究将集中在以下方面开展：1）充分考虑Cur的光动力学作用，优化其光动力杀菌条件，提高其对果蔬及肉制品的保鲜抑菌效果；2）探究光敏剂Cur的协同增效物质或与相关预处理技术结合，提高使用效果；3）改善膜的性能，扩大其应用范围；4）通过添加其他相容性良好的抗菌及共混膜物质来扩大可食性膜在实际保鲜与加工中的应用范围[28]。
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Preparation of Chitosan/Curcumin/γ-Polyglutamic Acid Edible Composite Film and Its Preservative Effect on Bacon and Sausage
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