东方伊萨酵母和酿酒酵母混合发酵杨梅酒的发酵效率及风味特征分析

张文文,翁佩芳*,吴祖芳

(宁波大学食品与药学学院,浙江 宁波 315800)

摘 要:采用东方伊萨酵母(Issatchenkio orientalisIo)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeSc)混菌发酵杨梅酒,测定混合发酵的发酵周期,并对发酵产生的挥发性风味成分进行比较。结果表明,混菌发酵比Sc纯种发酵效率高,提前3 d完成主发酵。挥发性风味成分的种类方面,混菌发酵与Sc纯种发酵相似度高,但减少了Sc产生的辛酸及正癸酸这2 种不良气味,减少量分别达到0.020 mg/L和0.053 mg/L,也降低了Io产生的乙酸浓度;Io的参与使发酵液中丁酸乙酯、异戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、壬酸乙酯、3-壬烯酸乙酯等乙酯类和乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸-2-苯乙酯等乙酸酯类含量分别提高了18.52%和57.34%,增加了杨梅酒的果香味。此外,混菌发酵还降低了Sc发酵产生的酵母味和癸酸乙酯等带来的涩味,给人以愉悦的滋味。

关键词:东方伊萨酵母;酿酒酵母;发酵效率;风味;杨梅酒

杨梅(Myrica rubra Sieb. et Zucc.)是我国传统特产水果,杨梅颜色鲜艳,酸甜适口,具有较高的营养价值和重要的药用价值[1]。但是由于杨梅没有果皮保护,又成熟于高温多雨的5—7月,使得杨梅易腐烂而难保藏,在4 ℃条件下只能存放9~12 d[2],往往不能及时销售和加工而造成大量浪费。随着果酒成为国家重点发展的酒类及人们对健康生活方式的追求,以水果为原料酿造具有一定保健功效的各类果酒需求量逐年增加[3]。利用杨梅原料酿造的杨梅酒,香醇爽口,具有高营养、低乙醇体积分数的特点,不仅提高杨梅附加值,而且满足各类消费群体对高质量生活的追求[4]

酵母菌是果酒生产的一个关键要素,直接影响到杨梅酒的风味质量[5]。目前,国内杨梅果酒酿造所用酵母菌几乎都是商业化酵母,应用于杨梅酒发酵会造成酒体风味不足,不能满足消费者的需求[6]。非酿酒酵母从变质的酒体中分离出来,曾一度被认为是果酒发酵过程中的腐败酵母菌,但随着果酒酿造研究的深入,非酿酒酵母对果酒品质的作用得到了肯定[7-8]。它们可以合成多种酶,将原料中的前体物质转化为酯、酸、高级醇等风味物质,并对果酒的色泽产生重要影响,但也存在一些缺陷,比如耐乙醇能力弱(尤其在SO2存在条件下)、发酵力低以及乙酸产量高等。因此,采用酿酒酵母与非酿酒酵母进行混合发酵是当前的研究热点之一。钟瑞敏等[9]发现葡萄酒酿酒活性干酵母作为主发酵菌种,成品酒酒色偏淡,且酒香单薄,但若配合0.1%生香酵母或酿酒高活性酵母可在一定程度上改善杨梅酒酒质。贾言言等[10]研究发现,梅奇酵母(Metschnikowia agaves)与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeSc)顺序接种发酵时,能更好地保留原果香,并增加香气成分的种类及乙酸酯类含量。类星形假丝酵母菌(Candida stella)和毕赤发酵酵母(Pichia fermentans)与Sc混合发酵可以增加巴贝拉红葡萄酒中酯类、脂肪酸和降异戊二烯化合物浓度[11]。耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)可以提高发酵液总酸度并增加苯乙醇、甘油的含量;梅奇酵母(M.agaves)、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalisIo)和有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)能积累更多的高级醇[12]。粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)则可降解苹果酸并产生较多的甘油、酯类和乙酸[13]。酿酒酵母与非酿酒酵母共发酵是调节果酒挥发性成分、提高果酒香气复杂性的重要途径。

关于混菌发酵杨梅酒,国内研究集中在工艺优化方面,对其内在机理的探究鲜见报道,由于杨梅酒的地域特色,国外学者对杨梅酒也少有研究。鉴于商业化酿酒酵母能够耐受较高浓度乙醇,具有较强的有限营养物质竞争能力,保障果酒风味[14],又由于杨梅中尖酸味的苹果酸含量多[15],以杨梅为原料酿制而成的杨梅酒含酸量也较高,而Io能够降低果酒中的苹果酸[16-17]。本研究将目前使用的商业化Sc(安琪葡萄酒活性干酵母)和实验室自主分离筛选获得的产风味较好的非酿酒酵母(Io 166)混合发酵,分析对发酵周期的影响,并探讨相关代谢物对杨梅酒感官特性(风味)的影响,以期为高品质杨梅酒的质量控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

杨梅:荸荠种杨梅,采于浙江省宁波市余姚,采摘后1 h内运到实验室,采用榨汁机获得杨梅汁,并经4 层无菌纱布过滤,使用前-80 ℃冷冻保存。使用时在常温下自然解冻。

菌种:Io 166为宁波大学食品生物技术实验室保存;安琪葡萄酒活性干酵母(菌种鉴定为酵母属Sc菌株),购自安琪酵母股份有限公司。

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、琼脂、碳酸钠、壳聚糖(均为分析纯) 国药集团化学试剂上海有限公司;酒石酸钾、碳酸钾(均为分析纯) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;蔗糖(食品级) 市购;偏重亚硫酸钾(食品级) 烟台帝伯仕自酿机有限公司。

1.2 仪器与设备

7890B-7000C气相色谱-质谱(gas chromatographymass spectrometry,GC-MS)联用仪 美国Agilent公司;DVB/CAR/PDMS萃取头(50/30 μm) 美国Supelco公司;SpectraMax 190酶标仪 美谷分子仪器(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 杨梅酒酿造工艺流程

杨梅原汁制备→过滤→成分调整(碳酸钠调pH 3.5,蔗糖调糖度22°Brix)→巴氏灭菌(75 ℃,15 min)→添加SO2(100 mg/L偏重亚硫酸钾)→加酵母控温发酵(27 ℃)→虹吸分离→后发酵1 个月(18 ℃)→澄清(80 mg/L的壳聚糖)→降酸(2 g/L酒石酸钾+1 g/L碳酸钾)→冷冻1 周(4 ℃)→过滤(0.22 μm滤膜)→灌装→杨梅酒

杨梅酒的混菌发酵是将IoSc分别以6×106、6×105 CFU/mL同时接入处理过的杨梅汁中,进行混合发酵,以IoSc单菌发酵杨梅汁作为对照,IoSc纯种发酵液中的初始接种浓度分别为6×106 CFU/mL和6×105 CFU/mL。

1.3.2 酵母生长、总糖、还原糖和乙醇体积分数的测定

酵母生长测定:采用YPD平板计数法,其中混合发酵中,依据两种酵母菌在YPD固体培养基上菌落形态不同计数。总糖及还原糖含量测定:3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)比色法[18];乙醇体积分数:采用爱尔兰Megazyme公司乙醇测定试剂盒测定。发酵效率以总糖降至5 g/L时所需发酵时间作为考察指标。

1.3.3 GC-MS分析

1.3.3.1 挥发性风味物质顶空固相微萃取(head space solid phase microextraction,HS-SPME)

吸取5 mL杨梅酒于顶空瓶中,再加入1.4 g氯化钠,和无水乙醇稀释过的10 mg/L仲辛醇20 μL作为内标,于60 ℃平衡15 min。将老化后的固相微萃取头插入平衡后的样品顶空恒温振荡萃取30 min,振荡速率为250 r/min。取出插入气相色谱柱的进样口解吸附7 min,解吸温度为210 ℃。

1.3.3.2 GC-MS条件

色谱条件:毛细管柱为Vocal(60 m×0.32 mm,1.8 μm)。载气为高纯氦气,恒定流速3 mL/min,进样口温度210 ℃,不分流进样模式。柱温箱采用程序升温,起始温度35 ℃,保持3 min,以3 ℃/min升到40 ℃,保持1 min,再以5 ℃/min升到200 ℃,保持20 min。

质谱条件:采用全扫描模式采集信号,电离方式为电子电离,电子轰击能量为70 eV;接口温度220 ℃,离子源温度230 ℃,四极杆温度150 ℃,扫描质量范围m/z 40~600,扫描频率3.6 scans/s。

1.3.3.3 定性定量分析

化合物经计算机检索与NIST 14 Library相匹配。选择较高匹配度的检索结果,并结合文献报道的已知化合物确认检测物成分,各化合物含量根据内标2-辛醇进行定量。

1.3.4 感官分析

采用定量描述分析方法,由6 位经验丰富的感官品评员(3 名女性和3 名男性)对杨梅酒进行评价,获得评价选用的主要感官描述词。品评员被要求在每一个描述词上对杨梅酒样本按照5 点标度法进行打分。0~5 分别表示没感觉、弱、稍弱、平均、稍强和强。

1.4 数据处理

采用软件Origin 9.1(Northampton,MA,USA)作图,SPSS 24.0统计分析软件进行数据处理,应用单因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan法差异分析,P<0.05,差异显著;对3 种杨梅发酵酒香气成分的含量进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 不同发酵体系中酵母菌的生长变化情况

在酿酒过程中,非酿酒酵母种类广泛且具多样性,其浓度在101~106 CFU/mL之间[19],结合前期对Io和Sc生长曲线测定结果,及避免Sc旺盛繁殖对Io的抑制作用,从而影响杨梅酒成品的香气成分,故混菌发酵液中Io和Sc初始浓度分别选择了6×106 CFU/mL和6×105 CFU/mL。

图1 不同菌种发酵体系中酵母菌生长动态变化
Fig. 1 Dynamic changes in yeast growth in different fermentation systems

从图1可以看出,在纯种发酵中,Sc的生长速率较Io快,虽然Sc的起始接菌量不高,但在24 h细胞浓度有近108 CFU/mL。同样,Io纯种发酵中,Io在前24 h快速增殖,之后Io生长势头减弱,稳定增长至发酵第9天达到峰值,之后开始衰亡,此时发酵液的乙醇体积分数为5.48%。而Sc纯种发酵至第6天后开始衰亡,此时发酵液的乙醇体积分数为9.95%。说明Io和Sc分别在乙醇体积分数为5%和10%时生长受到抑制。

在混菌发酵体系中,Io和Sc表现出相似的生长规律,都在发酵第2天细胞浓度达到最大值,此时发酵液的乙醇体积分数为4.54%,此后Io迅速衰亡,至发酵第9天几乎不能检测到,这与Io纯种发酵结果具有一致性,说明Io对乙醇较为敏感,易受到乙醇的胁迫作用。Miao Yingjie等[20]的研究显示,乙醇胁迫会导致分子伴侣HSP 90和HSP 70以及泛素-蛋白酶体途径相关的基因上调,致使蛋白错误折叠并形成聚集体毒害细胞。混菌体系中,Sc与Io呈现相似的生长规律,即发酵2 d后细胞开始衰亡,由此推测,两者细胞浓度的下降可能与混合发酵体系中营养物质的竞争和细胞的群体感应等因素有关。研究表明,Io在乙醇胁迫下许多参与养分吸收的基因上调[20]。刘茜等[21]发现Io代谢精氨酸、亮氨酸、半胱氨酸和苏氨酸的速率较Sc快。Renault等[22]研究了混合发酵体系中戴尔凯氏有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)和Sc的生长变化,发现酵母细胞间的接触抑制造成了T. delbrueckii的早期死亡。

2.2 不同发酵体系中pH值、总糖和还原糖的变化分析

图2 不同菌种发酵体系中pH值(A)、总糖质量分数(B)和还原糖质量分数(C)的变化
Fig. 2 Changes in pH (A), total sugar content (B) and reducing sugar content (C) in different fermentation systems

从图2A可以看出,不同菌种及其混合发酵方式下发酵液的pH值呈现相同的变化趋势,当pH值下降到一定程度后又会缓慢上升,发酵前期,酵母菌利用发酵液中糖类进行生长繁殖,产生一些酸类物质,故使发酵液中的pH值降低。这个结果与发酵第1天Sc在纯种发酵体系和混菌发酵体系中迅速增殖的现象相吻合。发酵后期,酵母菌处于旺盛的乙醇发酵阶段,部分酸类物质与发酵过程中产生的醇类物质发生酯化反应,故pH值升高[23]。而混菌发酵和Sc发酵pH值变化基本同步,在主发酵第2天pH值达到最低,分别为3.29和3.26,这与混菌发酵液中Sc大量增殖,发酵阶段竞争能力较强有关。

糖是乙醇发酵的基质,酵母菌将可发酵性糖转变成乙醇、CO2和其他一些副产物。从图2B可以看出,Io发酵液总糖含量下降缓慢,说明Io作为非酿酒酵母,对糖的利用效率显著低于Sc。前期实验中,分别对IoSc进行不同碳源(蔗糖、葡萄糖和果糖)的纯培养生长测定,发现Io在以葡萄糖和果糖为碳源时具有较好的生长量,而蔗糖利用性相对较差,可能由于葡萄糖和果糖作为可发酵性糖,可以直接进入糖酵解途径被菌体利用,因而菌体生长较快;蔗糖被菌体利用时,首先需要在二糖水解酶的作用下水解形成单糖,因而菌体生长较慢。而Sc对这3 种碳源利用能力基本相同。从图2C也可以看出,Io优先利用还原糖进行杨梅酒发酵,而Sc将蔗糖水解成果糖和葡萄糖的同时,也能实现对糖的快速利用。故混菌发酵液中残余总糖含量能被快速消耗,且第11天发酵液残糖量就小于5 g/L,比Sc发酵酒提早结束主发酵。

2.3 不同发酵体系中挥发性风味物质比较

香气是衡量果酒品质的重要指标之一,香气的形成过程复杂,按照来源可以概括为品种香、发酵香和陈酿香,其中果酒中主要的香气物质是通过酵母菌的乙醇发酵作用下转化而来,故酵母对果酒香气的形成起着至关重要的作用[24]。采用HS-SPME-GC-MS对混菌发酵杨梅酒和纯种发酵杨梅酒进行挥发性风味物质测定,结果如表1所示。

表1 混菌发酵和纯种发酵杨梅酒中挥发性风味物质含量
Table 1 Comparisons of volatile flavor compounds of Chinese bayberry wines from pure and mixed-culture fermentations

序号 名称 保留时间/min质量浓度/(mg/L) 气味描述Io Sc 混菌酯类A1 乙酸乙酯 12.717 3.421a 0.366c 0.617b有醚似的气味,微带果香的酒香A2 二乙酸亚苯基乙酸酯 17.147 0.092a 0.082a 0.101a A3 丁酸乙酯 20.952 0.078a 0.062b 0.066b 果香,有菠萝的气息A4 2-甲基丁酸乙酯 22.883 0.029a 0.015b 0.015b 果香中含有甜香和青香,有苹果的味道A5 异戊酸乙酯 23.004 0.034a 0.015b 0.017b果香,有甜的苹果、菠萝的香气A6 乙酸异戊酯 24.050 0.225a 0.079c 0.108b 甜果香,有新鲜香蕉味A7 己酸乙酯 28.703 0.260a 0.128c 0.168b果香中含有甜香和青香及蜡香,有菠萝、香蕉的香气A8 3-己烯酸乙酯 29.207 0.113a 0.036b 0.028c 果香中含有甜香和青香,有菠萝的味道A9 庚酸乙酯 32.110 0.054a 0.028c 0.039b 果香,菠萝香A10 乙酸芳樟酯 32.498 0.031 nd nd 草药味中含有甜香和青香,香气似香柠檬和薰衣草A11 醋酸-2-乙基己酯 33.725 0.029 nd nd A12 苯甲酸甲酯 34.095 0.033a 0.027ab 0.024b具有花香,鹿蹄草和依兰树的香气A13 辛酸乙酯 35.287 2.059c 5.061a 3.778b蜡香,果香,甜香,有白兰地的酒香,并有杏仁、香蕉、梨香A14 丁二酸二乙酯 35.790 1.523a 1.274a nd 柔和的果香,成熟的苹果香A15 苯甲酸乙酯 36.394 0.451a 0.382ab 0.343b 薄荷香味及果香A16 反式-2-辛烯酸乙酯 37.262 0.041 nd nd 果香似梨皮及热带李子皮香,有蜡香及脂肪气息A17 壬二酸二乙酯 37.804 nd 0.063b 0.092a A18 壬酸乙酯 38.276 0.169a 0.104a 0.110a 蜡味,果味,玫瑰香味及朗姆酒似香气A19 3-壬烯酸乙酯 38.471 0.102a 0.041c 0.048b A20 苯乙酸乙酯 38.813 0.074a 0.046a 0.046a 玫瑰花香,蜂蜜甜香及香油味A21 乙酸-2-苯乙酯 39.223 0.189a 0.066c 0.079b 玫瑰花香,蜂蜜甜香,热带水果香A22 反式-4-癸烯酸乙酯 41.452 0.055b 0.074a nd 呈青香、果香和蜡香,有白兰地的香气A23 癸酸乙酯 41.608 1.041c 9.168a 6.390b 蜡香,有甜的苹果香气A24 3-苯丙酸乙酯 42.597 0.057a 0.054ab 0.048b 蜡香,有苹果、葡萄香,油脂味,白兰地的香气A25 辛酸异戊酯 43.692 0.045c 0.094a 0.067b 呈菠萝、椰子香A26 辛酸-2-甲基丁酯 43.850 nd 0.028a 0.018b A27 琥珀酸乙基异戊酯 44.415 nd 0.041a 0.045a A28 十一酸乙酯 45.879 0.061a 0.057a 0.047a 肥皂香,蜡香,脂肪味,椰子香,白兰地的香气A29 月桂酸乙酯 51.680 0.368c 2.291a 1.369b 蜡香,花香及清新的肥皂香A30 癸酸异戊酯 55.417 nd 0.150a 0.102b 蜡香,香甜的香蕉味,白兰地香,青香酯类合计 10.634 19.832 13.765醇类B1 2-甲基-1-丁醇 18.201 1.676a 2.726a 2.057a 焦味

续表1

注:nd.未检测到;所有结果表示为平均值(n=3);同行间不同字母表示差异显著(P<0.05);香气描述参考网址http://www.thegoodscentscompany.com/。

序号 名称 保留时间/min质量浓度/(mg/L) 气味描述Io Sc 混菌B2 正己醇 23.802 nd 0.057a 0.054a 草药味,甜香,青香B3 2-乙基己醇 29.831 nd 0.036b 0.062a 柠檬香味,花香B4 苯乙醇 35.060 3.032c 9.787b11.737a 玫瑰花香B5 4-萜烯醇 36.144 0.54a 0.426b 0.436b 有胡椒味,淡淡泥土香及陈腐的木香B6 10-(四氢-吡喃-2-氧基)-三环[4.2.1.1(2,5)]癸-9-醇 44.205 0.238a 0.205b 0.173c B7 喇叭茶醇 44.719 0.081a 0.070b 0.071b醇类合计 5.567 13.307 14.590酸类C1 乙酸 11.135 0.472 nd nd 酸味C2 异戊酸 21.724 0.081a 0.024b 0.023b 干酪味,酸臭味C3 2-甲基丁酸 22.154 0.041a 0.021a nd 酸味,辛辣味,干酪味C4 己酸 27.450 0.072a 0.014b 0.016b 脂肪味,酸臭味,干酪味C5 辛酸 34.278 0.062a 0.087a 0.067a 脂肪味,腐败味,干酪味,油脂味C6 正癸酸 40.556 nd 0.053 nd 脂肪味,腐败酸臭味酸类合计 0.728 0.199 0.106醛类D1 苯甲醛 29.702 nd 0.035b 0.048a有浓烈的樱桃香甜味和苦杏仁味D2 壬醛 32.797 nd 0.059 nd 玫瑰、柑橘的香气,且伴有脂肪的香味醛类合计 0 0.094 0.048酮类E1 苯乙酮 33.572 0.025a 0.020a 0.026a 花香,有山楂、杏仁的气味E2 2,5,9-三甲基环十二烷-4,8-二烯酮 55.184 0.133 nd nd酮类合计 0.158 0.020 0.026烯萜类F1 3-蒈烯 31.249 0.045a 0.027b 0.042ab 柑橘的甜香味及枞叶香F2 反式石竹烯 45.087 2.613a 1.529b 1.249c 甜香,木香,丁香似香味F3 γ-芹子烯 47.613 0.048b 0.048b 0.061a 木香烯萜类合计 2.706 1.604 1.352烃类G1 (2-甲基-1-丙烯基)苯 33.002 0.045a 0.028b 0.031b G2 (Z,Z,Z)-1,5,9,9-四甲基-1,4,7-环十一碳三烯 47.008 0.089a 0.072b 0.071b G3 邻伞花烃 30.338 0.056a 0.057a 0.067a G4 环癸烷 31.113 0.080a 0.057a 0.057a G5 1,3,8-对孟三烯 34.488 0.044a 0.044a 0.047a 药草香,木香G6 2-亚甲基-4,8,8-三甲基-4-乙烯基-双环[5.2.0]壬烷 42.318 0.180a 0.080b 0.075b烃类合计 0.494 0.338 0.348其他H1 2,3-环氧-4,4-二甲基戊烷 18.012 9.856a11.495a10.015a H2 1,1-二乙氧基乙烷 17.284 0.425a 0.156c 0.233b 蔬菜味的甜香,青香H3 2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊烷 17.627 0.175a 0.081b 0.099b其他合计 10.456 11.732 10.346

由表1可以看出,酵母菌纯种发酵及混合发酵的杨梅酒中共鉴定出59 种挥发性风味成分,包括酯类30 种、醇类7 种、酸类6 种、烯萜类3 种、醛类2 种、酮类2 种、烃类及其他类9 种;其中含量较高的是辛酸乙酯、癸酸乙酯、2-甲基-1-丁醇、苯乙醇、反式石竹烯和2,3-环氧-4,4-二甲基戊烷。以下从酯类、醇醛酮类及酸类挥发性风味物质解析不同发酵体系对杨梅酒香气形成的影响。

2.3.1 酯类物质

酒风味在很大程度上与酯类的组成及含量有关,酵母菌在乙醇发酵过程中通过酯酶或醇酰基转移酶的作用下可形成多种酯类[25],含量最丰富的为乙酸酯(乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸异丁酯和2-乙酸苯乙酯),其次为饱和脂肪酸乙酯(丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯)[19]。从实验结果得到,酒的风味在很大程度上与酯类的组成及含量有关,Io发酵产生10.634 mg/L的总酯,而Sc发酵产生酯类总质量浓度达19.832 mg/L,主要归因于癸酸乙酯的高产,而癸酸乙酯会赋予酒体果香和酒香及白兰地似的香韵。酿酒酵母细胞内的EHT1EEB1基因编码醇酰基转移酶,是酵母中链脂肪酸乙酯合成的关键基因,Sc纯种发酵中辛酸乙酯、癸酸乙酯等酯类含量较高可能与EHT1基因的过量表达有关[26-27]。除癸酸乙酯和辛酸乙酯外,月桂酸乙酯也是Sc产生的特征风味物质,质量浓度达到2.291 mg/L。相比Io发酵,混菌发酵使得癸酸乙酯、辛酸乙酯和月桂酸乙酯等含量显著提高,还产生了癸酸异戊酯,增加了酒体香气的复杂性。

30 种酯类物质中,乙酸芳樟酯、醋酸-2-乙基己酯、反式-2-辛烯酸乙酯为Io发酵产生的特有风味成分;而乙酸乙酯是Io的特征风味物质,其质量浓度高达3.421 mg/L,约为Sc发酵含量的10 倍。文献表明,乙酸乙酯的形成以乙醇为底物,而乙醇脱氢酶基因ADH1在乙醇发酵过程中将乙醛还原成乙醇,因此,Io对乙酸乙酯的合成能力与醇脱氢酶基因ADH1表达情况有关[26]。乙酸乙酯质量浓度在100 mg/L以下时会赋予酒体令人愉快的芳香气味,但如果质量浓度过大,会使酒出现指甲油的气味[28]。相比Sc纯种发酵,混菌发酵使得乙酸乙酯、丁酸乙酯、异戊酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、乙酸-2-苯乙酯和辛酸异戊酸等呈味物质含量有较大提高,使酒体口感丰满。酿酒酵母中编码醇酰基转移酶的ATF1ATF2表达量控制着乙酸酯类化合物在体内合成,其中ATF1基因作用优于ATF2基因[26]。Barbosa等[27]发现混菌发酵过程中,乙酸乙酯、乙酸异戊酯等乙酸酯类含量的增加与发酵过程中酿酒酵母ATF1的高表达有关。

2.3.2 醇、醛、酮类物质

高级醇是酵母菌乙醇发酵的副产物,高级醇合成主要是通过艾利希途径将氨基酸作为底物转氨脱羧再由醇脱氢酶还原而成如2-甲基-1-丁醇可由异亮氨酸转化而来的,此外,酵母也能从糖代谢的碳片段形成高级醇[29]。实验表明,纯种发酵和混菌发酵共检测出7 种高级醇,其中苯乙醇具有特殊的玫瑰香气和先苦后甜的桃味,相比纯种发酵,混菌发酵苯乙醇含量大量增加,达到11.737 mg/L,可能与ARO1ARO7ARO8等芳香族氨基酸合成相关基因的高表达有关[27]。此外,Sc合成高级醇的能力强于Io,可能是Sc具有较高的醇脱氢酶活力[30]。相比Io纯种发酵,混合发酵高级醇含量提高了162%,2-甲基-1-丁醇、正丁醇和2-乙基己醇等含量有所增加。可能原因是Io在发酵后期的自溶为Sc提供营养物质,或者Io具有某些酶活性,能够为Sc提供营养来源[31]如果胶酶、淀粉酶和木聚糖酶[32]。混合发酵得到的高级醇质量浓度在300 mg/L以下,能够赋予酒体芳香味[33]

另外,Io的存在使得发酵液中4-萜烯醇和苯乙酮含量增加,但值得注意的是在混菌发酵条件下,未检测到壬醛(具有强烈的脂肪气味)成分。

2.3.3 酸类及烯萜类物质

乙酸含量是影响发酵酒质量的一个重要因素,超过0.7 g/L会产生刺鼻气味和不良口感[19]。3 种发酵液中,乙酸为Io发酵液所特有,质量浓度较高,达到0.472 mg/L,也是以上结果分析中乙酸酯类含量较高的原因。乙酸的产生与维持细胞内氧化还原平衡密切相关[34],由此可解释高糖等高渗透胁迫发酵条件下乙酸产生的原因。而Sc纯种发酵液未能检测到乙酸,与Io纯种发酵相比,混菌发酵也降低了发酵过程中乙酸质量浓度。

己酸、辛酸、癸酸等中链脂肪酸(C6~C12)是酵母发酵过程中合成细胞膜所需长链脂肪酸的剩余片段,其积累对酵母的生长有毒性作用[19]。且己酸、辛酸和癸酸这3 种化合物会使酒体带有不愉快气味。其中,正癸酸是Sc发酵所特有的,正癸酸使得酒体有轻微腐臭味。混菌发酵后,正癸酸的含量降低至检出限以下,同样,混菌发酵使得己酸和辛酸含量也有所下降。

萜类化合物是自然界广泛存在的一大类异戊二烯衍生物,对人体具有较强的生理活性[35]。3 种发酵方式的杨梅酒中共检出3 种烯萜类化合物。Io纯种发酵产生的烯萜类物质质量浓度最高,达到2.706 mg/L;相比纯种发酵,混菌发酵后,除γ-芹子烯的含量稍有增加外,烯萜类物质总体含量减少。

2.4 杨梅酒挥发性风味成分主成分分析

表2 主成分特征值及其贡献率
Table 2 Eigenvalues of principal components and their contribution to total variance

主成分 特征值 贡献率/% 累计贡献率/%1 41.353 70.090 70.090 2 8.289 14.049 84.140

由表2可知,第1主成分贡献率为70.090%,第2主成分贡献率为14.049%,2 个成分的累计贡献率达到80%,所以2 个主成分能够有效解释变量信息。

由图3a可知,第1主成分与乙酸乙酯等重要酯类、乙酸及反式石竹烯呈显著正相关,与辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、苯乙醇、苯甲醛等呈显著负相关;第2主成分与反式-4-癸烯酸乙酯、正癸酸、壬醛呈正相关,与γ-芹子烯呈负相关。

由图3b可知,3 种发酵杨梅酒分别位于不同象限可以反映出三者的整体风味有较大差异。Io发酵酒在第1主成分上的得分较高,说明Io发酵酒乙酸乙酯、乙酸及反式石竹烯含量较高;Sc发酵酒在第2主成分上的得分较高,说明反式-4-癸烯酸乙酯、正癸酸、壬醛含量相对较高。而Sc发酵酒和混菌发酵酒在第1主成分上的得分接近可知两者在风味成分上相似度高,可能由于Io在发酵早期因为乙醇毒性等原因而消亡,而后起主导作用的Sc有效地影响混合发酵生产的杨梅酒香气特征。

图3 混菌发酵和纯种发酵杨梅酒中挥发性风味物质的主成分分析图
Fig. 3 Principal component analysis score and loading plots of the volatile aroma compounds produced from pure and mixed-culture fermentations

2.5 整体感官评价分析

通过对不同发酵方式下杨梅酒风味的感官评定,得出杨梅酒的主要香型为果香、甜香、酸味、乙醇味、涩味和酵母味,如图4所示。除乙醇味以外,果香和酸味是Io发酵酒最主要的风味,而酯类和酸类分别是贡献果香和酸味的主要物质。不同的酯类物质在香气感知时相互之间具有累加效应,杨梅酒的果香来自于混合酯类的作用,但是果香感知的强度并不与总酯类含量呈正比,而与其间特殊的比例相关[36],这也就解释了虽然Sc产酯量最高,但是发酵液中果香味较弱的原因。不同的乙醇发酵过程中产生的一些杂醇类和直链脂肪酸如2-甲基丁醇、辛酸和正癸酸,赋予了Sc发酵酒特有的酵母味,这与定量结果一致。与Sc纯种发酵相比,混菌发酵提高了杨梅酒的果味强度,降低了发酵产生的酵母味和癸酸乙酯等带来的涩味。

图4 不同发酵方式下杨梅酒的感官评定雷达图
Fig. 4 Radar plots depicting the flavor profiles of Chinese bayberry wines produced by different fermentation methods

3 结 论

选用Io与Sc以10∶1的接种比例进行杨梅酒的混合发酵。混菌发酵增加了商业化酿酒酵母的发酵速率,使主发酵提早3 d完成。通过HS-SPME-GC-MS分析杨梅酒共检测到59 种挥发性风味成分,其中含量较高的成分是辛酸乙酯、癸酸乙酯、2-甲基-1-丁醇、苯乙醇、反式石竹烯和2,3-环氧-4,4-二甲基戊烷。混菌发酵与Sc纯种发酵相似度高,但减少了Sc发酵产生的辛酸及正癸酸这2 种不良气味,也降低了Io产生的乙酸质量浓度;Io的参与使混菌发酵液中丁酸乙酯、异戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、壬酸乙酯、3-壬烯酸乙酯等乙酯类和乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸-2-苯乙酯等乙酸酯类含量分别提高了18.52%和57.34%,增加了杨梅酒的果香味。不同菌种发酵杨梅酒口味之间有显著差异,果香和酸味是Io发酵酒最主要的风味,而Sc发酵酒有特有的酵母味,混菌发酵提高了杨梅酒的果味强度,降低了发酵产生的酵母味和癸酸乙酯等带来的涩味。

参考文献:

[1] 洪翌翎, 范丽. 国内杨梅酒生产工艺研究进展[J]. 农产品加工, 2016,5(9): 65-66. DOI:10.16693/j.cnki.1671-9646(X).2016.05.020.

[2] XU Y X, ZHANG M, FANG Z X, et al. How to improve bayberry(Myrica rubra Sieb. et Zucc.) juice flavour quality: effect of juice processing and storage on volatile compounds[J]. Food Chemistry,2014, 151(4): 40-46. DOI:10.1016/j.foodchem.2013.10.118.

[3] 陈静, 程晓雨, 潘明, 等. 中国果酒生产技术研究现状及其产业未来发展趋势[J]. 食品工业科技, 2017, 38(2): 383-389. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.066.

[4] 蒋本庆, 高铭坤. 果酒的保健功效及蓝莓果酒发展分析研究[J].酿酒, 2015, 42(2): 115-118.

[5] 杜晶, 余培斌, 苏琪, 等. 杨梅果酒酿造酵母的筛选、鉴定及耐受性研究[J]. 食品与发酵工业, 2015, 41(9): 34-39. DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201509007.

[6] DU J, HAN F, YU P, et al. Optimization of fermentation conditions for chinese bayberry wine by response surface methodology and its qualities[J]. Journal of the Institute of Brewing, 2016, 122(4): 1-9.DOI:10.1002/jib.384.

[7] JOLLY N P, AUGUSTYN O P H, PRETORIUS I S. The role and use of non-Saccharomyces yeasts in wine production[J]. South African Journal of Enology and Viticulture, 2017, 27(10): 15-39.DOI:10.21548/27-1-1475.

[8] AVICOR M N, SAALIA F K, DJAMEH C, et al. The fermentation characteristics of single and mixed yeast cultures during pito wort fermentation[J]. International Food Research Journal, 2015, 22(1):102-109.

[9] 钟瑞敏, 曾彬. 半干红杨梅果酒复合酵母菌发酵工艺[J]. 食品工业科技, 2003, 24(4): 55-57.

[10] 贾言言, 刘四新, 李卓婷, 等. 非酵母属酵母的接种顺序对混合发酵菠萝酒香气成分的影响[J]. 食品科学, 2015, 36(17): 152-157.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201517029.

[11] LIU P T, LU L, DUAN C Q, et al. The contribution of indigenous non-Saccharomyces, wine yeast to improved aromatic quality of Cabernet Sauvignon wines by spontaneous fermentation[J]. LWT-Food Science and Technology, 2016, 71: 356-363. DOI:10.1016/j.lwt.2016.04.031.

[12] GOBBI M, COMITINI F, DOMIZIO P, et al. Lachancea thermotolerans and Saccharomyces cerevisiae in simultaneous and sequential co-fermentation: a strategy to enhance acidity and improve the overall quality of wine[J]. Food Microbiology, 2013, 33(2): 271-281. DOI:10.1016/j.fm.2012.10.004.

[13] SATORA P, SEMIK-SZCZURAK D, TARKO T, et al. Influence of selected Saccharomyces and Schizosaccharomyces strains and their mixed cultures on chemical composition of apple wines[J]. Journal of Food Science, 2018, 83(12): 1-8. DOI:10.1111/1750-3841.14042.

[14] 崔艳, 刘金福. 非酿酒酵母在葡萄酒酿造中应用的研究现状[J].中国酿造, 2010, 29(11): 13-16.

[15] 赵洁. 杨梅原汁味觉特性研究[D]. 上海: 上海应用技术学院, 2015:17-18.

[16] NEGI B, DEY G. Effects of co-fermentation by Saccharomyces cerevisiae and Issatchenkia orientalis on sea buckthorn juice[J].International Journal of Food Sciences and Nutrition, 2013, 64(4):508-513.

[17] KIM D H, HONG Y A, PARK H D. Co-fermentation of grape must by Issatchenkia orientalis and Saccharomyces cerevisiae reduces the malic acid content in wine[J]. Biotechnology Letters, 2008, 30(9):1633-1638. DOI:10.1007/s10529-008-9726-1.

[18] 武平, 赵文婧, 徐晓娇, 等. 测定葡萄酒中总糖方法的探讨[J]. 中国酿造, 2011, 30(1): 163-165.

[19] MAINS A O. Evaluating the impact of yeast co-inoculation on individual yeast metabolism and wine composition[D]. Stellenbosch:Stellenbosch University, 2014: 19.

[20] MIAO Y J, XIONG G T, LI R Y, et al. Transcriptome profiling of Issatchenkia orientalis under ethanol stress[J]. AMB Express, 2018,8(1): 1-12. DOI:10.1186/s13568-018-0568-5.

[21] 刘茜, 吴祖芳, 翁佩芳, 等. 酵母菌混合培养氨基酸代谢差异性及对菌株生长的影响[J]. 中国食品学报, 2018, 18(6): 76-82.DOI:10.16429/j.1009-7848.2018.06.011.

[22] RENAULT P E, ALBERTIN W, BELY M. An innovative tool reveals interaction mechanisms among yeast populations under oenological conditions[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2013, 97(9):4105-4119. DOI:10.1007/s00253-012-4660-5.

[23] 宋兴兴. 猕猴桃白兰地的发酵工艺研究[D]. 重庆: 重庆大学, 2014:30-31.

[24] 侯敏. 沙城产区赤霞珠干红葡萄酒特征香气的研究[D]. 杨凌: 西北农林科技大学, 2011: 4-6.

[25] 陈玉香. 红曲黄酒中酵母产特征酯类物质合成机理研究[D]. 福州:福州大学, 2014: 6-7.

[26] 庄世文, 付俊淑, 黄金海. 酵母菌合成酯类化合物关键酶基因的研究进展[J]. 食品工业科技, 2012, 33(2): 433-436.

[27] BARBOSA C, MENDES-FAIA A, LAGE P, et al. Genomic expression program of Saccharomyces cerevisiae along a mixed-culture wine fermentation with Hanseniaspora guilliermondii[J]. Microbial Cell Factories, 2015, 14(1): 124. DOI:10.1186/s12934-015-0318-1.

[28] SUMBY K M, GRBIN P R, JIRANEK V. Microbial modulation of aromatic esters in wine: current knowledge and future prospects[J]. Food Chemistry, 2010, 121(1): 1-16. DOI:10.1016/j.foodchem.2009.12.004.

[29] 魏运平. 低产高级醇猕猴桃酒酵母菌株的筛选[D]. 无锡: 江南大学,2004: 3-4.

[30] SINGH R, KUNKEE R E. Alcohol dehydrogenase activities of wine yeasts in relation to higher alcohol formation[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1976, 32(5): 666-670.

[31] 唐洁, 王海燕, 徐岩. 酿酒酵母和异常毕赤酵母混菌发酵对白酒液态发酵效率和风味物质的影响[J]. 微生物学通报, 2012,39(7): 921-930.

[32] MATURANO Y P, ASSOF M, FABANI M P, et al. Enzymatic activities produced by mixed Saccharomyces and non-Saccharomyces cultures: relationship with wine volatile composition[J]. Antonie Van Leeuwenhoek, 2015, 108(5): 1239-1256. DOI:10.1007/s10482-015-0578-0.

[33] SABERI S, CLIFF M A, VUUREN H J J V. Impact of mixed S.cerevisiae strains on the production of volatiles and estimated sensory profiles of Chardonnay wines[J]. Food Research International, 2012,48(2): 725-735. DOI:10.1016/j.foodres.2012.06.012.

[34] MORALES P, ROJAS V, QUIRÓS M, et al. The impact of oxygen on the final alcohol content of wine fermented by a mixed starter culture[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2015, 99(9):3993-4003. DOI:10.1007/s00253-014-6321-3.

[35] 孙丽超, 李淑英, 王凤忠, 等. 萜类化合物的合成生物学研究进展[J]. 生物技术通报, 2017, 33(1): 64-75. DOI:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.01.007.

[36] 郝瑞颖, 王肇悦, 张博润, 等. 葡萄酒中酿酒酵母产生的重要香气化合物及其代谢调控[J]. 中国食品学报, 2012, 12(11): 121-127.

Fermentation Efficiency and Flavor Characteristics of Bayberry Wine with Mixed Starter Culture of Issatchenkio orientalisandSaccharomyces cerevisiae

ZHANG Wenwen, WENG Peifang*, WU Zufang
(College of Food and Pharmaceutical Sciences, Ningbo University, Ningbo 315800, China)

Abstract: In this paper,Issatchenkio orientalis (Io) andSaccharomyces cerevisiae (Sc) were used in combination to ferment Chinese bayberry juice. The fermentation period was determined and the volatile flavor compounds of the wine were compared. The results showed that the fermentation efficiency of the mixed starter culture was higher than that ofSc alone,and the primary fermentation was completed 3 days earlier. The types of volatile flavor compounds from the mixed starter culture were similar to those from pureSc, but the concentrations of the unpleasant odorants octanoic acid and decanoic acid produced byScwere reduced by 0.020 and 0.053 mg/L, respectively. The concentration of acetic acid produced byIo was also reduced. The concentrations of ethyl eaters (ethyl butyrate, ethyl isovalerate, ethyl hexanoate, ethyl heptanoate, ethyl nonanate, 3-nonenoic acid ethyl ester) and acetates (ethyl acetate, isomyl acetate and phenethyl acetate) in wine fermented withSc-Io were increased by 18.52% and 57.34%, respectively compared to wine fermented withSc alone, which enhanced the fruity flavor. Moreover, mixed-culture fermentation reduced the yeast flavor and the astringency of ethyl caprate produced bySc, and gave a pleasant taste.

Keywords: Issatchenkio orientalisSaccharomyces cerevisiae; fermentation efficiency; flavor; Chinese bayberry wine

收稿日期:2018-08-31

基金项目:浙江省基础公益研究计划项目(LGN18C200018);国家自然科学基金面上项目(31471709);宁波大学大学生科研创新计划项目(2018SRIP1812)

第一作者简介:张文文(1994—)(ORCID: 0000-0002-2480-3778),女,硕士研究生,主要从事食品生物技术研究。E-mail: 327342468@qq.com

*通信作者简介:翁佩芳(1963—)(ORCID: 0000-0003-1988-2915),女,教授,学士,主要从事食品生物技术研究。E-mail: wzfwpf@163.com

DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180831-375

中图分类号:TS261.1

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2019)18-0144-08

引文格式:张文文, 翁佩芳, 吴祖芳. 东方伊萨酵母和酿酒酵母混合发酵杨梅酒的发酵效率及风味特征分析[J]. 食品科学, 2019,40(18): 144-151. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180831-375. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Wenwen, WENG Peifang, WU Zufang. Fermentation efficiency and flavor characteristics of bayberry wine with mixed starter culture ofIssatchenkio orientalis andSaccharomyces cerevisiae[J]. Food Science, 2019, 40(18): 144-151.(in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180831-375. http://www.spkx.net.cn